L esame del liquido seminale La storia del progresso umano è costellata di eventi casuali e di scoperte accidentali. Gli scienziati esplorano mondi sconosciuti e quindi è normale che commettano degli errori; questi tuttavia non rappresentano un aspetto negativo della ricerca scientifica, anzi, molto spesso sono proprio i fallimenti che costituiscono gli stimoli al progresso della scienza. Nella comprensione dei processi fisiologici, ad esempio, sono tanti i casi eclatanti da annoverare; nel campo della riproduzione, un'eccezionale scoperta avvenuta casualmente nella seconda metà del XVII sec. sconvolse tutte le idee fino ad allora acquisite nel campo della riproduzione: l identificazione degli spermatozoi. Sono trascorsi più di 300 anni (1677) da quando il microscopista Antoni Van Leeuwenhoek, in seguito alla visita dello studente Ham di Leyda, analizzò un campione di liquido seminale di un uomo affetto da gonorrea, individuando all interno di esso alcune strane creature viventi, da lui stesso definite col termine di Animaliculi. Nei successivi 150 anni, furono numerosi i tentativi volti a provare l importanza di tali animaliculi ai fini della fecondazione; ad esempio, un grande impulso alla comprensione di tale fenomeno si ebbe con gli studi di Prevost e Dumas, i quali stabilirono un nesso di relazione tra presenza di spermatozoi e fecondazione della cellula uovo. La svolta decisiva però avvenne quando Hertwig nel 1875, dimostrò la penetrazione dello spermatozoo nell uovo e l unione di quest ultimo con il nucleo spermatico, segnando la fine dei paradigmi embriologici fondati sulla teoria ovista secondo la quale gli esseri viventi potevano riprodursi esclusivamente attraverso le uova. Da questo momento, l osservazione delle caratteristiche funzionali degli spermatozoi cominciarono ad assumere notevole rilevanza clinico-scientifico ai fini della valutazione della fertilità maschile, aprendo la strada alla branca dell andrologia che studia e valuta la qualità del liquido seminale: la seminologia.
L analisi del liquido seminale, o spermiogramma, è un potente strumento laboratoristico che rappresenta il punto di partenza per un corretto inquadramento diagnostico e terapeutico del maschio infertile. È un esame ultraspecialistico che deve essere svolto esclusivamente da personale esperto e specializzato, in modo da ridurre il rischio della soggettività dell operatore che potrebbe portare a risultati fuorvianti. È di fondamentale importanza, quindi, che vi sia una standardizzazione delle procedure necessarie per l esame del liquido seminale umano al fine di rendere più semplice il confronto fra i laboratori di tutto il mondo. Per tale motivo, negli ultimi trent anni sono state redatte a cura dell Organizzazione Mondiale della Sanità (OMS), 5 edizioni del manuale dell esame del liquido seminale, in cui sono elencate e discusse le norme di buona prassi necessarie per una corretta analisi, spiegando approfonditamente il razionale dell impiego di una particolare tecnica nei casi in cui ci siano più metodi di analisi a disposizione per quel singolo parametro. A differenza di quel che si può immaginare, l analisi del liquido seminale non fornisce una misura diretta della fertilità di un individuo; il riscontro di una condizione di normalità dei parametri misurati in un singolo test non implica necessariamente una fertilità regolare, ma esclude che l infertilità sia correlabile a quel fattore. A questo si deve aggiungere che molte delle caratteristiche funzionali che contribuiscono a definire la fertilità del maschio non sono ancora oggi ben conosciute ed inoltre. Pertanto, si possono avere gravidanze con liquidi seminali definiti patologici, e non averne con eiaculati definiti normali. Dal punto di vista procedurale, lo spermiogramma si suddivide, come qualsiasi indagine laboratoriale, in tre momenti: - Fase pre-analitica - Fase analitica - Fase post-analitica
Nella fase pre-analitica, l attenzione dell operatore è volta ad appurare che il paziente abbia rispettato le norme di buona prassi comunicate precedentemente per la raccolta del liquido seminale, escludendo che le possibili variabili del campionamento possano influire negativamente sulla valutazione dell esame. Per una corretta standardizzazione, il paziente deve osservare un periodo di astinenza sessuale (inteso come mancanza di eiaculazione) compreso tra 3 5 gg (tolleranza: non inferiore a 2 e non superiore a 7 giorni). Un mancato rispetto del periodo previsto può incidere negativamente sulla conta spermatozoaria e sul volume dell eiaculato qualora il paziente abbia osservato un astinenza troppo breve, o un inadeguata valutazione della morfologia e della motilità provocata da un eccessivo stazionamento epididimario qualora l astinenza si protragga per un periodo superiore a quello indicato. Il liquido deve essere raccolto mediante masturbazione in un contenitore sterile per urinocoltura; è quindi sconsigliato il campionamento mediante coito interrotto in quanto l ambiente acido vaginale può danneggiare gli spermatozoi o per mezzo di profilattici in quanto le sostanze spermicida contenute all interno di esso hanno un azione citotossica (eccezion fatta per speciali profilattici anatossici, disponibili in commercio). E sempre consigliabile che la raccolta sia compiuta nella stessa struttura dove sarà analizzato il campione, in una stanza ubicata nelle vicinanze del laboratorio. Per esigenze particolari, la raccolta può essere effettuata a casa e il campione consegnato entro 30 minuti, avendo cura di tenerlo in posizione verticale ed evitando escursioni termiche durante il trasporto. Di fondamentale importanza è inoltre la segnalazione di eventuali perdite di frazioni dell eiaculato durante l orgasmo; se il campione non è stato raccolto interamente, il risultato finale non rispecchia la quantità reale di cellule prodotta effettivamente dal testicolo, soprattutto se la parte persa dell eiaculato è quella iniziale, frazione ricca di spermatozoi. Tutte le informazioni comunicate dal paziente devono essere registrate su un modulo di lavoro, avendo cura di annotare oltre ai dati anagrafici e alle indicazioni sul
rispetto delle norme appena descritte, anche eventuali terapie farmacologiche o eventi febbrili accaduti nei tre mesi precedenti all analisi che potrebbero alterare i parametri seminali. La fase analitica rappresenta dal punto di vista metodologico l indagine reale in cui si valuta effettivamente la qualità seminale e consta di due momenti: - valutazione macroscopica, in cui esaminate le 5 caratteristiche fisiche che contraddistinguono il plasma seminale, ossia volume, ph e caratteristiche reologiche quali aspetto, fluidificazione e viscosità - valutazione microscopica, in cui si valuta la popolazione spermatozoaria e la componente agametica. Sebbene lo spermiogramma consente di ottenere informazioni fondamentali sullo status della funzione testicolare attraverso la determinazione qualitativa e quantitativa della componente gametica, si possono oltretutto ricavare importanti indicazioni sulla funzionalità dell intero apparato riproduttivo maschile. La composizione dell eiaculato, infatti, è il risultato dalla commistione dei secreti delle ghiandole accessorie, pertanto la valutazione dell eiaculato in toto definisce la funzionalità delle vescicole seminali (70% circa del plasma seminale), prostata (25% circa), ghiandole bulbo uretrali (1% circa) ed epididimi (5% circa) oltre che la pervietà delle vie genitali. Il liquido seminale espulso dalle vie genitali maschili, inizialmente appare in forma di coagulo che arriva a sciogliersi dopo circa 15 minuti dalla consegna per effetto della fluidificazione. Tale cambiamento fisico è regolato dall azione delle proteasi prostatiche, tra le quali il PSA, che inibiscono gli enzimi prodotti dalle vescichette seminali responsabili del mantenimento dello stato semisolido del campione. Valutazione macroscopica La fluidificazione è valutata sia livello macroscopico che microscopico. Nel primo caso, l avvenuta fluidificazione è rilevata se un campione è omogeneo e acquoso, senza coaguli. Microscopicamente, un campione non liquefatto mostra una rete
filamentosa in cui sono intrappolati gli spermatozoi che risultano immotili. Se dopo 60 minuti la liquefazione non è completa, si parla di liquefazione ritardata. La prima caratteristica macroscopica di un campione seminale che risalta agli occhi dell operatore è però sicuramente l aspetto. L aspetto fisiologico di un campione è rilevato attraverso la semplice osservazione visiva e dovrebbe corrispondere ad una composizione omogenea, grigio-opalescente. Mediante questa prima valutazione, possiamo avere un idea della quantità della componente cellulare (gametica e non) che contraddistingue il campione; pertanto è possibile definire una scala da opalescente (ricco di cellule) ad acquoso (scarso dal punto di vista della concentrazione), ma in alcuni casi si riscontrano colorazioni atipiche come ad esempio rosso-bruno in caso di presenza di emazie (emospermia), o giallo in pazienti con forte presenza di leucociti (leucocitospermia) o ittero o che assumono alcune vitamine o farmaci. La misura volumetrica del campione, in associazione con altri parametri quali ph, fluidificazione e conta nemaspermica, offre un importante informazione sulla funzionalità delle ghiandole accessorie che partecipano alla composizione dell eiaculato e sulle pervietà delle vie genitali; è verosimile infatti che campioni con basso volume (ipoposia), qualora fosse esclusa una raccolta non completa, concomitante ad un ph tendente a valori acidi, assenza di coagulo e mancanza o ridotta concentrazione di spermatozoi, potrebbe essere indice di una patologia ostruttiva dei dotti eiaculatori o assenza bilaterale congenita dei vasi deferenti, una condizione in cui le vescicole seminali sono scarsamente sviluppate. Esistono, inoltre, diverse altre condizioni che comportano ipoposia come ad esempio: eiaculazione retrograda parziale, deficit androgenico ma anche condizioni fisiologiche come nel caso di un astinenza sessuale ridotta. Il valore minimo di riferimento del volume seminale che consente di accertare una condizione di ipoposia è 1.5 ml (5 percentile).
Come accade per il volume, anche il ph seminale è influenzato dal bilanciamento del secreto alcalino delle vescicole seminali e acido della prostata. Il ph dovrebbe essere misurato, dopo la fluidificazione ad un tempo costante, preferibilmente dopo 30 minuti attraverso l ausilio di indicatori di ph (cartine al tornasole) con range compreso tra 6.0 e 10.0. La soglia del valore minimo del ph seminale è 7.2, mentre non è possibile considerare un limite superiore in quanto esistono pochi studi scientifici sul ph seminale di uomini fertili che possano dimostrare con assoluta certezza il range fisiologico, per questo motivo l indicazione che appariva sulle edizioni precedenti del manuale del OMS corrispondente ad 8.0 è caduta in disuso. La viscosità è valutata facendo gocciolare il liquido seminale da una pipetta con apertura ampia (1.5 mm di diametro) osservando la lunghezza dell eventuale filamento prodotto dai campioni viscosi. La viscosità può essere considerata con le dizioni: diminuita, normale (in tal caso piccole gocce separate cadono per gravità) aumentata (la goccia formerà in questo caso un filamento lungo, il quale, a seconda della lunghezza del filamento prodotto sarà valutato in gradi di diversa rilevanza). Sebbene alcuni autori abbiano attribuito l iperviscosità alle infezioni delle vie genitali, non esistono evidenze che supportano questa tesi. Valutazione microscopica L analisi microscopica è eseguita con l ausilio di un microscopio a contrasto di fase per la valutazione della concentrazione e della motilità degli spermatozoi che si esegue su preparati a fresco non colorati, con un ingrandimento di 100X o 200X e di camera emocitometriche per la conta (Makler o Neubauer improved). Per l analisi citomorfologica, l ingrandimento previsto è 1000X e non occorre il contrasto di fase dal momento che i preparati sono preventivamente contrastati con coloranti appositi che permettono di differenziare i vari compartimenti cellulari. Prima di descrivere in dettaglio ciascuno dei tre parametri seminali, ossia concentrazione, motilità e morfologia, è opportuno precisare che i risultati sono
influenzati dalla varietà biologica intraindividuale, per cui, al fine di ottenere informazioni valide, è consigliabile basarsi sulla valutazione di due o tre campioni piuttosto che su un singolo esame. La concentrazione degli spermatozoi è la misura del numero di cellule espresso per milioni/millilitro, diversamente dalla conta totale degli spermatozoi che rappresenta invece il prodotto della concentrazione per il volume dell intero eiaculato. Anche se la concentrazione non rappresenta un indice specifico della funzione testicolare in quanto è direttamente influenzata dal volume delle secrezioni provenienti dalle vescicole seminali e dalla prostata, essa è un fondamentale dato che correlata con la percentuale di fecondazione e gravidanza. Il limite inferiore di riferimento per la concentrazione è 15 milioni di spermatozoi per ml (5 percentile) mentre per il numero totale di spermatozoi, 39 milioni per eiaculato (5 percentile). Valori superiori a tali limiti stabiliscono la condizione fisiologica di normozoospermia. Se non si rilevano spermatozoi nelle preparazioni a fresco replicate, si può sospettare l azoospermia, una condizione che può essere accertata solo dopo centrifugazione ed analisi del pellet. Se si riscontrano pochi spermatozoi nel pellet, si parla di criptozoospermia. Valori inferiori a 15 milioni/ml di spermatozoi o 39 milioni per eiaculato indicano casi di oligozoospermia. Motilità Un efficiente grado di motilità nemaspermica è indispensabile affinchè possa avvenire la fertilizzazione dell ovocita, di conseguenza si può dedurre l importanza di una corretta valutazione. Molteplici fattori, sia intrinseci che estrinseci, sono in grado di influire sulla qualità del movimento; ad esempio la struttura del flagello e l attività enzimatica della dineina sono intrinsecamente correlate alle caratteristiche funzionali dei nemaspermi, mentre la composizione biochimica del mezzo extracellulare in cui si trova lo
spermatozoo (plasma seminale, muco cervicale, etc) è di natura prettamente estrinseca. Nonostante l avvento negli ultimi anni dei sistemi di analisi computerizzata (CASA) l osservazione diretta da parte di un operatore specializzato continua ad essere il metodo più utilizzato per la valutazione della motilità. La motilità degli spermatozoi viene valutata classificando qualitativamente il movimento di ciascuno spermatozoo; a seconda della velocità e della direzione, le tipologie prevedono una nomenclatura che spazia da motilità rapida progressiva ad immotile, passando per tipologie di movimento a lenta velocità o addirittura in situ. L analisi inizia dopo la fluidificazione del campione, attraverso l ausilio di una camera di Makler o di un vetrino portaoggetti. La motilità degli spermatozoi è classificata, più nello specifico, nel seguente modo: - Rapida progressiva: movimento rettilineo dello spermatozoo, senza ondulazioni della coda, ad una velocità superiore a 25 µm/s. - Lento progressivo: movimento rettilineo dello spermatozoo, con ondulazioni della coda, ad una velocità inferiore rispetto al rapido progressivo. - Non progressiva (in situ): racchiude tutti gli altri tipi di motilità in cui non c è un movimento rettilineo dello spermatozoo ma un movimento circolare oppure uno spostamento esclusivo della testa o della coda. - Immobili: nessun movimento La distinzione tra motilità progressiva rapida o lenta possono essere incluse in un unica categoria, la motilità progressiva. I limiti di riferimento stabiliti nell ultima versione del manuale OMS sono per la motilità totale ( progressiva e non) 40% (5 percentile), per la motilità progressiva 32% (5 percentile). Per valori di motilità progressiva inferiori al 32% si parla di astenozoospermia. Una ridotta motilità può essere dovuta a molteplici fenomeni di natura patologica quali: traumi, varicocele infiammazioni (es. orchiti), ipogonadismo, criptorchidismo,
alterata spermatogenesi, presenza di anticorpi antispermatozoi, abuso di alcol o sostanze stupefacenti. Test di vitalità Qualora dovesse essere riscontrata una percentuale di forme motili totali inferiori al cut-off stabilito (40%), si abbina alla valutazione della motilità il test della vitalità. Questo ulteriore dato è fondamentale per comprendere a fondo le ragioni di una elevata presenza di forme immotili, le quali riflettono una problematica di natura necrotica o una difficoltà di natura energetica. Il test della vitalità, dunque, stima l integrità dello spermatozoo distinguendo le cellule con membrana cellulare danneggiata che lascia passare alcuni coloranti dalle cellule intatte che non risulteranno colorate. Tra le diverse colorazioni impiegate, la colorazione eosina/nigrosina è quella comunemente utilizzata nei laboratori di semiologia. Quando la percentuale di spermatozoi vivi è inferiore al 58%, si parla di una condizione di necrozoospermia. Morfologia La valutazione morfologica degli spermatozoi viene eseguita mediante specifiche colorazioni istologiche (Papanicolaou, Giemsa, Shorr o Diff-Quik). Utilizzando un microscopio ottico in campo chiaro ad ingrandimento 1000x ad immersione ad olio, si potrà vedere la testa dello spermatozoo colorata di blu chiaro nella regione acrosomiale e blu scuro nella regione post-acrosomiale. La valutazione morfologica distingue due categorie basate sull osservazione dei tre domini che compongono lo spermatozoo (testa, tratto intermedio o collo e coda): - Forme tipiche - Forme atipiche
Uno spermatozoo tipico presenta una testa liscia, con contorni regolari e di forma ovale. Dovremmo distinguere nettamente una zona acrosomiale ben definita, che copre il 40-70% dell area della testa,dove al suo interno si posso o meno trovare la presenza di massimo due vacuoli che non occupano più del 20% della testa dello spermatozoo. L altra regione che dovremmo distinguere è quella post acrosomiale priva di vacuoli. Il tratto intermedio è sottile, regolare e della stessa lunghezza della testa. La coda dovrebbe essere più sottile del tratto intermedio con un calibro uniforme lungo tutta la sua lunghezza. Uno spermatozoo atipico può presentare difetti di testa (macrocefalia, microcefalia, assenza di acrosoma, a punta, vacuolata etc), difetti del tratto intermedio (collo angolato sottile etc) e difetti della coda (code doppie, attorcigliate etc) Lo spermatozoo è caratterizzato da molte forme diverse fra di loro e per molti è ancora difficile capire qual è la forma normale e quale quella alterata. Gli spermatozoi sono le cellule più specie specifica, cambiano di forma da una specie all altra e se uno è un bravo seminologo può riconoscere dallo spermatozoo la specie di appartenenza. La nostra specie è quella che ha la spermatogenesi più imperfetta, quella per cui è normale trovare molte cellule immobili ed un elevato numero di cellule atipiche. Difetti nella spermatogenesi e alcune patologie epidimiarie sono associate ad un aumento di spermatozoi atipici. Il limite inferiore per le forme normali è del 4% (5 percentile, 95% IC 3.0-4.0). Al di sotto di tale limite si parla di teratozoospermia. Conta delle cellule non nemaspermiche Analogamente alla conta degli spermatozoi, saranno valutati simultaneamente anche cellule non nemaspermiche, la cui presenza nel liquido seminale può essere indicativa di danno testicolare (cellule germinali immature), di patologie dei dotti efferenti
(epitelio ciliato) o di infiammazione delle ghiandole accessorie (leucociti). La valutazione dei leucociti può essere approfondita mediante striscio citologico per evitare di confonderli con spermatidi e spermatociti o mediante l utilizzo di kit che valutano l attività perossidasica. Qualora dovessero essere riscontrati spermatozoi agglutinati tramite aderenza testatesta, coda-coda o in forma mista, deve essere valutata l eventuale presenza di anticorpi antispermatozoo. Gli anticorpi antispermatozoo (ASA) del liquido seminale appartengono esclusivamente a due classi di immunoglobuline: IgA e IgG. Le metodiche utilizzate per evidenziare la presenza di ASA sono il MAR test o Immunobead. Nonostante i numerosi studi, la gestione clinica del paziente infertile di natura immunologica rimane ancora oggi controversa. Test specialistici Nei casi di infertilità in cui il quadro seminologico accompagnato ad indagini cliniche ed ecografiche non consente di inquadrare la problematica che impedisce il concepimento, è possibile un approfondimento diagnostico che prevede la valutazione della frammentazione del DNA spermatico, saggi biochimici e la misura dello stress ossidativo. Esame computerizzato del liquido seminale Da circa 30 anni, sono in commercio diversi sistemi informatizzati di supporto all operatore per l analisi del liquido seminale. Nell insieme tali software prendono il nome di CASA (Computer Aided Sperm Analysis). Tali strumentazioni però, seppur nate con l intento di limitare la soggettività dell operatore, in alcuni casi sono stati intesi come metodi sostitutivi al tradizionale ruolo del seminologo. In realtà, i sistemi informatici non possono prescindere dalla presenza di un analista esperto che deve essere in grado di preparare il campione biologico, di catturare dei frame specifici del campione evitando zone a bassa o alta densità cellulare e soprattutto valutare il risultato finale facendo attenzione ai possibili errori strumentali sistematici. Nonostante la disponibilità di innovativi
sistemi informatici, la presenza dell operatore è tuttavia indispensabile per l interpretazione del dato. Per esempio, detriti della stessa dimensione delle teste di spermatozoi possono essere erroneamente indicati come tali, o la valutazione della motilità in cui spermatozoi con un movimento in situ che disegnano una traiettoria con un raggio troppo ampio possono essere confusi come progressivi. Il vantaggio nell utilizzo del computer è però garantito da una la possibilità di effettuare indagini simultanee muti parametriche. Dalla traiettoria del movimento cellulare, è possibile conoscere ulteriori dettagli dei parametri cinetici definendo in modo più preciso la qualità del movimento. È possibile quindi misurare: - VCL, velocità curvilinea (µm/s). Velocità media della testa di uno spermatozoo lungo la sua traiettoria curvilinea come percepito in due dimensioni al microscopio. Una misura del vigore della cellula. - VSL, velocità (µm/s) in linea retta (rettilinea). Velocità media della testa di uno spermatozoo lungo la linea retta dalla sua posizione di partenza all ultima. - VAP, velocita media della traiettoria (µm/s). Velocita media della testa di uno spermatozoo lungo la sua traiettoria media. - ALH, ampiezza dello spostamento laterale della testa (µm). Grandezza dello spostamento laterale della testa di uno spermatozoo. - LIN, linearità. La linearità di una traiettoria curvilinea VSL/VCL. - WOB, oscillazione. Una misura dell oscillazione della reale traiettoria lungo la traiettoria media, VAP/VCL. - STR, rettilineità. Linearità della traiettoria media, VSL/VAP. - BCF, frequenza dei battiti (Hz). La frequenza media in cui la traiettoria curvilinea interseca la traiettoria media. - MAD, spostamento angolare medio (gradi). I valori assoluti della media dell angolo di curvatura della testa dello spermatozoo lungo la sua traiettoria curvilinea.
La fase post-analitica prevede la validazione clinica del referto e la consegna. Controllo qualità La qualità del laboratorio, dal punto di vista analitico, si misura con sistemi statistici sia di controllo interno che di controllo esterno. Per produrre risultati affidabili, in un laboratorio di seminologia è essenziale che le metodiche analitiche siano sottoposte a monitoraggio ed al controllo di qualità (QC). L analisi del liquido seminale dunque, così come qualsiasi test di laboratorio, è suscettibile ad errori sistematici e all elevata variabilità di risultati che potrebbero inficiarne la validità. Questi errori risultano ancor più consueti durante la valutazione di concentrazione e morfologia degli spermatozoi, così come appurato da studi multicentrici. L assicurazione della qualità analitica si basa su due capisaldi, i quali risultano essere non alternativi l uno rispetto all altro ma integrativi,: - il controllo interno di qualita' (IQC) - il controllo esterno di qualita' (EQC) Un metodo semplice di IQC intra-operatore o extra-operatore è quello di eseguire ripetute misurazioni condotte con le stesse modalità su aliquote diverse di un campione seminale. Questa forma di controllo di qualità può essere applicata nella valutazione della concentrazione, motilità, morfologia e vitalità degli spermatozoi. L EQC è la verifica di qualità con la quale il laboratorio confronta la propria capacità analitica con quella di altri laboratori nell ambito nazionale o internazionale. L EQC può rivelare con precisione i problemi che non possono essere colti dall IQC se i campioni di controllo non sono adeguatamente occultati o selezionati. L EQC ha il vantaggio di permettere ad un laboratorio di controllare l accuratezza e la stabilità dei suoi metodi.