Biologia Molecolare CDLM in CTF 2010-2011 La trascrizione negli eucarioti
I meccanismi della trascrizione Organizzazione generale delle sequenze regolative Il macchinario generale della trascrizione
Si stima che molti eucarioti abbiano un numero complessivo di geni compreso tra 20k e 25k geni Alcuni geni hanno una espressione pressoché costante (housekeeping genes) La regolazione genica negli eucarioti prevede diversi punti di controllo, il più importante dei quali è la trascrizione La definizione dei dettagli del meccanismo di traduzione ha richiesto lo studio delle interazioni proteina/dna
L espressione genica è controllata a diversi livelli. Questo permette di ottenere una modulazione più efficace, specifica nel tempo e nello spazio. La necessità di esprimere GENI DIVERSI in cellule e tessuti diversi nasce dalla diversità nella specializzazione funzionale di cellule che hanno comunque lo stesso genoma L adattamento a condizioni ambientali in costante mutamento è strettamente correlato con la regolazione genica.
Alcune delle proteine che intervengono nel processo di trascrizione hanno affinità per il DNA Il legame al DNA avviene in regioni specifiche
Una molecola carica immersa in un campo elettrico si muove verso il polo di carica opposta. Il DNA, grazie ai numerosi gruppi fosfato, ha una carica netta negativa. Questa carica è costante per unità di lunghezza. Se inseriamo una molecola di dna in un campo elettrico questa migrerà verso il polo positivo. Se intrappoliamo il DNA in un gel poroso lo spostamento del DNA sarà ostacolato dall attrito. Più grande è la molecola di DNA è maggiore sarà l attrito: le molecole di DNA più grandi migreranno più lentamente, quelle più piccole migreranno più velocemente. Questa è l elettroforesi su gel.
Il DNA da analizzare presenta una estremità marcata. Si eseguono due esperimenti paralleli: in uno il DNA viene analizzato da solo, nell altro il DNA viene prima fatto interagire con una proteina che lega il DNA. I due campioni vengono trattati con DNAsi I, un enzima che produce dei tagli random in diverse posizioni Viene così prodotta una popolazione di molecole di dna più piccole, di varia lunghezza sulla base della posizione di taglio. Nel campione con la proteina legata, la zona di legame è inaccessibile alla DNAsi I. In questa zona non si verificano tagli. Se facciamo correre i due campioni su un gel elettroforetico nel campione senza proteina avremo una popolazione ben distribuita di frammenti mentre nel campione trattato con la proteina ci sarà un intervallo nel quale non si riscontrano frammenti. Le estremità di questo intervallo determinano la zona coperta dalla proteina che lega il DNA
Il DNA da analizzare presenta una estremità marcata. Si eseguono due o più esperimenti paralleli: in uno il DNA viene analizzato da solo, nell altro il DNA viene prima fatto interagire con una proteina che lega il DNA. E possibile fare altri esperimenti in cui si utilizzano diverse DNA binding protein contemporaneamente I campioni vengono fatti correre su gel elettroforetico utilizzando concentrazioni saline particolari che consentano ai complessi DNAproteine di rimanere attivi. Il primo esperimento produrrà una sola banda che corrisponde al DNA libero. Il secondo esperimento può produrre: Una sola banda all altezza della precedente significa che la proteina non si è legata al DNA Una sola banda con migrazione inferiore significa che la proteina si è legata ritardando la migrazione del DNA. La presenza di due bande (una all altezza del DNA libero ed una ritardata) significa che alla concentrazione di proteina utilizzata una parte del DNA è stato legato (banda in ritardo) ed una parte no.
Il macchinario responsabile della trascrizione negli eucarioti è composto anche da proteine che NON si legano direttamente al DNA, ma che interagiscono con altre proteine del macchinario stesso La trascrizione prevede: Macchinario generale della trascrizione Fattori di trascrizione specifici
I meccanismi della trascrizione Organizzazione generale delle sequenze regolative Il macchinario generale della trascrizione
Elementi promotori Nucleo del promotore Elementi prossimali Elementi regolatori a lungo raggio Enhancher Silencer Isolatori LCRs MAR
Lettera maiuscola > 50% dei promotori Lettera minuscola < 50% dei promotori
TATA Box -> 32% potenziali nuclei Lega TFIID (in particolare TBP) Può agire senza Inr, BRE e DPE DPE -> identificato nei TATAless richiede Inr Lega TFIID (TAF9 TAF6) Inr -> Simile a TATA (sinergico ma autonomo) Lega TFIID (TAF1 e TAF2) DPE -> lega TFIIB
I TF legati attivano o reprimono direttamente la trascrizione o interagiscono con Enhancer/ Silencer CAAT Box ->CBF GC Box -> Sp1
Gli Enhancer sono specifiche sequenze di DNA in grado di legare fattori proteici capaci di aumentare l'efficacia dei promotori nell'attivazione della trascrizione Al contrario, i Silencer sono specifiche sequenze di DNA che legano inibitori proteici della trascrizione Sono entrambi elementi distali e per interagire con la regione del promotore è necessario che il DNA si ripieghi a formare un ansa.
Marcatori di confine della cromatina (eterocromatina/eucromatina) Attività di blocco di sequenze regolatrici distali