Dott.ssa Arianna POMPILIO

C.d.L. in Tecniche di Fisiopatologia Cardiocircolatoria e Perfusione Cardiovascolare Università G. d Annunzio di Chieti-Pescara Anno Accademico 2011-2012 Dott.ssa Arianna POMPILIO

Aree in cui il controllo dei microrganismi è necessario (a differenti livelli) MICROBIOTA Ambiente Industria NORMAL HUMAN MICROBIOTA Agricoltura Animali Microbiota capace di causare malattie nell uomo

DOVE e PERCHE è NECESSARIO il CONTROLLO dei MICRORGANISMI: alcuni esempi Sanitizzazione delle aree Prevenzione di infezioni iatrogene, infezioni chirurgiche, infezioni crociate, diffusione di microrganismi e geni associati MICROBIOTA ad antibiotico-r, etc Ambiente Industria NORMAL HUMAN MICROBIOTA Agricoltura Animali Malattie di alberi, raccolto, piante, etc Animali, pollame, (conservazione, produzione), etc

Quali sono i mezzi a nostra disposizione? Metodi chimici Metodi fisici (talvolta) Metodi fisici Metodi chimici Metodi chimico-fisici

Termini ( o definizioni!) Rimozione di materiale organico dalla strumentazione e dalle attrezzature: sciacquare l oggetto con acqua fredda applicare il detergente e rimuovere meccanicamente il materiale organico risciacquare l oggetto con acqua tiepida asciugare l oggetto, quindi disinfettare / sterilizzare

Termini ( o definizioni!) DECONTAMINAZIONE Trattamento che rende un oggetto od una superficie tale da poter essere maneggiata o toccata senza rischio di contaminazioni Il concetto di decontaminazione è relativo. Può essere prodotta tramite: a seconda della pericolosità e della concentrazione del microrganismo

Termini ( o definizioni!) Qualsiasi procedimento che si prefigga la distruzione di tutti i microrganismi (patogeni e non) presenti in un determinato materiale. Un materiale è considerato sterile se il SAL (livello di sicurezza di sterilità) è inferiore a 10-6 ; ovvero quando la probabilità di trovarvi un microrganismo è inferiore ad uno su un milione. Utilizzo di procedure chimiche, fisiche e/o chimico-fisiche per la completa eliminazione o distruzione di qualsiasi forma di vita microbica, incluse le spore batteriche (forme di resistenza). Concetto assoluto, sebbene influenzato dalla capacità di rilevare la presenza di microrganismi (ad esempio, una soluzione filtrata non è tecnicamente sterile, poiché non rimuove la componente virale)

Termini ( o definizioni!) Processo che riduce o elimina completamente tutti i microrganismi patogeni allo stato vegetativo (non attiva sulle spore) presenti nell ambiente: Disinfezione: trattamento di superfici o sostanze inanimate (abiotiche) Disinfettante: agente chimico in grado di uccidere microrganismi; dotato di diversi livelli di efficacia Antisepsi: complesso delle operazioni da effettuare per impedire o rallentare lo sviluppo di patogeni che causano infezione nell organisno umano (applicazione topica a mucose, cute od altri tessuti) Antisettico: disinfettante usato su tessuti viventi

Termini ( o definizioni!) Are they dead or not? BIOCIDA BIOSTATICO SEPSI composto che uccide tutti i microrganismi viventi (patogeni e non-) incluse le spore (battericida, fungicida, virucida) composto che inibisce la crescita dei microrganismi, non necessariamente uccidendoli (batteriostatico, fungistatico, virustatico) contaminazione microbica ANTISEPSI ASEPSI Uso di agenti chimici sulla cute o altri tessuti vivi con lo scopo di inibire o eliminare i microbi (non c è azione sporicida) assenza di contaminazione microbica

STERILIZZAZIONE

Tecniche di sterilizzazione da: PR Murray et al. Medical Microbiology 3rd ed.,mosby,1998

STERILIZZAZIONE Tecniche FISICHE a. CALORE UMIDO SECCO b. FILTRAZIONE c. ONDE ELETTROMAGNETICHE RADIAZIONI U.V. RADIAZIONI IONIZZANTI

STERILIZZAZIONE Calore Il calore e il mezzo piu usato per la sterilizzazione, limitatamente ai materiali termostabili: Facile da applicare Sicuro Non lascia residui. Si puo usare sottoforma di calore: UMIDO SECCO il calore umido (115-134 c) e piu efficace, prevede l utilizzo di vapore saturo sotto pressione ed agisce essenzialmente provocando reazioni di idrolisi e denaturazione a livello del substrato. il calore secco (160-180 c) e meno efficace, prevede l utilizzo di aria calda ed agisce provocando reazioni di ossidazione.

STERILIZZAZIONE Calore Esistenza di una temperatura massima di crescita specie/ceppo-specifica L effetto letale indotto dal calore consiste nella DENATURAZIONE (alterazione strutturale e funzionale) delle macromolecole (proteine enzimatiche): ossidazione (calore secco) coagulazione (calore umido) Letalità = k x temperatura

STERILIZZAZIONE FISICA Calore umido: Autoclave Tecnica di sterilizzazione di uso più frequente Autoclave: camera a pressione che utilizza vapore saturo per ottenere elevate temperature. L aria viene rimossa dalla camera per gravità o tramite prevuoto. Distruzione proteica per coagulazione Ciclo classico : 121 C, 15 min, 1 atm personalizzazione del ciclo in base alla tipologia di materiale Adatta per: materiali termostabili, terreni di coltura, rifiuti infettivi Non adatta per: chimici tox e/o volatili, radioisotopi, agenti antineoplastici AUTOCLAVE

Calore umido: Autoclave

Autoclave: rimozione d aria per gravità da: AD Russell et al. Principles & Practice of Disinfection, Preservation & Sterilization, Blackwell, 1999

Autoclave Ciclo di sterilizzazione Ciclo di sterilizzazione: la temperatura dell oggetto sterilizzato aumenta più lentamente della temperatura dell autoclave

Sterilizzazione fisica Calore secco Forno Pasteur, inceneritore, becco Bunsen Distruzione ossidativa delle proteine Meno efficace del calore umido e richiede tempi e temperature maggiori Utilizzabile per materiali termostabili, danneggiati dal vapore o ad esso impermeabili olii, polveri, oggetti taglienti, vetreria, rifiuti infettivi (alternativa all autoclavaggio) FORNO PASTEUR

Caldo secco Forno Pasteur Cicli di sterilizzazione: 180 C, 30 min 171 o C, 60 min 160 o C, 120 min 149 o C, 150 min 141 o C, 180 min 121 o C, 12 h

STERILIZZAZIONE FISICA Filtrazione Rimozione meccanica (filtro dotato di pori) di particelle microscopiche da soluzioni e gas (aria) Tipologie di filtri: Filtri a spessore (carta, amianto, lana di vetro) particelle intrappolate nello spessore del filtro generalmente usati come prefiltri (Ø poro = 1.2 m) per la chiarificazione di sospensioni o per la sterilizzazione dell aria in processi industriali Membrane filtranti (nitrato od acetato di cellulosa) azione simile ad un setaccio (Ø poro = 0.22-0.45 m) comunemente impiegati in microbiologia Filtro tipo Nucleopore (policarbonato): idoneo per microscopia FILTRAZIONE

Tipologie di filtri Filtro a spessore Filtro a membrana Filtro tipo Nucleopore

STERILIZZAZIONE FISICA Filtrazione Applicazioni: Sterilizzazione di terreni e supplementi (enzimi, siero, antibiotici) per colture cellulari Filtri HEPA (cabine biohazard, camere bianche o cleanroom) nel laboratorio biomedico, nell industria alimentare e farmaceutica (farmaci, vaccini) Sterilizzazione delle acque

Dispositivi per la filtrazione di liquidi Filtrazione di piccoli volumi Filtrazione di grandi volumi Filtrazione per conta cellulare vitale

Filtrazione su membrana Nucleopore Enterococcus spp. Batteri acquatici ed alghe

Radiazioni elettromagnetiche Le radiazioni elettromagnetiche sono una via efficace per il controllo della crescita microbica. Si conoscono: 1. Raggi UV 2. Raggi X 3. Raggi γ Agiscono sull organismo con il quale vengono a contatto rompendone il DNA, e provocandone la morte. SPETTO ELETTROMAGNETICO

STERILIZZAZIONE FISICA Radiazione Ultravioletta (U.V.) Onde elettromagnetiche ( =220-300 nm) prodotte dal passaggio di corrente elettrica attraverso vapori a bassa pressione di Hg contenuti all interno di speciali tubi in vetro Assorbiti dagli acidi nucleici (Amax=269 nm) e dalle proteine (Amax=280 nm) Danno cellulare (letale) per formazione di dimeri pirimidinici (T-T) che interferiscono con la replicazione del DNA (effetto mutageno) Applicazioni: Materiale plastico termolabile; decontaminazione di superfici, aria, acqua in ambienti confinati sterilizzazione a freddo di composti chimici, materiali plastici per uso farmaceutico, siero per colture cellulari Fattori critici: scarsa penetrazione (non penetra carta, vetro, indumenti) distanza sorgente UV - materiale trattato specie microbica mutagena per l uomo (cute, occhi) Radiazioni U.V.

STERILIZZAZIONE FISICA Radiazioni Ionizzanti Radiazioni elettromagnetiche a corta (alta energia): microonde, raggi, raggi X, elettroni Effetto letale risultante da un azione ionizzante (dislocazione di elettroni dagli atomi) sulla molecola bersaglio: diretta: trasferimento di energia a biopolimeri (DNA, proteine), causandone la rottura indiretta: diffusione di radicali liberi (OH, e-, H ) Applicazioni: I costi elevati ne limitano l utilizzo a processi industriali: Sterilizzazione di rifiuti sanitari,strumenti e dispositivi medicali (articoli monouso, siringhe, terreni di coltura, suture, strumentazione chirurgica) Industria alimentare (carne fresca); Industria farmaceutica (antibiotici, vaccini, pomate) Trapianti di tessuto (valvola cardiaca, tendine, pelle) Svantaggi: costi elevati, penetrano nei tessuti, mutagene per l uomo RADIAZIONI IONIZZANTI

Sensibilità alle radiazioni di alcuni microrganismi e funzioni biologiche Specie/funzioni Tipologia D10 (Gy) Clostridium botulinum Gram+, sporigeno 3.300 Salmonella typhimurium Gram- 200 Aspergillus niger Muffa 500 Saccharomyces cerevisiae Lievito 500 Afta Virus 13.000 Inattivazione enzimatica 20.000-50.000 D10: quantità di radiazioni necessaria per ridurre di 10 volte la popolazione (o l attività) iniziale. Gy (Gray) : dose di radiazione assorbita (1 Gy = 100 rad), dove: 1 rad = 100 erg/g. Dose letale = 12 x D10

STERILIZZAZIONE Tecniche CHIMICHE a. ACIDO PERACETICO b. GLUTARALDEIDE

STERILIZZAZIONE CHIMICA Acido peracetico, Glutaraldeide a. Acido peracetico: agente ossidante immersione (0.2% per 20 - acqua sterile - aria sterile) micronizzato: industria alimentare, strumenti chirurgici efficace in presenza di materiale organico e produce prodotti finali non tossici (acido acetico + O 2 ) b. Glutaraldeide: agente alchilante (aggiunta di CH 3, -CH 2 CH 3 ) immersione (soluzione al 2%), tempi lunghi (ore) impiegata per materiale medico-chirurgico e preparazione di vaccini il suo impiego è associato a rischio occupazionale (irritazione mucose respiratorie, dermatite da contatto)

STERILIZZAZIONE Tecniche CHIMICO-FISICHE OSSIDO di ETILENE (ETO) FORMALDEIDE (vapori)

STERILIZZAZIONE CHIMICO-FISICA Ossido di Etilene (ETO) Alchilazione di gruppi funzionali (amminici, carbossilici, fenolici, idrossilici) Sterilizzazione di materiale di laboratorio termosensibile (plastica) 12% ETO + 88% Freon (oppure CO 2, N 2 ) L utilizzo deve essere regolamentato: ETO è carcinogeno e mutageno

STERILIZZAZIONE Tecniche CHIMICO-FISICHE OSSIDO di ETILENE (ETO) FORMALDEIDE (vapori)

STERILIZZAZIONE CHIMICO-FISICA Formaldeide (vapori) Agente alchilante Vaporizzazione 2-5% formaldeide in presenza di vapor acqueo a 60-80 C Impiegata per sterilizzare filtri HEPA Formaldeide è carcinogena Tracce residue in materiale polimerico (cellulosa, gomma)

SCELTA DELLA TECNICA DI STERILIZZAZIONE Attività: battericida, tubercolicida, fungicida, sporicida, virucida Rapidità di azione: sterilizzazione raggiunta in breve tempo Penetrazione: capacità di penetrare nel materiale trattato o nella confezione in cui esso è contenuto Compatibilità: non causa rilevanti cambiamenti strutturali o funzionali del materiale in seguito a ripetuti trattamenti Atossicità: sicuro per l operatore e l ambiente Resistenza a materiale organico: efficacia invariata in presenza di materiale organico Costo-efficacia: costi ragionevoli per attrezzatura, installazione ed utilizzo

in altre parole: non esiste una tecnica di sterilizzazione IDEALE!

DISINFEZIONE

Tecniche di disinfezione da: PR Murray et al. Medical Microbiology 3rd ed.,mosby,1998

DISINFETTANTI Aldeidi Formaldeide e glutaraldeide sono dotate di rilevante attività disinfettante Alchilazione dei gruppi polari funzionali (amminici, idrossilici, fenolici) delle proteine Formaldeide: 37% (formalina), come sterilizzante: preserva campioni biologici e preparazione di vaccini 3-8%, come disinfettante Irrita le mucose, cancerogeno, forte odore

DISINFETTANTI Aldeidi Glutaraldeide 2% (Cydex) battericida, tubercolicida, fungicida, virucida (10 minuti) sporicida (3-10 ore) Meno irritante e più efficace della formaldeide Disinfezione strumentazione ospedaliera

DISINFETTANTI Agenti Ossidanti Perossido d idrogeno (H 2 O 2 ) Acido peracetico Formazione di radicali ossidrilici (OH ) in grado di ossidare sistemi enzimatici critici per il microrganismo Battericidi, fungicidi, virucidi, sporicidi Acido peracetico (come sterilizzante di strumentazione e matrici alimentari): battericida e fungicida (5 min), virucida e sporicida (30 min) H 2 O 2 (come antisettico, non per ferite aperte)

DISINFETTANTI Agenti Ossidanti Etanolo, isopropanolo (60-85%) Danneggiano membrana citoplasmatica: denaturazione (coagulazione) delle proteine solubilizzazione dei lipidi Battericidi, fungicidi, tubercolicidi, virucidi Attività influenzata dalla presenza di materiale organico Isopropanolo più efficace dell etanolo Antisettici (non per ferite aperte) Disinfettanti (sol. acquosa): superfici ben ventilate e lontane da fiamme

DISINFETTANTI Fenoli e derivati fenolici

DISINFETTANTI Fenoli e derivati fenolici Fenolo (Lister): tossico, corrosivo, carcinogenico Derivati fenolici con gruppo funzionale (cloro, bromo, alchil, benzil, phenyl, amil) a sostituzione di un H dell anello aromatico Distruzione membrana plasmatica, denaturazione proteica Battericidi, fungicidi, tubercolicidi, virucidi 2-5% (0.5%, HIV; 2%, funghi) Attività persistente e non influenzata dalla presenza di materiale organico O-phenylphenol (Lysol), Irgasan Esaclorofene (Phisohex) Elevata efficacia vs cocchi Gram+ Strumenti chirurgici

DISINFETTANTI Alogeni loduri, Cloruri, Bromuri, Fluoruri Eliminazione di gruppi S-H per: Ossidazione: formazione di ponti di-sulfidrilici inattivi Combinazione: ione metallico sottrae SH liberi Battericidi, fungicidi, virucidi, sono combinati (Na, metalli) per ridurre tossicità, instabilità e corrosività Ioduri: Soluzione alcolica: Tintura di iodio Iodofori: PVP-J (Betadine) per uso cutaneo e chirurgico Cloruri: Disinfezione di acqua, piscine, acque di scarico Cl + p-toluene-sulfonamide (cloramina T) 1:10 sodio-ipoclorito (NaOCl) 5.25% per rischio ematogeni

DISINFETTANTI Composti ammonio quaternario Detergenti cationici, derivati da modificazioni di NH4+ Distruzione membrana cellulare, inattivazione enzimatica, denaturazione (coagulazione) proteica Batteriostatico (battericida ad elevate concentrazioni), sporostatico, fungistatico, virustatico Scarsamenta attivi vs Gram-: frequenti infezioni da Pseudomonas spp QUATs-resistenti Neutralizzati da materiale organico, saponi e detergenti anionici Non corrosivi, non tossici, stabili, inodori Zephiran (benzalconio cloruro), cetrimide, clorexidina

ANTISETTICI Alcooli (isopropanolo, etanolo): azione veloce ed efficace (spettro esteso) disidratano la pelle Clorexidina gluconata: solo attività battericida ridotta efficacia in presenza di acqua calcarea o di alcuni saponi Iodofori: esteso spettro di azione colorano ed irritano la cute Triclosan: attivo solo su Gram+ e Gram- (tranne Pseudomonas spp)

SURFATTANTI Saponi e detergenti Utilizzati in associazione con gli antisettici L azione dei surfattanti si espleta attraverso: degradazione della pellicola idrolipidica sopracutanea (emulsificazione) rimozione meccanica dei microrganismi (flora transitoria: Gram-, 80%) per sfregamento

DISINFEZIONE Sensibilità relativa Limitazioni

Efficacia di differenti disinfettanti

Applicazione delle tecniche di disinfezione Un approccio conveniente è quello suggerito da Spaulding, applicato nelle linee-guida U.S. Gli oggetti sono classificati, sulla base del loro impiego, come: 1. CRITICI 2. SEMI-CRITICI 3. NON CRITICI I relativi livelli di disinfezione richiesti sono: Alto livello (High Level of Disinfection, HLD) Livello Intermedio (Intermediate Level of Disinfection, ILD) Basso livello (Low Level of Disinfection, LLD)

Trattamento di oggetti CRITICI Oggetti critici A contatto con tessuti viventi od inseriti nel sistema vascolare (strumentazione chirurgica, cateteri, artroscopi, etc) Obiettivo: Inattivazione forme vegetative e sporali (sterilità) Metodo: Vapore, sterilizzazione chimica (glutaraldeide, perossido di idrogeno, acido peracetico)

Trattamento di oggetti semi-critici Oggetti semi-critici A contatto con mucose o con la cute non integra (endoscopi, termometri, attrezzatura per terapia inalatoria) Obiettivo: Inattivazione delle forme vegetative Metodo: High and Intermediate Level of Disinfection (HLD, ILD): glutaraldeide, perossido di idrogeno, perossido di idrogeno+acido peracetico

Trattamento di oggetti non critici Oggetti non critici Non vengono a contatto con mucose o con la cute non integra (superfici di strumentazioni mediche e superfici ambientali) Obiettivo: Basso grado di contaminazione Metodo: Intermediate and Low Level of Disinfection (ILD, LLD): Alcool etilico, ioduri, composti dell ammonio quaternario, fenoli

elevata S bassa S Spaulding s scheme Alto livello di disinfezione Livello intermedio di disinfezione Basso livello di disinfezione

DISINFEZIONE Fattori critici Ambiente: temperatura optimum: 20-37 C. Efficacia = K x temperatura. Un aumento pari a 10 C determina un aumento 2x della velocità di azione ph del mezzo in cui deve agire il disinfettante Materiale: natura del materiale (porosità) presenza di materiale organico (sangue, pus, vomito, feci) inattivazione principio attivo rivestimento della superficie batterica adsorbimento (eliminazione) del principio attivo Disinfettante: concentrazione del principio attivo tempo di applicazione (contatto con materiale) qualità acqua per diluizione disinfettante

DISINFEZIONE Fattori critici Microrganismo: tipologia I batteri Gram-negativi (presenza della membrana esterna) sono generalmente più resistenti dei Gram-positivi ai disinfettanti ed antisettici Micobatteri, endospore e cisti protozoarie sono molto resistenti ai disinfettanti ed antisettici I virus sprovvisti di envelope sono generalmente più resistenti a disinfettanti ed antisettici rispetto ai virus con envelope carica microbica organizzazione Presenza di biofilm: comunità cellulare multistratificata sessile in cui gli elementi cellulari sono immersi in una matrice polisaccaridica di derivazione batterica. La matrice potrebbe influenzare l attività del disinfettante o inattivandolo interagendo chimicamente con esso o rallentandone la diffusione attraverso gli strati cellulari più profondi

Caratteristiche ideali di un disinfettante Attività: esteso spettro di azione (battericida, fungicida, sporicida, tubercolicida, viricida) Rapidità di azione: breve tempo minimo di applicazione : 1-10 minuti Atossicità: non irritante per occhi, mucose, cute Non deve possedere capacità tintoriali Non corrosivo Stabilità: per diluizioni e tempi consigliati (anche in presenza di materiale organico) Buona capacità di penetrazione e detersione Costi: ragionevoli (economicità)

in altre parole: non esiste il disinfettante IDEALE!