Trascrizione Testi Watson et al. Biologia Molecolare del Gene, Zanichelli Nelson et al, Principi di Biochimica di Lehninger, Zanichelli Maurizio Crestani
I componen) fondamentali del DNA Polimero di nucleo.di Legami 5 3 fosfodiestere Legami idrogeno tra basi complementari 2
Funzioni degli acidi nucleici DNA RNA proteine Conservazione dell informazione gene.ca Decodificazione dell informazione gene.ca Interazione con altre molecole Propagazione dell informazione alla progenie 3
Flusso dell informazione La regolazione della trascrizione è importante nel controllo di mol. processi cellulari: 1.embriogenesi 2.differenziamento e sviluppo (espressione tessuto specifica di par1colari geni) 3.metabolismo (in risposta a s1moli ambientali) 4.patologie (tumori, aterosclerosi, mala8e neurodegenera1ve etc.) 4
Ruolo RNA messaggero DNA RNA proteine DNA localizzato nel nucleo (eucarioti) Sintesi proteica: citosol (ribosomi) DNA e ribosomi non sono in contajo tra loro (eucario)) mrna: intermedio tra DNA e proteine (F. Crick 1958) 5
Trascrizione Processo enzima.co ajraverso il quale l informazione contenuta in un gene è decodificata per sinte.zzare un filamento di RNA complementare (trascrijo primario) RNA polimerasi procario. un unico enzima sinte.zza i tre.pi di RNA RNA polimerasi eucario. RNA polimerasi I (rrna) RNA polimerasi II (mrna) RNA polimerasi III (trna e rrna 5S e altri piccoli RNA) 6
Trascrizione 3 stadi INIZIO ALLUNGAMENTO TERMINE Direzione di sintesi: 5 3 5 3 3 5 5 3 5 3 7
Trascrizione: procario) α2ββ ω (core) RNA polimerasi procario. α β ω β α σ Riconoscimento di promotori specifici α2ββ ωσ (oloenzima) Pribnow box 8
RNA polimerasi nei procario) Cos.tuita da 5 subunità: α 2 ββ'ω (449 kda) Si lega al promotore tramite fajore σ FaJore σ: specifico per diversi geni Tratto da Voet Voet & Pratt, "Fondamenti di Biochimica" 9
RNA polimerasi nei procario) K d oloenzima= 10 7 M (per DNA non promotore; emivita complesso ~ 1 s) K d oloenzima= 10 14 M (per DNA promotore) K d nucleo enzima= 5x10 12 M (per DNA non promotore; emivita ~ 60 min) Ipotesi: la subunità σ consente di scorrere lungo il DNA fino ad incontrare il promotore specifico. Quando la trascrizione è iniziata la subunità σ si dissocia ed il nucleo dell enzima rimane saldamente ajaccato al DNA 10
Inizio e allungamento della trascrizione 11
Watson et al., BIOLOGIA MOLECOLARE DEL GENE, Zanichelli editore S.p.A. Copyright 2005
FaKori σ Specificità per il promotore Φ SPO1 infeja Bacillus sub1lis σ B. sub.lis geni precoci (σ gp28 ) σ gp28 geni mediali (σ gp33/34 ) σ gp33/34 geni tardivi 13
Meccanismo d azione della RNA polimerasi
Organizzazione dei geni in procario) ed eucario) Procario.: messaggeri policistronici Eucario.: messaggeri monocistronici Gene regolatore Siti di regolazione Geni strutturali I P O Z Y A Operone lattosio 15
Terminazione della trascrizione: meccanismo ρ indipendente
Terminazione della trascrizione: meccanismo ρ indipendente
Terminazione della trascrizione: meccanismo ρ dipendente
Terminazione della trascrizione RNA pol RNA + proteine inizio trascrizione fine trascrizione Direzione trascrizione FaJore ρ : esamero (419 aa) È un elicasi che srotola ibridi DNA RNA (richiede energia) 19
Trascrizione negli eucario) Complessa Sviluppo embrionale Differenziamento Proliferazione Metabolismo 20
RNA polimerasi in eucario) RNA polimerasi I (rrna 18S e 28S) RNA polimerasi II (mrna) RNA polimerasi III (trna, rrna 5S e piccoli RNA) 21
RNA polimerasi II 22
RNA polimerasi II RNA pol II di lievito: 10 subunità (550 kda) (RNA pol II dei mammiferi ha 12 subunità) RNA pol II non è in grado di iniziare trascrizione: necessari GTFs (General Transcrip.on Factors) (i procario. necessitano solo del fajore σ) GTFs: isola. purificando estral cellulari 23
RNA polimerasi II: riconoscimento del promotore +1 1 24
Assemblaggio del complesso di preinizio TFIID: lega TATA box complesso mul)proteico (TBP=TATA Binding Protein + TAF=TATA Associated Factors TFIIH: asva RNA polimerasi II mediante fosforilazione del C terminale della subunità grande (Ser2 e Ser5 CTD repeat, YSPTSPS) ASvità elicasica: bolla di trascrizione Tratto da Voet Voet & Pratt, "Fondamenti di Biochimica" 25
Inibitori della trascrizione Ac.nomicina D (procario. ed eucario.) si lega al DNA al complesso di inizio e ne previene l allungamento Rifampicina (procario.) si lega alla subunità β della RNA polimerasi e impedisce l allungamento α amani.na (eucario.) si lega all elica a ponte dell RNA pol II impedendo così lo spostamento di DNA e RNA e la liberazione del sito di polimerizzazione 26
Maturazione mrna Modificazioni poskrascrizionali Splicing Gli enzimi di maturazione dell RNA sono recluta) dalla coda della RNA polimerasi 27
Modificazioni poskrascrizionali Capping al 5 del mrna Poliadenilazione mrna 28
Capping avviene quando mrna è 20 40 nt 29
Poliadenilazione mrna (AAUAAA) CstF: cleavage s.mula.on factor CPSF: cleavage and polyadenyla.on specificity factor 30
Splicing 31
L informazione gene)ca negli eucario) non è con)nua 32
Maturazione mrna 33
Meccanismo di splicing 34
Meccanismo di splicing la strukura a cappio (lariat) L adenosina della strujura a cappio ha tre legami fosfodiesterici 35
Meccanismo di splicing L ossidrile in 2 di una specifica adenosina dell introne agisce come nucleofilo, ajaccando l estremità 5 dell introne per formare una strujura a laccio 36
Complessi proteici dello splicing 37
Splicing alterna)vo 38
RNA edi)ng apolipoproteina B100 e B48 39
Trasporto di mrna maturo nel citosol 40