UNIVERSITA' degli STUDI di PERUGIA Facoltà di MEDICINA e CHIRURGIA Corso di Laurea in Medicina e Chirurgia AA 2011-2012 Diagnosi di laboratorio delle infezioni fungine
Dopo l ESAME OBIETTIVO (può essere accompagnato dalla osservazione delle lesioni alla luce di Wood): RICERCA DELL'AGENTE ETIOLOGICO - esame microscopico - esame colturale INDAGINI SIEROLOGICHE - anticorpi - antigeni fungini
PER INFEZIONI SUPERFICIALI cute e/o annessi mucosa PER INFEZIONI SOTTOCUTANEE frammenti di tessuto aspirazione dell'essudato PER INFEZIONI PROFONDE a seconda dell'infezione sangue liquor espettorato, aspirato bronchiale, lavaggio broncoalveoare urine biopsie tissutali da organi viscerali essudato
PRELIEVO E RACCOLTA DEL CAMPIONE PER INFEZIONI SUPERFICIALI: 1) Da cute glabra: detersione e disinfezione con con alcool al 70%; scarificazione della lesione (ai margini) con un bisturi o il bordo di un vetrino 2) Da vescico-pustole: si rompe la vescica e si mette il tetto in coltura, quindi con l'ansa o tampone si preleva il contenuto della vescicola 3) Da capelli o peli: si prelevano dal centro della lesione, scegliendo quelli con alterazioni visibili 4) Da unghie: si tagliano pezzettini di unghia dal sito infetto o si scarifica con un bisturi sterile (preferibilmente dai bordi). 5) Dalle mucose: si introduce e si striscia il tampone nella regione interessata e si stempera in soluzione fisiologica.
ESAME MICROSCOPICO A FRESCO permette la visualizzazione e, a volte, l'identificazione dei funghi, in base alle caratteristiche morfologiche. a) se il materiale non è opaco, si osserva direttamente b) se il materiale è opaco (squame, unghie, pus) si effettua prima la chiarificazione con KOH al 10% CON COLORAZIONE 1) Chiarificazione (se necessario) 2) Fissazione in etanolo al 95% per 20' o in metanolo per 2-3' 3) Colorazione: -semplice (blu di metilene, inchiostro di china, arancio di acridina) -differenziale (Ematossilina-eosina)
Impiego di composti fluorescenti non specifici che si legano a cellulosa e chitina (immagini al microscopio a fluorescenza) Calcofluor-white Blankophor
TERRENI DI COLTURA PER MICOLOGIA Lieviti SABOURAUD Dextrose agar (o brodo): contiene peptone e destrosio. E' selettivo verso i batteri per il ph acido (5.6). Può essere addizionato di: a) olio di oliva (per Pityrosporum) b) cloramfenicolo (per inibire i batteri) c) cicloeximide (per inibire le muffe, ma anche Cryptococcus è sensibile) Funghi filamentosi Temperatura di incubazione: 25-28 C (dermatofiti), o 37 C Tempo di coltivazione: da 1-2 a 20 giorni.
Il più impiegato è il SABOURAUD esistono poi numerosi terreni per impieghi specifici Czapek Dox Agar (Aspergillus & Penicillium) Bird Seed Agar Cornmeal Agar Potato Dextrose Agar Brain Heart Infusion Agar + 5% Sheep Blood Malt Extract Agar Rice Grain Medium Littman Oxgall Agar 1% Peptone Agar etc... n.b.: i terreni con estratti vegetali sono utilizzati per l'induzione di ife, conidi, clamidospore
Identificazione dei LIEVITI e dei FUNGHI FILAMENTOSI
LIEVITI - Test del tubo germinativo (Germ-tube) La coltivazione in terreno liquido + 5-10 % di siero a 37 C per 2 h induce la produzione di tubi germinativi nella specie Candida albicans 2 h Candida albicans 2 h Candida spp. (non C. albicans)
IDENTIFICAZIONE FUNGHI LIEVITIFORMI + altre prove biochimiche o metaboliche (test dell'ureasi, fenolossidasi, test di riduzione dei nitrati, utilizzo dei carboidrati, etc.)
Schema diagnostico per i lieviti Campione biologico
Identificazione di Cryptococcus nel liquor Inchiostro di china LATEX-CRYPTO ANTIGEN SYSTEM
Identificazione dei FUNGHI FILAMENTOSI 1. osservazione macroscopica della forma e del colore della colonia Aspergillus Penillium
Identificazione dei FUNGHI FILAMENTOSI 2. osservazione microscopica per osservare i corpi fruttiferi, ife e conidi (prelevati toccando il micelio aereo con del nastro adesivo che va attaccato su un vetrino dove c è una goccia di Blu Cotton) Esame microscopico
Altri tests: parassitamento del pelo (dermatofiti) 1) all'interno = ENDOTRIX (Trichophyton) Il pelo si spezza nel punto da cui esce dall'ostio follicolare Al microscopio ottico si ha un'immagine "a sacchetto di noci 2) all'esterno = ECTOTRIX (Microsporum) Si forma una sorta di manicotto che rende il pelo più resistente, per cui si spezza a qualche mm dall'ostio follicolare. Al microscopio si ha un immagine "a grissino intinto nel miele
Altri tests: LUCE DI WOOD (dermatofiti) Prodotta da raggi UVA (l = 365 nm), mette in evidenza sostanze fluorescenti presenti nel materiale biologico. La fluorescenza può essere per i dermatofiti: verde brillante = M. audouinii verde = M. canis verde giallastra = T. shonleinii grigio-azzurrognola = T. tonsurans per i lieviti: grigio-giallastra = P. ovale Fluorescenza del capello alla luce di Wood Falsi positivi possono essere dovuti a cheratina, fibre tessili, acido salicilico, vaselina. N.B. fluorescenza rosa salmone può essere data da Corynebacterium minutissimum, agente etiologico dell'eritrasma
Identificazione di Pneumocystis jirovecii Campione biologico: lavaggio broncoalveolare Metodo: Immunofluorescenza diretta
COLORAZIONI ISTOLOGICHE Gomori-Grocott = impregnazione argentica per cui le cellule fungine assumono colorazione scura rispetto al tessuto, giallo o verde scuro. PAS (Acido periodico di Shiff) = colorazione selettiva per i polisaccaridi. Le cellule fungine appaiono rosso magenta, e i nuclei delle cellule dell'ospite blu su fondo chiaro.
Determinazione di antigeni fungini: molti dubbi... Difficulties in using 1,3-β-D-glucan as the screening test for the early diagnosis of invasive fungal infections in patients with haematological malignancies high frequency of false-positive results and their analysis Racil Z. et al Journal of Medical Microbiology (2010), 59, 1016 1022