EMOGLOBINA E MIOGLOBINA

EMOGLOBINA E MIOGLOBINA Emoglobina e Mioglobina sono proteine globulari in grado di legare l ossigeno molecolare. Queste due proteine si differenziano tra loro per le funzioni e per le caratteristiche chimico-fisiche che mostrano nei confronti dell O 2 che le differenziano significativamente. L emoglobina (Hb) è una proteina in grado di legare molecole di O 2 (quattro in tutto) a livello polmonare e di trasportarla nel sangue fino ai tessuti ed alle cellule che si trovano ad immediato contatto del letto capillare del sistema vascolare. Al contrario è in grado di trasportare dai tessuti ed organi periferici fino ai polmoni, CO 2 e protoni (H + ) La mioglobina (Mb) è una proteina capace di legare o liberare O 2 a seconda della sua concentrazione nel citoplasma delle cellule muscolari; essa presenta una catena polipeptidica ed un sito di legame per l ossigeno, al contrario dell emoglobina, costituita da quattro catene globiniche, contenente ognuna un sito di legame per l O 2 ed a due a due uguali. L emoglobina HbA 1 è la forma maggiormente rappresentata nell uomo (circa il 98%) ed è costituita da due catene globiniche α, di 141 residui aminoacidici ciascuno e due β costituite da 146 residui. E anche presente l HbA 2 (circa il 3%) in cui le due catene β sono sostituite da due catene δ. Emoglobine umane e loro subunità Fonte principale Simbolo Subunità Adulto Hb A 1 α 2 β 2 Adulto HbA 2 α 2 δ 2 Fetale HbF α 2 γ 2 Embrionale (stato fetale precoce) HbGower-2 α 2 ε 2 Sia le quattro catene globiniche dell emoglobina che quelle della mioglobina contengono un gruppo prostetico in grado di legare una molecola di O 2 (gruppo Eme). L eme ha una struttura porfirinica contenente un atomo di ferro centrale. Questa porfirina (protoporfirina IX) contiene otto catene laterali e più precisamente.

O - due residui di acido propionico X - quattro gruppi metilici legati agli anelli pirrolici + - due gruppi vinilici L atomo di ferro presente nell eme presenta un numero di ossidazione 2 + ed è in grado di formare 5 o 6 legami di coordinazione. Quattro legami di coordinazione sono formati con i quattro atomi di azoto degli anelli pirrolici della protoporfirina e giacciono sullo stesso piano degli anelli pirrolici quando l Hb è ossigenata, mentre quando l O 2 è assente il ferro si trova ad una distanza dal piano di 0.6 Å. Il quinto legame di coordinazione lo ione Fe 2+ lo forma con un atomo di azoto presente nell anello imidazolico di un residuo di istidina (istidina distale F8) della catena polipeptidica.

Il sesto legame può essere libero o impegnare il ferro con la molecola di ossigeno. Questi due ultimi legami sono perpendicolari al piano dell anello tetrapirrolico dell eme. Quando l ossigeno è legato allo ione Fe 2+ si verrà a trovare in prossimità dell anello imidazolico di un secondo residuo di istidina della catena polipeptidica (istidina distale E7). Quando l eme non è legato a proteine, la reazione dell ossigeno con uno dei due siti di coordinazione del ferro (perpendicolari al piano dell anello porfirinico) genera l ossidazione irreversibile del Fe 2+ a Fe 3+. Quando l eme è inserito in una proteina, questa reazione non avviene in quanto il gruppo eme è immerso in profondità nella struttura proteica è l accessibilità ai siti di coordinazione è limitata. L importanza dell impedimento sterico presentato dall ambiente in cui si trova il sito di legame dell eme, sia nell emoglobina che nella mioglobina, è dimostrata dall affinità di queste due proteine per il monossido di carbonio, che compete con l ossigeno per tale sito. In soluzione acquosa l affinità del monossido di carbonio per l eme libero è circa 25.000 volte maggiore di quella dell ossigeno, mentre l affinità del CO nei confronti dell eme legato alla proteina è solo 250 volte superiore a quella dell ossigeno. Questo a causa dell impedimento sterico determinato dall istidina E7 (Figura (b), che causa un inclinazione nella conformazione del complesso globina-

CO con conseguente riduzione dell affinità di legame. Anche il monossido di azoto (nitric oxide) (NO), si può coordinare al ferro dell eme con una affinità anche in questo caso superiore a quella dell ossigeno. Quando si lega l ossigeno, le proprietà elettroniche del ferro si modificano; ciò spiega il diverso colore che ha il sangue venoso povero di ossigeno (rosso scuro) rispetto al sangue arterioso ricco di ossigeno (rosso brillante). Il gruppo eme si trova alloggiato all interno di una tasca idrofobica formata dal ripiegamento di ciascuna catena polipeptidica all interno del quale le catene laterali di circa 18 aminoiacidi stabiliscono all incirca ottanta interazioni non covalenti con gli atomi di carbonio dell eme. Le due catene di acido propionico sono invece stabilizzate dalla interazione con la catena laterale priva di carica di un residuo di istidina e con molecole d acqua, entrambe presenti sulla superficie esterna dellamolecola. La diffrazione ai raggi X ha mostrato che le catene globiniche dell emoglobina cosi come quelle della mioglobina si presentano costituite da numerose regioni ad α-elica interrotte per la presenza di residui di prolina, che permettono il ripiegamento della catena a cui si accompagna spesso una inversione della direzione della stessa catena. Questo tipo di andamento fa assumere a queste catene globiniche una struttura grossolanamente sferoidale. Le catene a sono caratterizzate da sette zone ad α-elica, mentre le β da otto. Lo studio delle sequenze aminoacidiche delle catene globiniche di diverse specie animali ha evidenziato una notevole variabilità anche se la variazione nella composizione aminoacidici è tale da permettere sempre le interazioni apolari ed a idrogeno con i residui che si trovano sulla superficie delle altre unità globiniche.

Si assiste, invece, alla costante presenza dei due residui di istidina prossimale e distale e degli altri residui presenti nella tasca idrofobica, dove si posizione l eme, necessari per la stabilizzazione del gruppo prostetico con la proteina. Questo permette alle catene globiniche di conservare una struttura secondaria e terziaria simile, anche se piccole variazioni in punti specifici della loro struttura comportano delle differenze significative nelle proprietà delle catene come ad esempio avviene tra le catene α, β, γ, δ. Esiste una notevole somiglianza tra la struttura della catena globinica della mioglobina (A) e la subunità β dell emoglobina (B). Queste, infatti, si differenziano soltanto per la disposizione del residuo carbossilico e amminico terminale. Il posizionamento verso l esterno di tali gruppi, nella catena β dell emoglobina permetterà l interazione tra le due catene beta.

La funzione fisiologica della mioglobina e della emoglobina dipende dalla reversibilità del legame fra ossigeno e gruppo eme, processo il cui andamento è descritto dalle curve di saturazione con l O 2. Figura: Rappresentazione in grafico del legame di un ligando. La frazione di siti di legame occupata dal ligando, θ, è messa in grafico in funzione della concentrazione di ligando libero. Entrambe le curve sono iperboli rettangolari. (a) Una curva di legame ipotetica del ligando L. La [L] a cui metà dei siti totali sono occupati corrisponde a 1/Ka, oppure a Kd,. La curva ha un asintoto orizzontale quando θ = 1 e un asintoto verticale (non mostrato) quando [L] = - l/ka. (b) Curva di legame dell'ossigeno alla mioglobina: la pressione parziale di ossigeno presente nell'aria in contatto con la soluzione è espressa in kilopascal (kpa). L'ossigeno si lega saldamente alla mioglobina con una P 50 di soli 2,6 kpa. In genere, il legame reversibile di un ligando (L) a una proteina (P) può essere descritto dall'espressione all'equilibrio: P+L PL

La costante di equilibrio, Ka, di questa reazione è [PL] Ka = (1) [P] [L] II termine Ka è la costante di associazione (da non confondere con la Ka che indica la costante di dissociazione di un acido). La costante di associazione è una misura dell'affinità del ligando L per la proteina P. Ka ha come unità M -l ; un valore di Ka elevato corrisponde a un'elevata affinità del ligando per la proteina. Un riarrangiamento dell'equazione 1 mostra che il rapporto tra proteina con il ligando legato e proteina libera è direttamente proporzionale alla concentrazione del ligando libero: [PL] Ka [L] = (2) [P] Quando la concentrazione del ligando è molto più alta della concentrazione dei suoi siti di legame sulla proteina, il legame del ligando alla proteina non modifica in modo apprezzabile la concentrazione del ligando libero (non legato), cioè [L] resta costante. Questa condizione è applicabile a molti ligandi che si associano a proteine nelle cellule e semplifica la nostra descrizione dell'equilibrio di legame. Consideriamo l'equilibrio di legame mettendo in rapporto i siti di legame occupati con i siti di legame presenti nella proteina, θ (theta): siti di legame occupati [PL] θ = = (3) totale dei siti di legame [PL] + [P] Sostituendo il termine Ka [L][P] a [PL] (Equaz. 2) e riarrangiando i termini, si ha Ka [L][P] Ka [L] [PL] [L] θ = = = (4) Ka [L][P] + [P] Ka [L] + l [L] + 1/Ka II termine Ka può essere determinato dal grafico di θ in funzione della concentrazione del ligando libero [L] (Figura). Qualsiasi equazione nella forma di x = y (y + z) descrive un'iperbole e quindi θ è una funzione iperbolica di [L]. La frazione di siti che legano il ligando occupata tende ad arrivare asintoticamente a saturazione quando [L] aumenta. Il valore di [L] a cui metà dei siti di legame sono occupati dalligando (a θ =

0,5) corrisponde a l/ka. Qualche volta è intuitivamente più semplice considerare la costante di dissociazione, Kd, cioè il reciproco di Ka (Kd = 1/Ka), espressa in unità di concentrazione molare (M). Kd è la costante di equilibrio della reazione di rilascio del ligando. [L] [PL] Kd = (5) [PL] [P] [L] [PL] = (6) Kd [L] θ = (7) [L] + Kd Quando [L] è uguale a kd metà dei siti di legame sono occupati dal ligando. Quando [L] è minore di Kd, la quantità di ligando legata alla proteina è piccola. Perché il 90% dei siti di legame siano occupati, il valore di [L] deve essere nove volte più alto di quello di Kd. In pratica, il termine Kd viene usato molto più spesso di Ka per esprimere l'affinità di una proteina per il suo ligando. Notate che un valore molto basso di Kd corrisponde a un'elevata affinità della proteina per il ligando. La matematica può ridurre questo concetto a una semplice asserzione: Kd corrisponde alla concentrazione di ligando a cui metà dei siti di legame disponibili sono occupati dal ligando. A questo punto la proteina ha raggiunto metà della saturazione rispetto ai siti di legame. Quanto più saldamente la proteina lega il ligando, tanto più bassa è la concentrazione di ligando necessaria a occupare metà dei siti di legame e minore è il valore di Kd. Il legame dell'ossigeno alla mioglobina ha un andamento simile a quello discusso prima; essendo l'ossigeno un gas, bisogna effettuare alcune variazioni nell'equazione. Dobbiamo semplicemente sostituire la concentrazione di ossigeno disciolta a [L] nell'equazione 7: [O 2 ] θ = (8) [O 2 ] + Kd Come accade per ogni ligando, Kd corrisponde alla [O 2 ] a cui metà dei siti disponibili sono

occupati e quindi è uguale a [O 2 ] 0,5. L'Equazione 8 diventa: [O 2 ] θ = (9) [O 2 ] + [O 2 ] 0,5 La concentrazione di una sostanza volatile in una soluzione è sempre proporzionale alla sua pressione parziale nella fase gassosa in equilibrio con la soluzione. Negli esperimenti in cui viene usato ossigeno come ligando, è la pressione parziale di questo gas, po 2, che viene variata, in quanto è molto più facile misurare quest'ultima che non la concentrazione del gas disciolta nella soluzione. Se definiamo la pressione parziale di ossigeno [O 2 ] 0,5 come P 50, sostituendo nell'equazione 9 otteniamo po 2 θ = (9) po 2 + P 50 Nel caso in cui una proteina leghi più di una molecola di ligando come nel caso dell emoglobina L equazione (9) diventerà: [po 2 ] n θ = (10) P 50 + [po 2 ] n Questa equazione rappresenta la forma non linearizzata della equazione di Hill ed n rappresenta

il coefficiente di Hill. Se il valore di n risulta diverso da 1, la proteina legante o l enzima presenterà fenomeni cooperativi.. In particolare per n<1 saranno presenti fenomeni cooperativi negativi, mentre per n>1 la proteina presenterà fenomeni cooperativi positivi. Non essendo possibile calcolare dall equazione (10), se non con l ausilio di un calcolatore, il valore di n viene utilizzato la sua forma linearizzata. Forma linearizzata dell equazione di Hill Keq [Hb]+nO 2 Hb(O 2 )n v f = K 1 [Hb(O 2 ) n ] (1); v r =K -1 [Hb]*[O 2 ] n (2) [Hb] = [Hb t ]-[Hb(O 2 ) n ] (3) quando [Hb t ] = [Hb(O 2 ) n ] tutta l emoglobina sarà saturata ed avremo che: v f = K 1 [Hb(O 2 ) n ] sarà uguale a Vmax = K 1 [Hb t ] ponendo Vmax (100% di saturazione) uguale ad 1 avremo: 1 = K 1 [Hb t ] (4) se moltiplichiamo tutti i membri dell eq. (3) per K 1 otteremo: K 1 [Hb] = K 1 [Hb t ] - K 1 [Hb(O 2 ) n ] (5) e sostituendo i termini comuni con la (1) e al (2) otterremo: K 1 [Hb] = Vmax-v ovvero: K 1 [Hb] = 1-y dividiamo ambo i membri per l eq. (1) K 1 [Hb] 1 - y = (10) K 1 [Hb(O 2 ) n ] v Se applichiamo la legge di azione di massa all equilibrio di saturazione dell Hb avremo: [Hb] [O 2 ] n Keq = [Hb(O 2 ) n ] riarrangiando l eq. precedente questa diventerà:

[Hb] Keq = [Hb(O 2 ) n ] [O 2 ] n sostituendo nella (10) e facendo il reciproco otterremo: v [O 2 ] n y [po 2 ] n = ovvero = 1 - y Keq 1 - y P 50 questa espressa in forma logaritmica diventerà: y Log = nlog [po 2 ] n Log P 50 1 - y La presenza nell emoglobina di quattro subunità non differenzia questa proteina dalla

mioglobina soltanto per il numero di molecole di O 2 legate ma anche per la presenza di fenomeni cooperativi positivi. Tutto ciò comporterà che il legarsi della prima molecola di O 2 alla emoglobina renderà più semplice il legarsi delle successive alle altre subunità dell Hb, cosi come il distacco della prima molecola di O 2 comporterà un aumento nella velocità di rilascio delle successive. La presenza di fenomeni cooperativi ha un preciso significato e svolge un ruolo significativo nel regolare l attività n h R x Osservazioni 0,5 6560 0,6 1520 Cooperatività 0,7 533 negativa da 0,8 243 substrato 0,9 132 1,0 81,0 Assenza di cooperatività 1,5 18,7 2,0 9,0 2,8 4,8 Cooperatività 3,5 3,5 positiva da 6,0 2,1 substrato 10,0 1,6 20,0 1,3 metabolica della proteina. Infatti, come mostrato in tabella, dalla valutazione dell indice di cooperatività (R x ) si evince come una variazione di 4,8 volte la po 2 sia in grado di far passare lo stato di saturazione dell Hb dal 10% al 90% mentre per la Mb (coeff. di Hill 1) sia necessario un incremento di 81 volte. Da quanto detto si evince come la velocità di saturazione e di desaturazione sia accelerata dalla presenza di fenomeni di cooperatività positiva. Al contrario, fenomeni di cooperatività negativa decrementano la velocità di saturazione all aumentare della concentrazione del ligando. Il legarsi dell ossigeno all emoglobina è regolato non solo dalla cooperatività, ma anche da

interazioni allosteriche (dal greco allos, altro; steros, spazio). Si tratta di interazioni che hanno luogo quando una particolare molecola, di piccole dimenzioni, si unisce a una proteina, modulandone l attività. Tali molecole sono chiamate effettori allosterici e possono essere classificate come attivatori o come inibitori, a seconda della loro influenza sulla funzionalità della proteina a cui si legano. La proteina la cui attività è modulata da un effettore allosterico viene definita proteina allosterica. L effettore allosterico non deve essere considerato come un interruttore che accende o spegne l attività della proteina ma piuttosto come un potenziometro in grado di regolarne l attività. Verranno ora presi in esame due modelli per le interazioni allosteriche: un modello concertato (Monod-Wyman-Changeux) e uno sequenziale (Koshland, Nèmethy e Filmer). In seguito si cercherà di chiarire la base molecolare delle interazioni allosteriche che regolano il legarsi dell ossigeno alle quattro subunità dell emoglobina.

Un modello concertato dell interazione allosterica: il modello di Monod-Wyman- Changeux L'emoglobina è un tipico esempio di proteina allosterici; pertanto, ogni teoria proposta per spiegare il comportamento delle proteine allosteriche deve essere applicabile anche ad essa. Negli anni sessanta, J. Monod, J. Wyman e J.P. Changeux hanno presentato un modello di cinetica enzimatica che riusciva a spiegare la curva di saturazione con l'ossigeno dell'emoglobina e di altre proteine oligomere con caratteristiche analoghe per quanta riguarda il legame del ligando. Questo modello si basa sulle seguenti ipotesi: 1. Le proteine allosteriche sono oligomeri Ie cui subunita occupano posizioni equivalenti nella struttura. 2. Ogni subunità possiede uno specifico sito di legame per ciascuno dei possibili ligandi. Poichè le subunità occupano posizioni equivalenti, i ligandi occupano anch'essi posizioni equivalenti. 3. Ciascuna subunità e limitata nella sua conformazione dal fatto di essere associata alle altre subunità dell'oligomero. 4. L'oligomero puo esistere in due diverse conformazioni: uno stato teso, o rigido, T, che ha un'affinità minore per il substrato, e uno stato rilassato, R. I due stati T e R sono in una situazione di equilibrio, regolata dalla costante allosterica L: L R T; L = T/R La figura mostra l'effetto di differenti valori di L sulla frazione di saturazione (Y) di una proteina allosterica con il suo ligando primario.

Un inibitore allosterico sposta l'equilibrio tra le conformazioni R e T verso la forma T, facendo cosi aumentare il valore di L. Un attivatore allosterico, al contrario, sposta l'equilibrio verso la conformazione R, facendo diminuire L e aumentare la frazione di saturazione della proteina per una data concentrazione di ligando. 5. Quando un ligando si unisce allo stato T, ha luogo un cambiamento conformazionale concertato che provoca il passaggio allo stato R. Questo cambiamento conformazionale, a volte detto anche transizione allosterica, coinvolge tutte le subunità della proteina. Cioè, il modello di Monod-Wyman-Changeux ipotizza che non siano possibili conformazioni intermedie in cui alcune subunità siano R e altre T (figura), ed è per questo che esso viene anche chiamato modello concertato per le proteine allosteriche. Il ligando primario di una proteina allosterica (per l'emoglobina, l'ossigeno) può unirsi all'una o all'altra delle due conformazioni T e R. Il modello di Monod-Wyman-Changeux ipotizza che l'affinità di una subunità per un certo ligando dipenda solo dalla particolare conformazione di quella subunità e non dall'eventuale occupazione dei siti di legame nelle altre subunità. Di conseguenza, sono necessarie solo due costanti di dissociazione per specificare l'interazione tra un ligando e una proteina allosterica: una costante, K T relativa alla dissociazione dei ligandi (S) dallo state T, e una costante, K R, relativa alla dissociazione dei ligandi S dallo stato R:

Nel caso dell'emoglobina le due costanti di dissociazione sono molto diverse: l'ossigeno si lega, infatti, in modo preferenziale alla conformazione R. Analogamente, in quasi tutte le proteine allosteriche, una delle due conformazioni ha un affinità per il ligando primario superiore a quella dell'altra conformazione. Il modello sequenziale dell'interazione allosterica ipotizza l'esistenza di conformazioni intermedie II modello concertato è piuttosto restrittivo poiché consente solo due stati conformazionali per ogni proteina. Questa limitazione non esiste in un modello alternativo, proposto per la prima volta nel 1925 da G. S. Adair e successivamente sviluppato da D. E. Koshland, G. Nemethy e D. Filmer. Il modello sequenziale dell'interazione allosterica prevede una serie di cambiamenti nelle conformazioni delle subunità. Cioè, nel corso della transizione dallo stato tutto-t a quello tutto-r possono formarsi conformazioni intermedie, in cui alcune subunità sono nello stato T e altre sono nello stato R (figura).

Il modello sequenziale si fonda su tre ipotesi: 1. In assenza di ligandi la proteina esiste in una sola conformazione. 2. L'unione di un ligando a una subunità induce in questa un cambiamento conformazionale. 3. II cambiamento conformazionale influisce sull'affinità delle subunità adiacenti per i ligandi. Si può fare un'analogia tra la transizione allosterica di un oligomero e una fila di birilli che cadono: secondo il modello concertato essi cadono tutti in una volta; secondo il modello sequenziale cadono in rapida successione. II modello sequenziale, che ipotizza l'esistenza di molti più stati conformazionali di quelli previsti dal modello concertato, simula meglio la realtà, ma è concettualmente più complesso. Per entrambi i modelli di transizione allosterica, la curva della frazione di saturazione in funzione della concentrazione del ligando è una sigmoide. In alcuni casi è però possibile fare una scelta tra i due modelli grazie ad una ben precisa differenza. Nel modello di Monod-Wyman-Changeux un substrato sposta sempre l'equilibrio allosterico verso la conformazione a cui il substrato stesso si lega preferenzialmente. Di conseguenza, secondo questo modello, tutti gli effetti cooperativi sono positivi e non c'e posto per un meccanismo grazie al quale l'unione del primo ligando inibisce quella del ligando successivo, un fenomeno noto come cooperatività negativa. II modello sequenziale, invece, permette anche questo comportamento, perchè il cambiamento conformazionale, provocato dall'interazione di un ligando con una subunità, può indurre nelle subunità adiacenti modificazioni che sfavoriscono l'unione del ligando con tali subunità. La funzione dell'emoglobina comporta modificazioni conformazionali. Il legame con l'ossigeno produce un cambiamento conformazionali nell'emoglobina. Quando cristalli di emoglobina conservati sotto azoto vengono a contatto con l'ossigeno, si sbriciolano perché il legame con l'ossigeno determina un rilevante cambiamento conformazionale, sufficiente a vincere le forze che tengono assieme le molecole di emoglobina nel reticolo cristallino. Come conseguenza, infatti, del legarsi dell'ossigeno una coppia di subunità aβ ruota di circa 15 rispetto all'altra coppia (vedi fig.).

Si tratta di un cambiamento nella struttura quaternaria che, in parte, è di natura elettronica e, in parte, è di natura sterica. Gli effetti elettronici sono determinati dalla struttura elettronica dello ione Fe 2+. Nella deossiemoglobina, infatti, dei sei elettroni dell'orbitale d dello ione Fe 2+ quattro sono spaiati e due formano un doppietto; sono perciò possibili legami con cinque ligandi (i quattro atomi di azoto porfirinici e l'istidina F8). In questa situazione, l'atomo di ferro è paramagnetico e si trova nello stato ad alto spin, che si trasforma in stato a basso spin quando l'ossigeno si lega al gruppo eme. In questa nuova situazione gli elettroni del fèrro sono disposti in tre doppietti e l'atomo di ferro è diamagnetico. Il passaggio dalla forma ad alto spin a quella a basso spin, provocato dall'ossigenazione, è dovuto in parte alla repulsione fra gli elettroni dell'ossigeno e gli elettroni spaiati dello ione Fe 2+ ad alto spin. Come effetto del cambiamento dello stato di spin, si riduce la distanza di legame tra lo ione Fe 2+ e l'istidina F8. Inoltre, l'ossigenazione rende più forti i legami fra l'atomo di ferro e gli atomi di azoto porfirinici, in quanto ne accresce il carattere covalente. L'ossigenazione produce anche effetti sterici che alterano la struttura dell'emoglobina. Lo ione Fe 2+, quando è nello stato ad alto spin, ha un volume atomico maggiore di quando è nello stato a basso spin, perché i suoi quattro elettroni spaiati sono distribuiti in quattro orbitali anziché in due. Nella deossiemoglobina, a causa della repulsione sterica fra gli atomi di azoto porfirinici e l'istidina F8 e fra gli elettroni π della porfirina e gli orbitali dello ione Fe 2+, l'atomo di ferro viene a trovarsi al di fuori del piano della porfirina di circa 0,06 nm. In seguito all'ossigenazione, la

configurazione elettronica dello ione Fe 2+ cambia ed esso si sposta verso il piano della porfirina di circa 0,039 nm fino a una posizione che è 0,021 nm al di fuori del piano stesso. Sembra inverosimile che un cambiamento conformazionale così piccolo possa influire da un punto di vista biologico; eppure, questo leggero spostamento dell'atomo di ferro innesca una complessa serie di modificazioni conformazionali, di vitale importanza sotto l'aspetto fisiologico. Nello spostarsi, lo ione Fe 2+ trascina con sé l'intera catena polipeptidica dell'emoglobina. Cambiamenti conformazionali indotti dall'ossigenazione. La deossiemoglobina è rappresentata in verde, l'ossiemoglobina in blu. (Disegno di Mike Webb.) Baldwin, J.; Chothla, C. (1979) Hemoglobin: the structural changes related to ligand binding and its allosteric mechanism J. Mol. Biol. 129:175-179 Al momento dell'ossigenazione, l'elica F della subunità β si avvicina all'elica H spingendo la tirosina HC2 (vicina all'estremità C-terminale) al di fuori di una tasca in cui normalmente, viene mantenuta tramite un legame idrogeno con il gruppo carbonilico della catena peptidica al livello della valina FG5. Lo spostamento della tirosina HC2 costringe la valina FG5 a spostarsi, rompendo le coppie ioniche che formano legami trasversali fra le catene polipeptidiche della deossiemoglobina. Quando l'ossigeno si lega allo ione Fe 2+ di una subunità, il conseguente cambiamento conformazionale di quella subunità si trasmette alle altre subunità. L'emoglobina resiste inizialmente all'ossigenazione perché le coppie ioniche conferiscono stabilità alla deossiemoglobina. Tuttavia, il legarsi dell'ossigeno è cooperativo, perché, quando le interazioni

elettrostatiche tra le coppie ioniche in una subunità si interrompono, le altre subunità risentono meno delle modificazioni conformazionali indotte dal formarsi del legame con l'ossigeno. L'acido 2,3-bifosfoglicerico fa diminuire l'affinità dell'emoglobina per l ossigeno La curva di saturazione dell'emoglobina con l'ossigeno nel sangue intero e la curva corrispondente in soluzioni acquose tampone non contenenti tutte le sostanze normalmente disciolte nel sangue presentano molte differenze. Anche se le loro forme sono simili, l'emoglobina nel sangue intero ha un'affinità per l'ossigeno minore di quella che presenta l'emoglobina in vitro, in soluzione acquosa. Il componente del sangue, responsabile della minore affinità dell'emoglobina per l'ossigeno, è un effettore allosterico, l'acido 2,3-bifosfoglicerico [2,3-BPG (2,3-bisphosphoglycerate)]. Negli eritrociti la concentrazione di 2,3BPG e di emoglobina sono all'incirca uguali (4,5 mm). La cavità centrale dell'emoglobina è tappezzata dalle catene laterali, dotate di carica positiva, della lisina 82, dell'istidina 2, dell'istidina 143 e del residuo N-terminale di ciascuna delle due subunità β. La disposizione di questi residui con carica positiva nella cavità centrale della deossiemoglobina è complementare alla conformazione e alla carica del 2,3BPG.

Le due catene β sono unite al 2,3BPG mediante legami ionici che conferiscono stabilità alla conformazione della deossi-emoglobina e diminuiscono l'affinità di questa per l'ossigeno

I cambiamenti conformazionali che hanno luogo, con l'ossigenazione rompono il sito di legame con il 2,3BPG, sicché questo composto non può più legarsi all'ossiemoglobina. I siti di legame per l'ossigeno e quello per il 2,3BPG sono diversi. Questo non impedisce che i legami allosterici, che queste due sostanze stabiliscono con la proteina, si escludono a vicenda. L'effetto Bohr influenza il legarsi dell'ossigeno con l'emoglobina Agli inizi del secolo, Christian Bohr, fisiologo danese, padre del celebre fisico Niels Bohr, osservò che l'anidride carbonica prodotta dal metabolismo dei tessuti fa diminuire l'affinità dell'emoglobina per l'ossigeno (vedi fig.). 20 40 60 80 100 Figura: Effetto dell anidride carbonica sul legame tra emoglobina e ossigeno. L anidride carbonica prodotta dal metabolismo dei tessuti fa diminuire la frazione di saturazione (Y) dell emoglobina con l ossigeno, per qualunque valore della pressione parziale dell ossigeno. (Disegno di Patricia Johnson.)

Nei globuli rossi del sangue l'anidride carbonica catalizza la reazione in cui, a partire da anidride carbonica e acqua, si formano uno ione bicarbonato e un protone. La formazione di H + determina una diminuzione del ph all'interno dei globuli rossi. CO 2 + H 2 O H 2 CO 3 HCO - 3 + H + La diminuzione del ph, ancor più che la stessa anidride carbonica, fa diminuire l'affinità dell'emoglobina per l'ossigeno. Questo fenomeno è noto come effetto Bohr. Anche se, al diminuire del ph, la curva di saturazione con l'ossigeno si sposta verso destra, il meccanismo di legame con l'ossigeno rimane cooperativo. Figura: Effetto Bohr. La diminuzione del ph da 7,8 a 7,2 fa diminuire l affinità dell'emoglobina per l'ossigeno, spostando a destra la curva cl saturazione con l'ossigeno. In realtà, i protoni che causano l'effetto Bohr non sono effettori allosterici dell'emoglobina, dato che non interagiscono con un particolare sito della molecola proteica. L'effetto del ph sull affinità dell'emoglobina per l'ossigeno é legato al grado di protonazione di vari gruppi coinvolti in coppie ioniche esistenti fra le subunità. Uno di questi é lo ione imidazolio del residuo di istidina C- terminale (Istidina 146) di ciascuna delle due catene β che, nella deossiemoglobina, forma una coppia ionica con il gruppo carbossilico dell'acido aspartico 94. Il cambiamento conformazionale che avviene in seguito all ossigenazione spezza queste coppie ioniche e gli ioni imidazolio liberano protoni.

Coppia ionica fra ione imidazolio e ione carbossilato nell Hb. In ciascuna delle due catene β della deossi Hb lo ione imidazolio del residuo di istidina 146 (l a.a. C-terminale) è reso più stabile dal gruppo carbossilato adiacente della catena laterale dell acido aspartico 94, con cui forma un legame ionico. L ossigenazione rompe tale legame: lo ione carbossilato si allontana e si libera un protone. Il pka dello ione imidazolio é quindi minore nell ossiemoglobina che nella deossiemoglobina. Una diminuzione del ph, favorisce la formazione di coppie ioniche. Pertanto, la diminuzione del ph favorisce la formazione della deossiemoglobina, la cui conformazione è resa più stabile da tali coppie ioniche. Anche i gruppi amminici N-terminali della deossiemoglobina sono coinvolti nelle coppie ioniche la cui formazione è favorita da minori valori di ph. Esiste un equilibrio tra forma protonata e forma neutra dell'emoglobina. Il pka della prima è 8,0. L'equazione di Henderson-Hasselbalch permette di calcolare il rapporto, a ph 7,4, tra i gruppi amminici N-terminali neutri (Hb-NH 2 ) e protonati (Hb-NH + 3 ): ph = pk'+log[hb-nh 2 ]/[Hb-NH + 3 ] (1) 7,4 = 8,0 + log[hb-nh 2 ]/[Hb-NH + 3 ] (2) [Hb-NH 2 ]/[Hb-NH + 3 ] = 0,25 (3) Una diminuzione del ph fa diminuire il rapporto tra la forma neutra e quella protonata,

favorendo così la conformazione deossi- con coppie ioniche. Nei tessuti, dove avviene la respirazione, la concentrazione di anidride carbonica è relativamente elevata e, pertanto, il ph è relativamente basso. Per l'effetto Bohr, che favorisce la formazione della deossi-emoglobina, l ossigeno è ceduto efficientemente dall emoglobina ai tessuti. Nei polmoni, si ha una situazione esattamente opposta: il ph più elevato favorisce la formazione dell'ossiemoglobina. A differenza del trasporto dell'ossigeno, il trasporto dell'anidride carbonica dai tessuti ai polmoni è fondamentalmente un fenomeno passivo. Lo ione bicarbonato in soluzione è trasportato mediante il sangue ai polmoni dove si ricombina con i protoni liberati dall'emoglobina ed è eliminato con l'espirazione sotto forma di anidride carbonica. Una parte dell'anidride carbonica è trasportata dalla stessa emoglobina. Dall'eq. (3) risulta infatti che a ph 7.4, circa il 25% dei residui N-terminali dell'emoglobina non è protonato. Questi gruppi amminici neutri possono reagire con l'anidride carbonica formando derivati dell'acido carbamminico (Vedi Figura) La reazione di formazione di tali derivati è facilmente reversibile. Nei tessuti, sede di attività metaboliche, la pressione parziale dell'anidride carbonica è relativamente elevata e, pertanto, l'equilibrio della suddetta reazione è spostato nel senso della formazione di tali derivati. A livello dei polmoni, dove la pressione dell'anidride carbonica è molto più bassa, l'equilibrio della reazione si sposta in senso inverso e si libera l'anidride carbonica.

Meccanismo di trasporto della CO 2 da parte dell Hb Il meccanismo del trasporto indiretto isoidrico della CO 2, da parte dell'emoglobina è schematizzato nella figura seguente.

A livello dei tessuti la CO 2 che entra nel sangue è idratata, per azione dell anidrasi carbonica tissutale, a H 2 C0 3 che si dissocia in HCO - 3 e H +. L'aumento di H + facilita il rilascio di O 2 dalla ossiemoglobina (HbO - 2 ). La deossiemoglobina che si forma lega i protoni ([H + ] ) sottraendoli al mezzo. Trasportati dal sangue venoso, HbH e HCO - 3 (questi ultimi salificati con Na + e K + ) arrivano ai polmoni dove la HbH, combinandosi con l'o 2, diventa HbO - 2 che dissocia H +. Questi si associano con l'hco - 3 formando H 2 CO 3 mentre la HbO - 2 si mette in equilibrio con Na + e K +. Il ricostituito H 2 CO 3, per azione dell'anidrasi carbonica polmonare, si dissocia in CO 2 che viene eliminata e H 2 O. Si noti che la riserva alcalina", cioè l'insieme dei K + e Na +, nel sangue venoso è associata agli HCO - 3, in quello arterioso alla HbO - 2. Durante l'intero processo i protoni non sono mai liberi, in quanto vengono catturati dalla HbO - 2 in corrispondenza dei tessuti, o dagli anioni HCO - 3 in corrispondenza dei polmoni. Per questo in condizioni fisiologiche non vi è mai nel sangue

variazione dell acidità attuale, ma soltanto una leggerissima diminuizione del ph nel sangue venoso rispetto a quello arterioso. Processi di questo tipo che avvengono senza variazioni attuali della concentrazione idrogenionica (ph) si chiamano isoidrici. A livello dei tessuti una buona - parte dello ione HCO 3 formatosi entro gli eritrociti esce nel plasma, con contemporaneo passaggio di ioni Cl - negli eritrociti. A livello polmonare avviene il processo inverso: l'eliminazione di CO 2 provoca una diminuzione di HCO - - 3 negli eritrociti, con richiamo di HCO 3 plasmatico e fuoriuscita di Cl - dagli eritrociti. E questo lo "scambio dei cloruri" tra eritrociti e plasma che accompagna il trasporto isoidrico della CO 2 nel sangue.

VARIANTI FISIOLOGICHE DELL'EMOGLOBINA Nei globuli rossi degli individui normali sono presenti diverse emoglobine a seconda delle varie fasi dello sviluppo, e precisamente (vedi anche la Fig. 5.13): 1) la Hb-E (α 2 ε 2 ) o emoglobina embrionale (HbGower-2), che è la forma prevalente di Hb nel sangue dell'embrione nelle prime fasi dello sviluppo (4-10 settimana); 2) la Hb-F (α 2 γ 2 ) o emoglobina fetale, caratteristica del feto (3-9 mese). La Hb-F, non legando 2,3BPG ha una affinità per 1'0 2 più elevata della emoglobina adulta: ciò consente il trasferimento dell'o 2 dal sangue materno a quello fetale. Nel contempo, essendo la po 2 del sangue periferico fetale più bassa che nel sangue p1acentare (10-12 mm Hg contro 25-40), l'hb-f rilascia efficacemente O 2 ai tessuti fetali (Fig. 5.14); 3) la Hb-A 1 (α 2 β 2 ), che costituisce più del 90% dell'emoglobina totale durante la vita postnatale (sopra i 7 mesi di vita), insieme alla Hb-A 2 (α 2 δ 2 ), presente nella percentuale del 3%. Tutte le emoglobine posseggono le due catene α, mentre diversificano per le due catene non α (β, γ, ε, δ). δ Le catene "non α" hanno tutte la stessa lunghezza (146 residui di amino acidi), ma si differenziano per la natura di alcuni residui nella sequenza. La Figura mostra la variazione delle catene polipeptidiche costituenti le emoglobine umane nelle varie fasi di sviluppo.

Il significato delle varianti di emoglobina va probabilmente ricercato in un adattamento alle condizioni ambientali che si succedono nel corso della vita intra- ed extrauterina.

DERIVATI DELL EMOGLOBINA Metaemoglobina. La metaemoglobina, o ferriemoglobina, è il prodotto di ossidazione (non di ossigenazione) della emoglobina. Nella metaemoglobina il ferro dell'eme è allo stato ossidato (Fe 3+ ) e non è capace di legare 1'O 2. La metaemoglobina è quindi inefficiente nel trasporto dell'o 2. La formazione di metaemoglobina è accompagnata da quella dell'anione superossido O - 2, specie radicalica dell'o 2. Nell'uomo adulto normale la metaemoglobina è presente nella percentuale del 1,7% dell'emoglobina totale. Una più elevata quantità di metaemoglobina (metaemoglobinemia) può conseguire o ad aumentata formazione di metaemoglobina (come ad esempio dopo somministrazione di certi farmaci: antipirina, fenacetina, ecc.), o a sua diminuita riduzione da parte dei sistemi enzimatici, presenti negli eritrociti, normalmente addetti alla riconversione della metaemoglobina in emoglobina desossigenata (vedi figura). Questi sono imperniati sull'azione della metaemoglobina riduttasi che provvede alla riduzione della metaemoglobina a spese del NADH(H + ), e della superossido dismutasi ed enzimi ancillari, che rimuovono l'anione superossido, con generazione di O 2 molecolare, a spese del NADPH(H + ). La metaemoglobina riduttasi è deficitaria in una malattia ereditaria, la metaemoglobinemia familiare, nella quale la percentuale di metaemoglobina raggiunge il 30-40%, il che comporta, episodicamente, insufficienza respiratoria e cianosi.

Carbossiemoglobina o carbonilemoglobina (Hb-CO). L'emoglobina lega l'ossido di carbonio (CO) con una affinità 250 volte superiore a quella per l'o 2, Legandosi con l'emoglobina in corrispondenza del Fe 2+ dell'eme, il CO impedisce all'o 2 di legarsi all'emoglobina, di qui la sua elevata tossicità. Anche legando si ad uno solo dei 4 gruppi eme dell'emoglobina, il CO diminuisce notevolmente l'affinità per l'o 2 dei rimanenti 3. Per questa ragione la tossicità del CO è molto più elevata di quanto sia prevedibile in base alla sua concentrazione nel sangue. Si spiega così perché la semisaturazione di CO nel sangue è mortale, mentre la disponibilità del 50% di emoglobina, come si può avere nelle anemie, non compromette affatto la vita. Cianometaemoglobina. L'azione tossica micidiale del cianuro (CN - ) è dovuta alla sua capacità di legarsi alla citocromo ossidasi bloccando così la respirazione mitocondriale. Il cianuro non reagisce con l'emoglobina ma si combina con grande facilità con la metaemoglobina per formare la cianometaemoglobina. Data la elevata affinità del cianuro per la metaemoglobina e la scarsa tossicità della cianometaemoglobina, nella intossicazione da cianuro si cerca di trasferire questo tossico dalla citocromo ossidasi alla metaemoglobina, favorendone la formazione dalla emoglobina per somministrazione endovenosa di sodio nitrato. Contemporaneamente si somministra anche sodio tiosolfato che reagisce con il cianuro per formare tiocianato, prodotto non tossico e facilmente eliminabile attraverso i reni.

EMOGLOBINE ATIPICHE Si tratta di emoglobine anomale nella loro struttura primaria e soprapprimaria (malattie molecolari), a causa di mutazioni dei geni che le codificano. Le più tipiche sono: 1. Emoglobina S 2. Emoglobina M 3. Emoglobina Riversale-Bronx 4. Talassemie Emoglobina S (Hb-S). Questa denominazione deriva dalla forma a falce (falce = sickle, donde la sigla S) che assumono gli eritrociti degli individui che ne sono affetti quando siano esposti a basse tensioni di O 2. La emoglobina S è costituita da due catene α normali e da due catene β modificate nella struttura primaria per un errore genetico. Nella posizione 6 a partire dall'amino acido N- terminale contengono infatti un residuo di valina al posto di un residuo di acido glutammico: α 2 β val6 2. La sostituzione di un residuo apolare (valina) ad un residuo polare (acido glutammico), localizzato sulla superficie dell'emoglobina, impartisce all emoglobina S proprietà elettroforetiche diverse da quelle della emoglobina normale. Possedendo infatti due cariche negative in meno la Hb-S migra più lentamente verso il polo positivo (vedi figura). Anche la solubilità della Hb-S allo stato deossigenato è notevolmente diminuita (25 volte meno solubile della forma deossigenata della Hb-A) a causa di una interazione idrofobica fra valina terminale di una delle due catene β e la valina-6 dell'altra. La polimerizzazione che ne deriva da luogo ad un precipitato fibroso (si parla dell'hb-s come di emoglobina appiccicosa ) che induce

la deformazione a falce del globulo rosso. I globuli rossi falciformi hanno una vita media più breve dei normali, sono più facilmente emolizzabili e agglutinabili nei piccoli vasi che ne possono essere ostruiti, creando piccole zone ischemicbe. Gli eritrociti falciformi sono facilmente fagocitati dai reticoli endoteliali e rimossi dal circolo, donde lo stato anemico (anemia). Il decorso cronico della malattia é costellato da crisi accessuali cianotiche, che si manifestano allorché i pazienti si trovino esposti a relativamente basse tensioni di O 2, per esempio dopo sforzo prolungato. L'anemia falciforme è una malattia ereditaria, che si esprime in forma conclamata solo negli omozigoti, vale a dire nei figli che ricevono il gene anomalo da entrambi i genitori. Negli omozigoti la Hb-S é la sola forma di emoglobina presente negli eritrociti. Gli omozigoti non vivono generalmente oltre l'età di 25 anni. Gli eterozigoti, cioè i figli che ricevono il gene anomalo da uno solo dei genitori, posseggono il 50% di Hb-S ed il 50% di Hb-A. In essi l'anemia falciforme è asintomatica, salvo crisi sporadiche che possono verificarsi in condizioni di bassa tensione di O 2 : maschio falciforme (sickle cell trait). L'anemia falciforme è molto comune nelle popolazioni africane. Tale elevata percentuale viene raggiunta nelle zone malariche. Si ritiene infatti che l'anemia falciforme costituisca un adattamento difensivo del globulo rosso contro il Plasmodium falciparum. In effetti una fase del ciclo vitale di questo parassita si svolge nei globuli rossi: la emolisi immediata dei globuli rossi falciformi, allorché vengono invasi dal parassita. ne interrompe il ciclo vitale. Emoglobina M. L istidina prossimale all'eme, in entrambe le catene α e β è sostituita da tirosina, che si lega con legame coordinativo al ferro dell eme stabilizzandolo nella forma ferrica (Fe 3+ ). Da ciò la sigla M, iniziale di Metaemoglobina. In tale condizione l eme non può legare l'o 2 e la malattia è infatti letale per gli omozigoti. L anemia da emoglobina M si manifesta con cianosi, più o meno intensa ed estesa, dovuta a carenza di O 2 nei piccoli vasi dei tessuti periferici. Emoglobina Riverdale-Bronx. In questa emoglobina un residuo di glicina delle catene β, viene sostituito da uno di arginina, molto più ingombrante. La struttura terziaria del protomero ne viene deformata in modo tale da non essere più in grado di tener legato l'eme. Così si spiega come l emoglobina Riversale-Bronx possegga 2 o 3, ma non 4 gruppi eme. Talassemie. Sono emoglobinopatie causate da errori genetici che si traducono nella difettosa sintesi non di un solo aminoacido -vedi emoglobine atipiche- ma di una o più catene

polipeptidiche (subunità) costitutive. Si distinguono in talassemie α e β a seconda che il difetto sia a carico della subunità α o β. Le talassemie α sono dovute a delezione di uno o più geni codificanti le subunità α. I due geni codificanti le subunità α sono localizzati, uno adiacente all'altro, nel cromosoma 16, per cui un soggetto normale, diploide, ne possiede 4 copie. Se di queste ne manca una si ha la talassemia α-l, se ne mancano due la talassemia α-2. Entrambi i casi comportano una modesta anemia. Quando invece mancano 3 dei 4 geni, e conseguentemente la subunità α è pressoché assente, si ha produzione di un tetramero β 4. Se tutti i geni sono deleti, la malattia è letale. Le talassemie β sono prodotte da delezione dei geni che codificano le subunità β o alla incapacità di essere espressi. Nella variante omozigote, cioè nella talassemia β, nella quale tutte le subunità sono assenti si ha la produzione compensatoria di subunità γ che continuano ad essere sintetizzate anche dopo il parto. Si ha così emoglobina fetale (α 2 γ 2 ), la cui produzione continua fino alla fanciullezza, seguita sempre dalla morte. Le emoglobine delle talassemie β analogamente alla emoglobina fetale possono trasportare l'ossigeno, ma non sono sede dell'effetto Bohr e quindi insensibili all'effetto allosterico degli H +. Pertanto l'affinità per l'o 2 è aumentata ed il rilascio dell'o 2 ai tessuti è insufficiente. Oltre alle numerose emoglobinopatie associate ad uno stato patologico più o meno grave, sono possibili alterazioni della molecola dell'emoglobina che, non comportando alcuna disfunzione della molecola. si definiscono "silenti". Ciò si verifica quando l'anomalia, genetica implica la sostituzione di amino acidi non essenziali per la funzionalità dell'emoglobina.

BIOSINTESI DELL EME Sia nei batteri che negli animali i gruppi prostetici dell eme dell emoglobina, della mioglobina, del citocromo c, delle per ossidasi, della catalasi e del sistema policiclico corrinico della vitamina B 12, derivano tutti dalla glicina e dal succinil-coa. Nella biosintesi dell eme, la reazione che determina la velocità dell intero processo è la condensazione della glicina con il succinil-coa, che avviene con la perdita di anidride carbonica. Questa reazione di condensazione è catalizzata dalla δ-aminolevulinico sintetasi, PLP dipendente, presente nei mitocondri. Questo enzima è controllato dall eme; l eme, infatti, è in grado sia di inibire allostericamente quest attività enzimatica sia di reprimerne la sintesi. La successiva tappa biosintetica prevede la condensazione di due molecole di acido δ- aminolevulinico con sintesi di porfobilinogeno (Vedi schema seguente). Tale reazione è catalizzata dalla δ-aminolevulinico deidratasi.

Questa reazione è sensibile al piombo e in caso di avvelenamento da Pb si verificherà la eliminazione, con le urine, di grandi quantità di acido δ-aminolevulinico. Dalla successiva condensazione di quattro molecole di porfobilinogeno, si produrrà il tetrapirrilmetano. La reazione è catalizzata dalla Uroporfobilinogeno I-sintetasi. Quando è presente soltanto questo enzima (Uroporfobilinogeno I-sintetasi) il tetrapirrilmetano ciclizza dando l uroporfobilinogeno I che possiede doppi legami simmetrici rispetto ai piani di simmetria della molecola e gruppi acetato e proprionato al centro della molecola (vedi schema successivo).

Affinché si sintetizzi l uroporfobilinogeno III, che è il vero precursore dell eme, l Uroporfobilinogeno I-sintetasi deve agire in presenza dell Uroporfobilinogeno III-cosintetasi (Vedi schema seguente).

La cosintetasi tautomerizza i doppi legami dell anello D del tetrapirrilmetano e la successiva ciclizzazione da origine ad un composto asimmetrico, le cui catene di acetato e propionato non sono disposte simmetricamente rispetto al centro della molecola.

L Uroporfibilinogeno III verrà trasformato in protoporfirina IX, il diretto precursore dell eme. Nella prima reazione, per decarbossilazione dei gruppi acetato in gruppi metinici, si origina il coproporfobilinogeno III. La reazione è catalizzata dall Uroporfobilinogeno decarbossilasi. Successivamente, i gruppi proponici degli anelli A e B verranno convertiti in gruppi vinilici ad opera della Coproporfobilinogeno ossidasi, con formazione del Protoporfirinogeno IX. Infine i quattro legami metilenici, che uniscono gli anelli pirrolici, verranno ossidati in gruppi metenici dalla Protoporfirinogeno ossidasi con produzione della Protoporfirina IX.

A tal punto una Ferrochelatasi inserirà lo ione ferroso (Fe 2+ ) nella Protoporfirina IX formando l eme. Gli errori congeniti del metabolismo dell'eme sono noti complessivamente come porfirie. Ne esistono tre classi. Nella porfiria congenita eritropoietica, la concentrazione dell'uroporfirinogeno III-cosintetasi è pari a circa un terzo di quella normale. Di conseguenza, vengono sintetizzate notevoli quantità di uroporfirina I, che sono accumulate nei tessuti e, alla fine, eliminate con le urine e con le feci. Gli individui affetti emettono un'urina rossa e i loro denti sono fluorescenti alla luce ultravioletta. Inoltre, soffrono di una grave fotosensibilità cutanea, spesso debilitante. Questa malattia ereditaria è trasmessa come carattere autosomico recessivo. La seconda classe di porfiria ereditaria comprende la protoporfiria eritropoietica, che ha sintomi analoghi, ma generalmente più lievi, della porfiria congenita eritropoietica. Pare sia dovuta a una parziale deficienza della ferrochelatasi ed è trasmessa come carattere autosomico dominante. La porfiria intermittente acuta, che rappresenta la terza classe, è una malattia autosomica dominante, che può provocare forti dolori addominali e disfunzioni neurologiche. Dal punta di vista biochimico, è caratterizzata da un incremento nell'escrezione urinaria dell'acido δ- amminolevulinico e di porfobilinogeno. Un tempo si riteneva che fosse dovuta a un difetto primario nella regolazione della δ-amminolevulinico-sintetasi, ma studi più recenti hanno

dimostrato che il difetto primario e rappresentato, invece, dalla parziale (50%) deficienza della uroporfirinogeno I-sintetasi. Ne risulta uno stato di relativa carenza di eme e una mancanza di inibizione retrograda della δ-amminolevulinico-sintetasi da parte dell'eme, il che conduce a un incremento della sintesi di acido δ-amminolevulinico e di porfobilinogeno per compensare il blocco parziale della reazione catalizzata dall'uroporfirinogeno I-sintetasi nella biosintesi dell'eme. La maggior parte degli individui affetti da porfiria intermittente acuta sono asintomatici fino a quando non assumono farmaci come estrogeni, sulfamidici, barbiturici e altre sostanze che influiscono sulla sintesi dell'acido δ-amminolevulinico.