Applicazioni della biologia molecolare Il settore che ha maggiormente risentito dell impatto delle tecniche del DNA ricombinante è stato quello della medicina. 1)In questo campo la prima ricaduta è stata la disponibilità di grandi quantità di proteine terapeutiche come ad esempio l ormone della crescita umano. In passato era ricavato dalle ipofisi di cadaveri. Tale procedura richiedeva un elevato numero di ipofisi e comportava il rischio di malattie infettive. Grazie al clonaggio ed all espressione del gene in E. coli, è stato possibile ottenere ormone senza limitazioni quantitative e senza rischio di contrarre malattie. Da allora sono state ottenute numerose altre proteine terapeutiche. Sono già stati clonati in batteri alcuni polipeptidi, come l insulina umana, gli interferoni, il fattore VIII della coagulazione, in modo che possano essere espressi e purificati in grandi quantità. Alcuni geni sono stati mutati in vitro per produrre degli enzimi con maggiore stabilità di quelli wt. 2) Le tecniche di biologia molecolare, inoltre, permettono anche di ottenere sonde di DNA e RNA utili per determinare l identità di un microrganismo patogeno o la diagnosi prenatale di una patologia ereditaria. Oltre 500 malattie ereditarie (come, ad esempio, l anemia falciforme) dipendono da mutazioni di un singolo gene. Oltre 40 di queste malattie possono essere rivelate facilmente durante lo sviluppo del feto. 1
Principali Malattie Metaboliche Ereditarie Iperfenilalaninemie ( PKU) Leucinosi Sindromi IperTirosinemiche Omocistinuria Difetti del Ciclo Dell'Urea Difetti dell'ossidazione degli Acidi Grassi Malattie Perissosomiali Acidosi Lattiche Morbo di Wilson Morbo di Gaucher Glicogenosi Mucopolisaccaridosi Deficit di Glicina N-metiltransferasi 3) Il Citocromo P450 ricombinante viene utilizzato per determinare come un nuovo farmaco venga metabolizzato e se nel processo vengano sintetizzati metaboliti tossici. 4) Gli acidi nucleici possono anche essere usati direttamente come farmaci: si sta sperimentando l uso di molecole di DNA o RNA antisenso per diminuire l espressione di determinati geni. 2
5) In altri casi la somministrazione di acidi nucleici è impiegata per cercare di correggere gli effetti di mutazioni patogene (terapia genica) o per ripristinare sequenze geniche originali. 6) Nella ricerca di base tutte le tecniche di biologia molecolare hanno rivoluzionato le conoscenze della struttura e funzione dei geni. Gli oncogeni (cioè i geni coinvolti nello sviluppo dei tumori) sono stati scoperti grazie all applicazione di tecniche di biologia molecolare. 7) Nuove vie per la vaccinazione: un protocollo di vaccinazione efficace porta alla generazione di una risposta immunitaria umorale e/o cellulo mediata. I vaccini convenzionali sono costituiti da ceppi virulenti inattivati o da ceppi vivi attenuati, ma il loro uso non è esente da problemi. Molti virus, infatti, tra i quali quelli dell epatite B, non si sono ben adattati alla propagazione in cellule in coltura infettate, con la conseguenza che non se ne ottengono mai stock ad alto titolo. Inoltre, utilizzando vaccini costituiti da virus inattivati si corre il rischio di provocare patologie dovute alla presenza, nell inoculo, di virus competenti per la replicazione. 3
I ceppi virali attenuati, infine, sono potenzialmente in grado di revertire ad un fenotipo virulento in seguito a fenomeni di ricombinazione che avvengono nell organismo dei soggetti vaccinati. Le tecnologie del DNA ricombinante possono offrire alcune soluzioni a tutti questi inconvenienti. Vista la facilità con la quale è possibile esprimere geni eterologhi in sistemi sia procariotici che eucariotici, la produzione di grandi quantità di materiale biologico immunogeno purificato da utilizzare per vaccinazioni è relativamente semplice. Sono stati clonati ed espressi tutta una serie di geni rilevanti dal punto di vista immunologico, ma, rispetto alle attese, i risultati delle loro applicazioni sono stati piuttosto deludenti. Bisogna sottolineare che non è poi così sorprendente che i vaccini basati su singole subunità di un agente patogeno non generino la risposta immunitaria desiderata, dal momento che non rappresentano l antigene autentico, ma solo una piccola parte di esso. Il vaccino per l epatite B disponibile in commercio rappresenta un eccezione visto che la sovraespressione dell antigene di superficie virale in lievito porta alla formazione di particelle simili al virus vero e proprio. 4
Le proteine come farmaci: Una delle prime applicazioni delle tecniche di manipolazione genica è stata la produzione in microrganismi di proteine umane di valore terapeutico (ormone della crescita e insulina). L approccio ricombinante consentiva di ottenere grandi quantità di proteine sicure. La prima generazione di farmaci proteici era rappresentata da copie esatte delle molecole presenti nell organismo umano, ma grazie alle tecniche di ingegnerizzazione delle proteine, sono state prodotte molecole di seconda generazione con caratteristiche terapeutiche migliori (più facilmente somministrabili all organismo, con minori effetti collaterali, ). In seguito si è passati all impiego di piante e animali come bioreattori. L espressione di composti ricombinanti in cellule animali offre numerosi vantaggi a cominciare dalla possibilità di ottenere modificazioni post-traduzionali corrette, ma le colture di cellule animali su larga scala sono piuttosto costose. Si sono prodotti, perciò, animali transgenici per ricavarne dai fluidi biologici (latte, siero, albume delle uova, ) grandi quantità di proteine ricombinanti. Le piante rappresentano una valida alternativa agli animali transgenici in quanto possono essere cresciute con una spesa minore e la coltivazione su larga scala risulta relativamente semplice. Le cellule vegetali, inoltre, hanno delle vie di modificazione post-traduzionali simili a quelle degli animali. 5
La terapia genica: con il termine terapia genica si intende qualunque protocollo terapeutico che comporti una modificazione dell informazione genetica delle cellule del paziente. Si cerca, cioè, di correggere il difetto genetico con un transgene terapeutico in grado di curare il soggetto ricevente. Il trasferimento genico può essere effettuato in cellule in coltura che poi vengono reintrodotte nel paziente (approccio ex vivo) oppure può avvenire direttamente sul soggetto in vivo. La terapia genica è indicata sia per curare malattie causate dal DNA dello stesso paziente (malattie ereditarie o tumori) sia per curare patologie infettive. Le strategie possibili includono: 1) terapia per aggiunta genica, quando il DNA esogeno viene aggiunto alla cellula per rimpiazzare il prodotto genico mancante. 2) Gene targeting (ovvero la sostituzione mirata di un segmento di genoma endogeno con un segmento omologo di DNA esogeno), per correggere alleli mutanti. 3) Inibizione genica (es RNAi) 4) Rimozione mirata di specifiche cellule 6
Animali transgenici come modello delle patologie umane: la manipolazione genetica degli animali ha rivoluzionato le conoscenze nel campo della biologia consentendo l analisi dell espressione e della funzione dei geni a livello di interi organismi superiori. Le tecniche di trasferimento genico possono essere utilizzate per produrre animali transgenici, nei quali ogni cellula porta nuove informazioni genetiche, così come mutanti specifici i cui genomi portano modificazioni predeterminate. 7
L organismo animale nella sua interezza è il modello sperimentale più adatto per studiare la funzione dei geni. L unico modo per ottenere la modificazione della linea germinale negli animali è introdurre il DNA esogeno in cellule totipotenti ad uno stadio dello sviluppo antecedente la formazione della linea germinale. Nella maggioranza dei casi, questo implica l introduzione di DNA direttamente nell oocita fecondato, nella cellula uovo o in embrioni a stadi precoci. Nei topi è possibile inoltre utilizzare cellule staminali embrionali (cellule ES), che sono derivate da embrioni reimpianto che possono dare origine a tutti i tipi di tessuti durante lo sviluppo dell animale (linea germinale compresa purchè vengano introdotte nell embrione ricevente nel corretto stadio di sviluppo). Le cellule ES sono anche particolarmente adatte ad effettuare la ricombinazione omologa, una tecnica che consente di realizzare il gene targeting, ovvero la sostituzione mirata di un segmento di genoma endogeno con un segmento omologo di DNA esogeno. 8
Il gene targeting può servire sia a sostituire geni endogeni con una copia non funzionale (un allele nullo) sia per introdurre piccoli cambiamenti sitospecifici, consentendo in entrambi i casi l analisi della funzione del gene di interesse. Questa stessa tecnica può essere utilizzata per il fine opposto, cioè per sostituire l allele mutato con una sua copia funzionale. MANIPOLAZIONE GENETICA IN MAMMIFERI: Metodi per la produzione/generazione di topi transgenici Mammiferi geneticamente modificati sono stati utilizzati non solo per studiare la funzione e la regolazione dei geni ma anche come bioreattori per la produzione su larga scala di proteine ricombinanti anche di importanza farmaceutica (per esempio facendoli secernere nel latte). Sono stati messi a punto svariati metodi per la transfezione delle linee germinali, che richiedono tutti la rimozione di cellule uovo fecondate o di embrioni precoci da madri donatrici, la loro coltivazione per breve tempo in vitro e la successiva reintroduzione in madri adottive, dove il loro sviluppo prosegue fino al termine. 9
1) Microiniezione nel pronucleo: Subito dopo la fecondazione, il nucleo delle cellule uovo (pronucleo femminile) e quello dello spermatozoo (pronucleo maschile) sono distinti l uno dall altro. La scelta del pronucleo femminile come bersaglio preferenziale della microiniezione deriva dalle sue maggiori dimensioni. Vengono di norma iniettati attraverso un ago sottile circa 2 pl (picolitri) di soluzione contenente DNA, mentre l oocita è mantenuto in posizione con la punta di una pipetta alla quale si applica una leggera suzione. Gli embrioni iniettati vengono coltivati in vitro fino allo stadio di morula e vengono poi trasferiti in madri adottive pseudogravide. 10
Il DNA esogeno si può integrare immediatamente o, meno comunemente, può rimanere libero nelle cellule per una o più divisioni; l animale quindi risulterà transgenico o chimerico, rispettivamente, per quanto riguarda l inserzione del transgene. La tecnica è abbastanza affidabile sebbene abbia un efficienza variabile (solo il 5-40% dei topi che nascono dagli oociti manipolati contiene effettivamente il transgene). In ogni caso, una volta che il transgene si è integrato nella linea germinale del topo fondatore, viene trasmesso alla progenie stabilmente per molte generazioni. L integrazione del DNA esogeno è casuale e le molecole di DNA esogeno tendono a formare dei multimeri prima dell integrazione. 2) Retrovirus ricombinanti: i retrovirus sono uno strumento naturale per l introduzione stabile del DNA nel genoma di cellule animali e sono in grado di infettare embrioni precoci e cellule ES. I vettori ricombinanti da essi derivati possono essere impiegati, quindi, per trasformare le cellule delle linee germinali. 11
Un notevole vantaggio di questa tecnica è che il provirus retrovirale si integra in singola copia, senza alterare il DNA genomico fiancheggiante. Tra gli svantaggi legati all uso di retrovirus vi sono: la quantità limitata di DNA esogeno che può essere veicolata con il virus e la possibile influenza degli elementi regolatori virali sull espressione dei geni circostanti. 3) Trasfezione di cellule ES: le cellule ES possono essere coltivate facilmente con passaggi seriali come una qualsiasi altra linea cellulare, il DNA, perciò, può essere introdotto per trasfezione o trasduzione virale e le cellule trasformate possono essere selezionate mediante marcatori abituali. Questo rappresenta un vantaggio significativo dal momento che non esistono procedure semplici per selezionare gli oociti o gli embrioni che abbiano integrato il DNA esogeno, tanto che di norma il DNA di ciascun topo potenzialmente transgenico deve essere analizzato mediante ibridazione Southern blot o PCR, per confermare l integrazione del transgene. 12
Le cellule ES sono inoltre particolarmente efficienti nella ricombinazione omologa e quindi a seconda di come viene predisposto il vettore, il DNA introdotto può integrarsi casualmente nel genoma ovvero può andare a sostituire uno specifico locus cromosomico. Le cellule ES vengono introdotte nel blastocele di un embrione ricevente allo stadio di blastocisti, si inseriscono nella massa cellulare interna mescolandosi con le altre cellule. Si forma un embrione chimerico che comprende cellule di origine diversa. Il contributo delle cellule ES alla linea germinale può essere confermato avvalendosi di appropriati marcatori fenotipici. La maggioranza di cellule ES comunemente utilizzate deriva dal ceppo di topo-129 caratterizzato dal pelo di colore bianco (dominante). Una strategia che viene spesso seguita è quella di utilizzare come embrioni riceventi quelli provenienti dal ceppo C57BL/6J, che invece è di colore nero (recessivo). La colonizzazione dell embrione ricevente da parte di cellule ES ricombinanti genererà quindi delle chimere a macchie nere e bianche. Se le cellule ES introdotte hanno contribuito anche alla linea germinale, incrociando maschi chimerici con femmine nere verrà alla luce una generazione di eterozigoti transgenici di colore bianco, confermando la trasmissione germinale del DNA esogeno. 13
RNAi: un RNA antisenso (RNAi) è caratterizzato dalla sequenza complementare a un dato mrna. La presenza nella stessa cellula di entrambe le molecole di RNA può portare alla formazione di una doppia elica RNA-RNA stabile (un duplex) sirna, che a sua volta può interferire con l espressione genica. La cellula, in presenza di molecole di sirna, risponde distruggendo le molecole di mrna complementari alle sirna. L RNA antisenso viene utilizzato come sistema endogeno di regolazione in un certo numero di procarioti e di alcuni eucarioti. L inibizione transiente di geni endogeni può essere ottenuta iniettando nelle cellule RNA specifici o oligonucleotidi antisenso. 14
Per ottenere un inibizione più duratura è necessario trasformare le cellule con dei costrutti antisenso (nei quali il cdna è invertito rispetto al promotore), in modo da ottenere una produzione continua di RNA antisenso. Dalla scoperta della tecnica, i costrutti antisenso sono stati utilizzati ampiamente per inibire l espressione genica sia in animali sia in piante geneticamente modificati. L efficacia della metodica è molto variabile. Ponendo i costrutti antisenso sotto un promotore inducibile, inoltre, è possibile ottenere una regolazione genica condizionale. Applicazioni dell RNAi: in modelli in vitro (colture cellulari) è stato utilizzato per identificare la funzione di geni e proteine. In ambito terapeutico l applicazione dell RNAi potrebbe fornire un metodo per silenziare geni che non si desidera vengano espressi. L mrna potrebbe essere un bersaglio promettente nell intervento terapeutico. L espressione di una proteina indesiderata potrebbe essere evitata senza alterare il patrimonio genetico della cellula. 15