Evidenze e benefici dell analisi clinica di routine in LC-MS/MS

Evidenze e benefici dell analisi clinica di routine in LC-MS/MS Immunosoppressori in sangue intero 25-OH vitamina D3/D2 in plasma/siero Steroidi in plasma/siero/dbs Dr. Donzelli Simone Regional Development Specialist Clinical Waters 2013 Waters Corporation 1

Indice: Immunosoppressori Studio del TDM L importanza del TDM degli immunosoppressori Tecniche a confronto Vitamina D3 Perchè la misura della 25-OH Vitamina D3 L importanza della 25-OH Vitamina D2 Tecniche a confronto Stato dell arte Steroidi Tecniche a confronto Analisi del profilo steroideo (valutazione kit CE-IVD) Applicazioni su siero e DBS del CAH (Congenital Adrenal Hyperplasia) 2013 Waters Corporation 2

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Immunosoppressori e l importanza del Therapeutic Drug Monitoring 2013 Waters Corporation 4

Cos è il therapeutic drug monitoring? Il Therapeutic Drug Monitoring (TDM) è un settore della chimica clinica che si specializza nella misurazione di livelli di farmaci nel sangue. Il suo principale obiettivo è focalizzato sui farmaci con un piccolo margine terapeutico: farmaci che facilmente possono essere sotto o sovradosati. D. Holt I clinici useranno la misurazione della concentrazione del farmaco insieme alle loro osservazioni ed agli altri risultati di altri tests per modificare il dosaggio del farmaco per ottenere il risultato migliore possibile per ogni paziente. Questa individualizzazione della terapia usando tutte le informazioni possibili è conosciuta come Therapeutic Drug Management. 2013 Waters Corporation 5

Sub-therapeutic Sub-therapeutic Therapeutic Perchè il TDM è necessario? La maggior parte dei farmaci terapeutici possono anche avere effetti di tossicità Ibuprofene Se l optimum del range terapeutico è vicino alla tossicità Therapeutic Toxic Toxic il dosaggio deve essere controllato accuratamente TDM Concentration 2013 Waters Corporation 6

TDM degli immunosoppressori Il TDM per i farmaci anti-rigetto è una strategia per la quale il regime di dosaggio per un paziente è controllato da ripetute misurazioni della concentrazione del farmaco nel sangue. Fattori critici che possono aiutare a definire un indice terapeutico: Età, sesso, peso del paziente Dosaggio del farmaco Farmacocinetica Co-medicazioni Metodiche usate dal laboratorio per misurare i farmaci 2013 Waters Corporation 7

Variabilità inter-individuale A seconda del paziente ci possono quindi essere anche grandi differenze inter-individuali nella farmacocinetica e farmacodinamica. Una terapia opportuna dipenderà appunto dall individualizzazione del trattamento Patient 1 Patient 2 Patient 3 Patient 4 2013 Waters Corporation 8

Perchè TDM per gli immunosuppressori? Il range terapeutico è piccolo per cui il dosaggio deve essere controllato in modo opportuno; L individualizzazione del trattamento dovuta alle ampie differenze inter-paziente in PK/PD richiede un accurato TDM; In alcuni casi il TDM viene utilizzato anche per assicurarsi che i pazienti stiano prendendo le dosi prescritte del farmaco (compliance del paziente). 2013 Waters Corporation 9

Tecniche di analisi Immunoassay (automatizzato / semi-automatizzato) HPLC con rivelazione a UV / Fluorescenza LC-MS/MS 2013 Waters Corporation 10

Piattaforme di analisi del tacrolimous in US 2010 Waters 58% AB Sciex 30% Thermo Fisher 8% Agilent 4% LC-MS/MS 29% Abbott Architet 44% Altre Piattaforme IA 5% Siemens Dimension 22% 2013 Waters Corporation 11

Numero di risultati riportati Crescita della tecnica di LC-MS/MS per il monitoraggio degli immunosuppressori 400 350 300 250 200 150 100 LC-MS/MS Total Imx Emit 2000 ACMIA CMIA HPLC MS 50 0 Set 99 Mar 00 Set 00 Mar 01 Set 01 Mar 02 Set 02 Mar 03 Set 03 Mar 04 Set 04 Mar 05 Set 05 Mar 06 Set 06 Mar 07 Set 07 Mar 08 Set 08 Mar 09 Set 09 Mar 10 Set 10 Mar 11 Set 11 Mar 12 2013 Waters Corporation 12

Come mai cresce la LC-MS/MS? Carenze Immunoassay Performance Immunoassay Performance LC-MS/MS Bassa Specificità Interferenze dei metaboliti di Ciclosporina e Tacrolimus sono bene documentati. Specificità altissima: massa e frammenti caratteristici per ogni farmaco Bassa Sensibilità Molti, se non tutti gli IA TDM hanno problemi con la sensibilità Eccellente: < 0,5 ug/l Alti costi* 2013 Waters Corporation 13

Confronto di Performance tra IA e LC-MS/MS 2013 Waters Corporation 14

LC-MS/MS è più specifica degli IA Interferenze con metaboliti Interferenze da anticorpi endogeni 1 Interferenze da fattori reumatoidi 2 Effetto dell ematocrito 3 Interferenze sconosciute 4 1 Ther Drug Monit 2009;31(2):269-272 2 Ther Drug Monit 2009;31(6):743-745 3 Ther Drug Monit 2007;27(1):94-97 4 Clinica Chimica Acta 2010;411:77-80 2013 Waters Corporation 15

Perchè la LC-MS/MS? Tecnica considerata Gold standard per il TDM degli immunosoppressori Alta Specificità per ogni farmaco Le selezioni della massa e dei frammenti caratteristici per ogni farmaco elimina ogni cross-reaction con i metaboliti Accuratezza e precisione superiori Sensibilità elevata (0,5 ug/l) 2013 Waters Corporation 16

Perchè la LC-MS/MS? Immunosuppressant Immunoassays - Company Assay % Metabolite Cross Reactivity Siemens Dimension Systems SIRO Assay 89% Emit 2000 Sirolimus Assay 61% ADVIA Centaur Systems CsA Assay 16% Dimension Clinical Chemistry System CSA/CSE Assay 6% Emit 2000 Cyclosporine Assay 8% Dimension Clinical Chemistry System Tacrolimus 18% Emit 2000 Tacrolimus Assay 21% Abbott ARCHITECT Sirolimus Assay 37% ARCHITECT Tacrolimus Assay 94% ARCHITECT Cyclosporine Assay 3.3% TDx Cyclosporine Monoclonal Whole Blood Assay 96% IMx Sirolimus Assay 77% IMx Tacrolimus/Tacrolimus II Assay 67% Thermo-Fisher Thermo Scientific QMS Everolimus Immunoassay 63% Thermo Scientific Innofluor Certican (Eve) Seradyn 142% CEDIA Cyclosporine Plus (Microgenics) 32.5 % CEDIA Tacrolimus (Microgenics) 38% % Metabolite cross reactivity is the highest % of cross reactivity for a specific metabolite of the parent drug. References Advances in Chromatographic Techniques for Therapeutic Drug Monitoring Amitava Dasgupta 2010 2013 Waters Corporation 17

LC-MS/MS vs. MEIA Ther Drug Monit Volume 28, Number 4, August 2006 2013 Waters Corporation 18

LC-MS/MS vs. MEIA e CEDIA 2013 Waters Corporation 19

LC-MS/MS vs. FPIA per everolimus 2013 Waters Corporation 20

LC-MS/MS vs. ACMIA per tacrolimous 2013 Waters Corporation 21

LC-MS/MS vs. FPIA per everolimus The analytical methods FPIA and LC-MS/MS are not in agreement.... using FPIA results in higher everolimus concentrations compared with LC-MS/MS. FPIA can lead to clinically relevant differences in everolimus dosage advice and higher intra-patient variability. LC-MS/MS outperforms FPIA for clinical monitoring and intervention of everolimus therapy in adult renal transplant recipients 2013 Waters Corporation 22

Perchè la LC-MS/MS? Tecnica considerata Gold standard per il TDM degli immunosoppressori Alta Specificità per ogni farmaco Le selezioni della massa e dei frammenti caratteristici per ogni farmaco elimina ogni cross-reaction con i metaboliti Accuratezza e precisione superiori Sensibilità elevata (0,5 ug/l) 2013 Waters Corporation 23

Ciclosporina Cut-off: cuore: 350 ng/ml Linearità Massa 2000 ng/ml 2013 Waters Corporation 24

ARCHITECT tacrolimus package insert 2013 Waters Corporation 25

Innofluor Certican package insert 2013 Waters Corporation 26

Perchè la LC-MS/MS? Tecnica considerata Gold standard per il TDM degli immunosoppressori Alta Specificità per ogni farmaco Le selezioni della massa e dei frammenti caratteristici per ogni farmaco elimina ogni cross-reaction con i metaboliti Accuratezza e precisione superiori Sensibilità elevata (0,5 ug/l) 2013 Waters Corporation 27

LC-MS/MS accuratezza Accuratezza Concentrazione del Tacrolimus misurata con il kit MassTrak in relazione al valore medio dei report NEQAS di tutti i laboratori che utilizzano la tecnica di LC-MS/MS Linearità: Y = 0.998X + 0.099; r 2 = 0.996 Differenza media 1.1% in un range di 0.0 30.7 ng/ml 2013 Waters Corporation 28

Perchè la LC-MS/MS? Tecnica considerata Gold standard per il TDM degli immunosoppressori Alta Specificità per ogni farmaco Le selezioni della massa e dei frammenti caratteristici per ogni farmaco elimina ogni cross-reaction con i metaboliti Accuratezza e precisione superiori Sensibilità elevata (0,5 ug/l) 2013 Waters Corporation 29

Sensibilità elevata La combinazione di immunosoppressori ha portato ad una diminuzione dei livelli di dosaggio terapeutico: La sensibilità,la specificità e la precisione degli strumenti immunochimici ai livelli bassi delle finestre terapeutiche iniziano a diventare critiche per il monitoraggio. Con livelli funzionali vicini a 1 ng/ml (pediatrici), LC-MS/MS ha prestazioni decisamente superiori della strumentazione immunochimica 2013 Waters Corporation 30

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25-OH Vitamina D3/D2 2013 Waters Corporation 33

25 OH - Vitamina D Che cos è la Vitamina D? Non bisogna considerare la Vitamina D come una vera e propria Vitamina (sostanza che, come la Vitamina C, partecipa alle reazioni biologiche, aiutando il corpo a operare ottimamente) Vitamina D è una classe a se stante: gli effetti che ottiene nel corpo sono allineati a un ormone che agisce per influenzare i percorsi metabolici, le funzioni cellulari La forma metabolica attiva della Vitamina D, chiamata 1,25- diidrossivitamina D (o calcitriolo) è un ormone secosteroide (pro ormone) 2013 Waters Corporation 34

25 OH - Vitamina D Benefici della Vitamina D Metabolismo Osseo: previene osteoporosi, rachitismo, fratture Salute cellulare: previene tumori (seno, prostata, pancreas, ovaie, colon) Salute organismo: previene problemi cardiaci ed infarti, diabete di tipo 2, perdita dei denti Salute muscolare Salute Mentale: previene la depressione (stimola la produzione di serotonina), schizofrenia, Alzheimer,... 2013 Waters Corporation 35

25 OH - Vitamina D Misurazione della Vitamina D Nel corpo sono presenti circa 30 metaboliti che in maggior parte non svolgono alcuna funzione fisiologica ma costituiscono soltanto prodotti di degradazione Migliore indicatore dello stato della vitamina D: 25-OH-vitamina D 3 È il metabolita principale (prodotto nel fegato); Emivita di 8 settimane; Si presenta in concentrazioni rilevabili in siero/plasma: 20 70 µg/l; È l indicatore principale dello stato della presenza di Vitamina D3 nel corpo Come mai la forma attiva 1,25-(OH) 2 -vitamina D 3 non viene considerata come il principale indicatore della carenza di Vitamina D? molto instabile (emivita 8 minuti) quantità di almeno 1000 volte inferiore alla 25-OH-vitamina D 2013 Waters Corporation 36

25 OH - Vitamina D Range terapeutici Vitamina D: Grave Carenza: < 10 ug/l (ng/ml) Insufficienza: 10 ug/l < Vit D < 20 ug/l Livello Ottimale: 20 ug/l < Vit D < 70 ug /L Il fatto che la sintesi della VitD3 viene attivata anche dai raggi UV solari porta ad un valore medio di Vitamina D3 diverso tra estate ed inverno ed a un valore basso in zone poco esposte ai raggi solari Carnagione scura meno Vit.D3; Carnagione chiara più Vit.D3 In Gran Bretagna più del 50% della popolazione ha livelli di vitamina D insufficienti In Medio Oriente alta presenza di sole ma le donne sono completamente vestite 2013 Waters Corporation 37

Valutazione di: Roche Diasorin RIA Diasorin Liaison IDS EIA HPLC UV LC-MS/MS Capacità di analizzare 25OH vitd2 e 25OH vit D3 separatamente Capacità di misurare Vit D2 e vit D3 totali Capacità di discriminare l epimero LOQ Precisione Produttività Flessibilità nel settaggio metodi 2013 Waters Corporation 38

25 OH - Vitamina D Valutazioni Metodiche Immunoassay: Diasorin: Sensibilità: 4 ug/l Range di linearità: 4 150 ug/l IDS: Sensibilità: 2,5 ug/l Range di linearità: 2,5 144 ug/l Abbott: Sensibilità: 8,0 ug/l Range di linearità: 8 120 ug/l Valutazioni Metodiche HPLC: HPLC-UV: Sensibilità: 3 ug/l Range di linearità: 3 250 ug/l HPLC-MS/MS: Sensibilità: 1,0 ug/l Range di linearità: 1,0-250 ug/l Entrambe le metodiche: Misurano la Vitamina D TOTALE! non riescono a separare l epimero della Vit. D Entrambe le metodiche: Possono calcolare separatamente la 25-OH vitamina D 3 e D 2 La massa riesce a separare l epimero della Vit. D 2013 Waters Corporation 39

PERCHE E IMPORTANTE QUANTIFICARE LE DUE ISOFORME: La Vitamina D3 non è presente in natura perché viene prodotta solo nel corpo mediante la reazione vista precedentemente La Vitamina D2 è di origine vegetale. Mediante la dieta si può raggiungere una concentrazione massima nel corpo di circa 2 ug/l. Ci sono quindi differenze nelle attività biologiche e nella tossicità fra le due isoforme: L assorbimento intestinale della Vitamina D2 è minore che quello della vitamina D3 La clearance della 25OH-VitD2 è più veloce di quella della 25OH-VitD3. Ciò dovrebbe essere dovuto alla minore affinità del 25OH-VitD2 al legame D-proteico (DPBV) Ci sono quindi differenze nel metabolismo di queste due forme di Vitamina: la Vit D2 non può essere considerata efficace come la Vit D3! 2013 Waters Corporation 40

Stato dell arte della Vitamina D Compares DiaSorin RIA, Nichols CPBA, IDS RIA with LC/UV Vitamin D2 is a common supplement worldwide for the treatment of vitamin D deficiency. Consequently, assay recognition of 25OHD2 is critically important Treatment with vitamin D2 may not be accurately monitored with any of the three commercial assays studied 2013 Waters Corporation 41

Stato dell arte della Vitamina D Comparazione di diversi metodi di rilevazione: -RIA (Diasorin) -Diasorin Liaison (CLIA) -IDS ISYS (CLIA) Analisi di 170 pazienti -Abbott (CMIA) selezionati a caso -Siemens (CLIA) -Roche (ECLIA) -2 LC-MS/MS Diasorin R&D: Waters Acquity TQD Pathology Queensland: Waters Acquity XE premiere (Tecan) 2013 Waters Corporation 42

Stato dell arte della Vitamina D Calcoli fatti: Passing-Bablock Regression Y=a + bx Intrassay precision CCC= Concordance Correlation Coefficient Bias 2013 Waters Corporation 43

Stato dell arte della Vitamina D 2013 Waters Corporation 44

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Steroidi 2013 Waters Corporation 47

Steroidi in Immunoassay 2013 Waters Corporation 48

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Analisi del profilo steroideo utilizzando kit diagnostici CE-IVD 2013 Waters Corporation 50

Obiettivo: Valutazione del kit per analisi degli steroidi CHS su strumentazione ACQUITY UPLC/Xevo TQ-S Il metodo usato utilizza la preparazione del campione del kit diagnostico: Precipitazione proteica del siero + evaporazione del surnatante + ricostituzione Il kit presenta calibratori in matrice a 7 livelli (L1-L7) e 3 controlli di qualità sempre in matrice (QC1-QC3) Abbiamo utilizzato la colonna Waters ACQUITY UPLC HSS T3 1.8μm 1.0x100mm 2013 Waters Corporation 51

Pannelo steroideo Analiti misurabili nel PE MSMS Steroidi Kit Testosterone Cortisolo Corticosterone DHEA, Deidroepiandrosterone Progesterone 4-androsten-3,17-dione 11-deossicortisolo DHEAS, Deidroepiandrosterone solfato 17-alfa-idrossiprogesterone Aldosterone 2013 Waters Corporation 52

Produttività Grazie a Acquity UPLC la cromatografia è stata migliorata portando il tempo a 12 minuti di corsa da iniezione ad iniezione (aumentando produttività e salvando circa il 25% di fase mobile). Inoltre è stata migliorata la separazione tra i picchi del 11-deossicortisolo e del corticosterone. Corticosterone 11-deoxycortisol 2013 Waters Corporation 53

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Precisione Analyte Aldosterone Androstenedione Level Low Middle High Low Middle High Mean (ng/ml) 0.46 1.26 3.34 1.58 4.1 10.7 CV(%) 2.9 2.9 2.8 3.8 4.5 3.7 Analyte Corticosterone Cortisol Level Low Middle High Low Middle High Mean (ng/ml) 7.14 19.22 51.5 70.95 128.21 232.14 CV(%) 3.2 3 4.4 2.7 3.3 2.3 Analyte 11-deoxycortisol Dehydroepiandrosterone Level Low Middle High Low Middle High Mean (ng/ml) 1.49 4.05 10.66 7.74 19.68 52.98 CV(%) 3 4.2 4 5.4 5.7 3.8 Analyte Dehydroepiandrosterone sulfate Progesterone Level Low Middle High Low Middle High Mean (ng/ml) 1056.2 1485.7 2015.7 1.64 4.38 11.42 CV(%) 7.2 6.1 6.2 3.7 3.5 2.8 Il migliore valore di precisione (2.3% RSD) è stato ottenuto sul controllo di qualità alto del cortisolo e del testosterone (Q3). Il peggiore sul controllo di qualità basso (Q1) del DHEAS (7.25 RSD). Analyte 17á-hydroxyprogesterone Testosterone Level Low Middle High Low Middle High Mean (ng/ml) 1.86 5.34 14.65 2 3.52 5.46 CV(%) 3.2 2.7 2.4 3.3 3.3 2.3 2013 Waters Corporation 55

Precisione QC1 QC2 QC3 Steroid %RSD %RSD %RSD Aldosterone 3.73 2.50 2.39 Androstendione 1.78 1.26 0.84 Corticosterone 2.01 1.15 1.71 Cortisol 2.66 2.33 2.70 11-Deoxycortisol 2.88 4.74 2.49 DHEA 5.09 2.36 3.43 DHEAS 1.03 1.03 2.75 Progesterone 4.57 3.53 3.41 17-alpha hydroxyprogesterone 4.93 3.42 4.30 Testosterone 1.52 2.65 0.98 Questi dati ottenuti sono migliori di quanto dichiarato sul technical note della Perkin Elmer. 2013 Waters Corporation 56

Response Response Response Response Response Response Response Response Response Response Linearità Compound name: Aldosterone Correlation coefficient: r = 0.999677, r^2 = 0.999355 Calibration curve: 0.682043 * x + 0.00654052 Response type: Internal Std ( Ref 11 ), Area * ( IS Conc. / IS Area ) Curve type: Linear, Origin: Exclude, Weighting: 1/x, Axis trans: None Compound name: Androstendione Correlation coefficient: r = 0.999838, r^2 = 0.999675 Calibration curve: 0.605509 * x + 0.00262052 Response type: Internal Std ( Ref 12 ), Area * ( IS Conc. / IS Area ) Curve type: Linear, Origin: Exclude, Weighting: 1/x, Axis trans: None Compound name: Corticosterone Correlation coefficient: r = 0.999358, r^2 = 0.998717 Calibration curve: 0.188787 * x + -0.00745606 Response type: Internal Std ( Ref 13 ), Area * ( IS Conc. / IS Area ) Curve type: Linear, Origin: Exclude, Weighting: 1/x, Axis trans: None 10.0 30.0 20.0 30.0 20.0 5.0 10.0 10.0 0.0 0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 nmol/l Compound name: Cortisol Correlation coefficient: r = 0.999617, r^2 = 0.999234 Calibration curve: 0.0339563 * x + 0.00774359 Response type: Internal Std ( Ref 14 ), Area * ( IS Conc. / IS Area ) Curve type: Linear, Origin: Exclude, Weighting: 1/x, Axis trans: None 0.0 0.0 10.0 20.0 30.0 40.0 50.0 60.0 nmol/l Compound name: 11-Deoxycortisol Correlation coefficient: r = 0.999140, r^2 = 0.998281 Calibration curve: 0.247126 * x + 0.0126426 Response type: Internal Std ( Ref 15 ), Area * ( IS Conc. / IS Area ) Curve type: Linear, Origin: Exclude, Weighting: 1/x, Axis trans: None 0.0 0 25 50 75 100 125 150 175 nmol/l Compound name: DHEA Correlation coefficient: r = 0.997390, r^2 = 0.994787 Calibration curve: 0.00692836 * x + -0.00609587 Response type: Internal Std ( Ref 18 ), Area * ( IS Conc. / IS Area ) Curve type: Linear, Origin: Exclude, Weighting: 1/x, Axis trans: None 30.0 20.0 10.0 1.50 10.0 5.0 1.00 0.50 0.0 0 100 200 300 400 500 600 700 800 nmol/l 0.0 nmol/l 0.0 10.0 20.0 30.0 40.0 50.0 0.00 nmol/l 0 50 100 150 200 250 Compound name: DHEAS neg Correlation coefficient: r = 0.999556, r^2 = 0.999113 Calibration curve: 0.00199494 * x + 0.0129063 Response type: Internal Std ( Ref 16 ), Area * ( IS Conc. / IS Area ) Curve type: Linear, Origin: Exclude, Weighting: 1/x, Axis trans: None Compound name: Progesterone Compound name: 17-alpha hydroxyprogesterone Correlation coefficient: r = 0.998980, r^2 = 0.997962 Correlation coefficient: r = 0.998220, r^2 = 0.996442 Calibration curve: 1.04123 * x + -0.00904292 Calibration curve: 0.440317 * x + 0.00113332 Response type: Internal Std ( Ref 17 ), Area * ( IS Conc. / IS Area ) Response type: Internal Std ( Ref 18 ), Area * ( IS Conc. / IS Area ) Curve type: Linear, Origin: Exclude, Weighting: 1/x, Axis trans: NoneCurve type: Linear, Origin: Exclude, Weighting: 1/x, Axis trans: None Compound name: Testosterone Correlation coefficient: r = 0.999759, r^2 = 0.999518 Calibration curve: 0.926357 * x + 0.0148422 Response type: Internal Std ( Ref 19 ), Area * ( IS Conc. / IS Area ) Curve type: Linear, Origin: Exclude, Weighting: 1/x, Axis trans: None 15.0 10.0 5.0 80.0 60.0 40.0 20.0 30.0 20.0 10.0 20.0 10.0 0.0 nmol/l 0.0 nmol/l 0.0 nmol/l 0.0 nmol/l 0 2000 4000 6000 0.0 20.0 40.0 60.0 0.0 20.0 40.0 60.0 0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 2013 Waters Corporation 57

Linearità Sovrapposizione di 8 curve di calibrazione: Steroid Lowest cal (nmol/l) Highest Cal (nmol/l) r^2 Aldosterone 0.087 21.50 >0.999 Androstendione 0.290 63.60 >0.999 Corticosterone 0.844 190.00 >0.998 Cortisol 3.960 853.00 >0.999 11-Deoxycortisol 0.190 50.60 >0.998 DHEA 1.290 254.00 >0.994 DHEAS 34.300 7564.00 >0.999 Progesterone 0.364 77.20 >0.997 17-alpha hydroxyprogesterone 0.376 70.70 >0.996 Testosterone 0.113 27.80 >0.999 2013 Waters Corporation 58

Robustezza Nota: Risoluzione Cromatografica mantenuta! 2013 Waters Corporation 59

CAH in Serum 2013 Waters Corporation 60

CAH in DBS 2013 Waters Corporation 61

Grazie per l attenzione 2013 Waters Corporation 62

17-OHP analysis in dried blood spots (DBS) 2013 Waters Corporation 63

17-OHP analysis in DBS System: ACQUITY Xevo TQ MS Protocol: 2 x 3mm punches LLE ACN/acetone 20µL injection HSS C18 2.1x50mm 4.5min run time Calibration 3-400ng/mL 2013 Waters Corporation 64

Linearity 2013 Waters Corporation 65

Precision Intra-assay precision of QCs at three levels for 17-OHP (25, 50, 100ng/mL) (n=5) QCs obtained from CDC (Atlanta, GA) Low Mid High mean(ng/ml) 27.97 52.48 108.88 Std.Dev 0.77 1.79 5.35 %CV 2.76 3.41 4.91 2013 Waters Corporation 66

Precision Inter-assay precision of QCs at three levels for 17-OHP (25, 50, 100ng/mL) over five days Low Mid High mean(ng/ml) 27.5 53.8 99.6 Std.Dev 1.3 3.5 6.0 %CV 4.8 6.5 6.0 2013 Waters Corporation 67

Ion suppression profile 2013 Waters Corporation 68

Sensitivity LLOQ 3.27ng/mL Sample_20March09_004 Smooth(Mn,2x2) 3.27 ng/ml 100 17-OHP 1.71 398.02 F1:MRM of 6 channels,es+ 331.3 > 97 1.393e+004 % 0 1.45 1.58 1.871.91 2.04 2.14 2.19 2.25 2.37 2.42 2.48 min Sample_20March09_004 Smooth(Mn,2x2) 3.27 ng/ml 100 % 17-OHP 1.70 415.52 2.18 F1:MRM of 6 channels,es+ 331.3 > 109.1 2.391.387e+004 2.36 2.42 2.29 0 1.59 1.43 1.51 1.66 1.82 1.86 1.94 2.04 2.11 min Sample_20March09_004 Smooth(Mn,2x2) 3.27 ng/ml 100 d8-17-ohp 1.69 6560.95 F1:MRM of 6 channels,es+ 339.3 > 100 2.167e+005 % 0 min 2013 Waters Corporation 1.50 1.60 1.70 1.80 1.90 2.00 2.10 2.20 2.30 2.40 69

Plasmatic Metanephrines analysis with Off-line SPE 2013 Waters Corporation 70

Sample Preparation Matrix :Plasma WATERS Oasis WCX 1cc Cartridge 30mg 30µm 1ml ACN 1ml Buffered Water ph 6.8 1ml Plasma + 25µl Internal Standard Solution Wash with 2X 1 ml Buffered Water ph 6.8 an 1ml ACN Elute with 1 ml ACN + 2% FA 2013 Waters Corporation 71

Chromatograpghic Conditions Column: Waters Acquity HILIC 50 x 2.1 mm, 1.7 µm with in-line filter Waters Acquity UPLC TQD Sytem Flow Rate: 0.6 ml/min Injected Volume: 20 μl (full loop) Column Oven: 30 C Mobiles Phases: A = Water + 0.5% FA + 50mM AmFo B = Acetonitrile Total Run Time: 5 minutes Gradient: Temps (min.) %A %B Slope 0.0 5 95 1 2.0 30 70 6 3.0 30 70 6 3.5 5 95 6 2013 Waters Corporation 72

Calibration curve (can be performed in Extracted Water) Metanephrine: 0.125-5nM Normetanephrine: 0.25-10nM Metanephrine Normetanephrine 2013 Waters Corporation 73

Same Sample Positive Patient TQD Metanephrine 1.4 µg/l Normetanephrine 1.4 µg/l Metanephrine Normetanephrine 2013 Waters Corporation 74

Conclusion Quantification of Plasmatic Metanephrine and Normetanephrine using off-line SPE with UPLC-Quattro Premier XE or TQD Sensitivity is similar on Quattro Premier XE and TQD Run time set to 5 minutes in order to maximize the Analytical Column Life-Time (about 1000 injections so far) Excellent linearity across the analytical range LOQ < 0.1nM for Metanephrine and < 0.2nM for Normetanephrine This method has been validated internally and is used by Angers University Hospital as well as Lille University Hospital Cross Analysis of 10 samples Groningen University Hospital (On-line SPE) gave CV around 10% 2013 Waters Corporation 75