PLATELIA ASPERGILLUS EIA 96 TESTS 62796

PLATELIA ASPERGILLUS EIA 96 TESTS 62796 IL PLATELIA ASPERGILLUS EIA È UN TEST IMMUNOENZIMATICO SU MICROPIASTRA, A SANDWICH, PER IL RILEVAMENTO DELL ANTIGENE GALATTOMANNANO DELL ASPERGILLUS NEL SIERO.

1- USO PREVISTO Il Platelia Aspergillus EIA è un test immunoenzimatico su micropiastra, a sandwich, per il rilevamento dell antigene galattomannano dell Aspergillus in campioni di siero. 2- ISTRUZIONI PER L USO Il test Platelia Aspergillus EIA, utilizzato in combinazione con altre procedure diagnostiche quali coltura microbiologica, esame istologico di campioni bioptici e prove radiografiche, può essere utilizzato come ausilio nella diagnosi dell aspergillosi invasiva. 3- SOMMARIO E SPIEGAZIONE Le infezioni da Aspergillus si verificano solitamente a seguito dell inalazione di spore di Aspergillus presenti nell ambiente. Le forme invasive, in aumento negli ultimi 10 anni, rappresentano le infezioni più gravi. Esse si verificano soprattutto in pazienti neutropenici (a seguito di un trattamento antitumorale) e in pazienti trattati con immunosoppressori (nei trapianti d organo, in particolare trapianti di midollo osseo) e corticosteroidi 7. L Aspergillus è raramente isolato da colture ematiche. La diagnosi si basa spesso su prove diagnostiche o radiologiche non specifiche (sintomi clinici, TC, raggi X del torace, ecc.) Attualmente il test per l antigene galattomannano solubile nel siero sembra essere un metodo sierologico in grado di aiutare la diagnosi dell aspergillosi invasiva 6, 9, 14, 34, 39. 4- PRINCIPIO DEL METODO 27 Il Platelia Aspergillus EIA è un test immunoenzimatico su micropiastra, a sandwich, one step, che rileva il galattomannano nel siero umano. Il test fa uso di anticorpi monoclonali di ratto EBA-2 diretti contro il galattomannano di Aspergillus e caratterizzati in studi precedenti 16, 28. Gli anticorpi monoclonali sono utilizzati (1) per rivestire i pozzetti della micropiastra e legare l antigene e (2) per rilevare l antigene legato alla micropiastra sensibilizzata (reagente coniugato: anticorpi monoclonali legati alla perossidasi). I campioni di siero sono trattati al calore in presenza di EDTA allo scopo di dissociare il complessi immuni e precipitare le proteine del siero che potrebbero interferire con il test 15. I campioni di siero trattati e il coniugato sono aggiunti ai pozzetti rivestiti con anticorpi monoclonali e incubati. In presenza dell antigene galattomannano si forma un complesso anticorpo monoclonale galattomannano anticorpo monoclonale/perossidasi. Le strip dei pozzetti vengono lavate per eliminare eventuale materiale non legato. Successivamente, viene aggiunta la soluzione substrato, che reagisce con i complessi legati al pozzetto per formare una reazione di colore blu. La reazione enzimatica è arrestata dall aggiunta di acido, che fa virare il colore da blu a giallo. L assorbanza (densità ottica) dei campioni e dei controlli è determinata con uno spettrofotometro impostato ad una lunghezza d onda di 450 e 620 mm. 5- REAGENTI Platelia Aspergillus EIA : cat n. 62796 (96 test) Conservare il kit a 2-8 C. Portare tutti i reagenti a temperatura ambiente (18-25 ) prima dell uso. Subito dopo l uso riportare tutti i reagenti, ad eccezione dei controlli, a 2-8 C. Dopo la ricostituzione, il controllo negativo, il controllo di cut-off e il controllo positivo inutilizzati devono essere congelati a 20 C. Riporre le strip/piastre nella busta e richiuderla. Non rimuovere l essiccante. Le strip devono essere utilizzate entro 5 settimane dall apertura e richiusura della busta. Dopo la diluizione, la soluzione di lavaggio può essere conservata per 14 giorni a 2-8 C. Tutti gli altri reagenti sono stabili dopo l apertura fino alla data di scadenza. I reagenti sono forniti in quantità sufficiente per eseguire 96 test in un massimo di 9 sedute analitiche. 76

Componente Contenuto Quantità R1 Microwell Strip Plate Micropiastra : - 96 pozzetti (12 strisce di 8 pozzetti ciascuna) rivestiti con anticorpi monoclonali antigalattomannano 1 Piastra / 12 x 8 pozzetti R2 R3 R4 R5 Concentrated Washing Solution Negative Control Serum Cut-off Control Serum Positive Control Serum Soluzione di lavaggio concentrata (10X): - Tampone Tris NaCl - 1% Tween 20-0,01% thimerosal Siero di controllo negativo: - Siero umano liofilizzato negativo al galattomannano - Negativo agli anticorpi anti-hiv-1, anti-hiv-2 e anti- HCV e all antigene HBs Siero di controllo di cut-off: - Siero umano liofilizzato contenente galattomannano - Negativo agli anticorpi anti-hiv-1, anti-hiv-2 e anti- HCV e all antigene HBs Siero di controllo positivo: - Siero umano liofilizzato contenente galattomannano - Negativo agli anticorpi anti-hiv-1, anti-hiv-2 e anti- HCV e all antigene HBs R6 Conjugate Coniugato (pronto all uso): - Anticorpo monoclonale anti-galattomannano / marcato con perossidasi - Conservante: 0,01% thimerosal R7 R8 R9 R10 Serum Treatment Solution TMB Substrate Buffer Chromogen: TMB Solution Stopping Solution Soluzione di trattamento del siero (pronta all uso): - Soluzione acida EDTA Tampone substrato TMB (pronto all uso): - Acido citrico e soluzione di acetato di sodio - Perossido di idrogeno allo 0,009% - dimetilsulfossido (DMSO) al 4% Soluzione di cromogeno TMB (concentrata): - Soluzione di dimetilsulfossido (DMSO) al 90% contenente tetrametilbenzidina (TMB) allo 0,6% Soluzione bloccante (pronta all uso): - Acido solforico (H 2SO 4) 1,5 N 1 x 100 ml 3 x qb* 1 ml 3 x qb* 1mL 3 x qb* 1 ml 1 x 8 ml 1 x 10,5 ml 1 x 60 ml 1 x 1 ml 1 x 12 ml Plate sealers - Fogli adesivi per micropiastre 1 x 8 fogli Note: la TMB (tetrametilbenzidina) è un cromogeno non-carcinogenico e non-mutageno per la perossidasi. *Note: qb = quanto basta 77

6- AVVERTENZE PER GLI UTILIZZATORI 1. Per uso diagnostico in vitro. 2. Solo per uso professionale. 3. Non utilizzare questo kit di analisi con campioni di siero non umano. 4. Il controllo positivo, il controllo del valore soglia (cut-off) e il controllo negativo sono prodotti da siero umano analizzato e risultato non reattivo per HBsAg e anticorpi anti-hiv-1, HIV-2 e HCV con test con marchio CE. Tuttavia, tutti i reagenti devono essere trattati come potenzialmente infetti. Tutti i test devono essere condotti conformemente allo standard OSHA sui patogeni portati dal sangue, livello di biosicurezza 2 o altre pratiche di biosicurezza appropriate. 5. Indossare indumenti protettivi, compreso il camice da laboratorio, protezioni per gli occhi/il viso e guanti monouso (si raccomandano guanti sintetici privi di lattice) e manipolare i reagenti dei kit e i campioni dei pazienti secondo le buone prassi di laboratorio richieste. Al termine del test, lavarsi accuratamente le mani. 6. Non pipettare con la bocca. 7. Non fumare, bere né mangiare nei locali in cui sono stati utilizzati i campioni o i reagenti dei kit. 8. Evitare di schizzare campioni o soluzioni. 9. Asciugare accuratamente eventuali fuoriuscite di materiale biologico non contenente acido con un disinfettante efficace. I disinfettanti che possono essere utilizzati comprendono (in via non limitativa) una soluzione di candeggina al 10% (soluzione di ipoclorito di sodio allo 0,5%), etanolo al 70% o Wescodyne Plus allo 0,5%. Tutti i materiali utilizzati per asciugare eventuali fuoriuscite sono considerati rifiuti a rischio biologico, soggetti alle relative procedure di smaltimento. ATTENZIONE: non introdurre soluzioni contenenti candeggina nell'autoclave. 10. Assorbire (asciugare) o neutralizzare opportunamente eventuali fuoriuscite di materiale contenente acido con bicarbonato di sodio, quindi risciacquare e asciugare l'area contaminata; in presenza di materiale a rischio biologico, pulire l'area con un disinfettante chimico. 11. Smaltire tutti i campioni e i materiali utilizzati per eseguire il test come potenzialmente infettivi. I rifiuti chimici di laboratorio e a rischio biologico devono essere manipolati e smaltiti conformemente a tutte le normative locali, regionali e nazionali. 12. ATTENZIONE: di seguito viene fornito un elenco di potenziali rischi chimici contenuti in alcuni componenti del kit (consultare la sezione 5- REAGENTI): Poiché la soluzione bloccante di acido solforico 1,5 N (7.2% H 2 SO 4 ) è corrosiva, può causare ustioni agli occhi e alla cute; può essere nociva se ingerita o se entra in contatto con la cute; può causare gravi danni agli occhi, compreso l'indebolimento permanente della vista o cecità. C-Corrosivo Materiali da evitare: basi forti e agenti riducenti. R34-41 Provoca ustioni. Rischio di gravi danni agli occhi. S24/25-26-30-36/37/39-60. Evitare il contatto con gli occhi e con la pelle. In caso di contatto con gli occhi, lavare immediatamente e abbondantemente con acqua e consultare un medico. Non versare acqua sul prodotto. Indossare indumenti protettivi idonei, guanti e protezioni per gli occhi/il viso. Questo materiale e la relativa confezione devono essere smaltiti conformemente alle normative vigenti in materia di rifiuti pericolosi. I rifiuti di questo materiale sono considerati rifiuti acidi pericolosi, tuttavia se consentito dalle normative locali, regionali e nazionali, potrebbero essere neutralizzati a ph 6-9 per lo smaltimento come rifiuti non pericolosi, purché si sia addestrati e attrezzati a tale fine. Il Thimerosal allo 0,01% (sodio mertiolato), un conservante biocida organo-mercurio che colpisce il sistema nervoso centrale (SNC), è tossico per la riproduzione e notevolmente sensibilizzante; l'esposizione prolungata o ripetuta può causare reazione allergica nei soggetti sensibili; esistono diversi casi di sensibilizzazione dovuta all'esposizione a soluzioni di Thimerosal diluite. Non disperdere nell'ambiente, pericolo di effetti cumulativi. Le soluzioni contenenti mercurio con una concentrazione superiore a 0,2 ppm devono essere smaltite conformemente alla normativa USA per i rifiuti pericolosi (RCRA) (D009); smaltire tutti i rifiuti conformemente alle normative vigenti. 78

(Nota: il mercurio (Hg) rappresenta fino al 49,55% delle molecole Thimerosal, di conseguenza un componente con lo 0,01% di Thimerosal contiene ~0,005% (~50 ppm) di mercurio peso/volume). In caso di contatto con la pelle, lavarsi immediatamente e abbondantemente con acqua. Avvertenza: il Thimerosal è noto allo Stato della California per essere tossico per la riproduzione. 13. La scheda dei dati di sicurezza (MSDS) è disponibile su richiesta. 7- PRECAUZIONI PER GLI UTILIZZATORI 1. I CAMPIONI DI SIERO CONGELATI, CONSERVATI IN CONDIZIONI NON NOTE, POSSONO GENERARE RISULTATI FALSI POSITIVI A CAUSA DI CONTAMINAZIONE CON FUNGHI E/O BATTERI. 2. Non utilizzare il kit o i reagenti del kit dopo la data di scadenza indicata. 3. Ad eccezione della soluzione di lavaggio concentrata (R2) e della soluzione bloccante (R10), non miscelare reagenti provenenti da altri kit con numeri di lotto diversi. 4. Portare tutti i reagenti a temperatura ambiente per almeno 15 minuti prima dell uso. 5. Durante la ricostituzione dei reagenti, miscelare accuratamente facendo attenzione ad evitare contaminazione microbica. 6. Non eseguire il test in presenza di vapori reattivi (acidi, alcali, aldeidi) o polvere che potrebbero influire sull attività enzimatica del coniugato. 7. Per preparare la soluzione di reazione substrato-cromogeno utilizzare contenitori puliti monouso in polipropilene. Se è necessario utilizzare contenitori in vetro, lavarli prima in acido cloridrico 1N, risciacquarli con acqua distillata e asciugarli. 8. Per pipettare i controlli e i campioni utilizzare puntali da pipetta monouso per evitare la contaminazione dei campioni. 9. Per garantire che i pozzetti siano adeguatamente lavati, rispettare il numero consigliato di cicli di lavaggio e assicurarsi che tutti i pozzetti siano completamente riempiti e quindi completamente svuotati. Il lavaggio non va effettuato manualmente. 10. Non lasciare che la micropiastra si asciughi tra la fine del ciclo di lavaggio e l aggiunta di reagenti. 11. Non utilizzare lo stesso recipiente per il coniugato e le soluzioni di substrato. 12. Evitare che il coniugato o le soluzioni per la reazione substrato-cromogeno vengano a contatto con metallo o ioni metallici. 13. Evitare di esporre il cromogeno o la soluzione per la reazione substrato-cromogeno a luce intensa durante la conservazione o l incubazione. Evitare che le soluzioni di cromogeno vengano a contatto con agenti ossidanti. 14. Evitare il contatto tra la soluzione bloccante ed agenti ossidanti. Evitare che la soluzione bloccante venga a contatto con metallo o ioni metallici. 15. Utilizzare materiali puliti e privi di polvere (provette, puntali, recipienti, ecc.) per ridurre al minimo le possibilità di contaminazione con spore di Aspergillus presenti nell ambiente. Poiché il galattomannano è stabile al calore, la sterilizzazione del materiale utilizzato non garantisce l assenza di antigeni contaminanti. I materiali apirogeni sono ottimali ma, con le dovute precauzioni, è possibile anche utilizzare materiali standard. 16. Limitare l esposizione all aria delle soluzioni (sieri, soluzioni di trattamento, coniugato) o di recipienti aperti (piastre, provette, pipette). 17. Non rimettere il coniugato inutilizzato nel recipiente originale. 18. La soluzione per la reazione substrato-cromogeno deve essere incolore. La comparsa di colore blu dopo la diluizione indica che il reagente è contaminato e non deve essere utilizzato. Eliminarlo e preparare nuovo reagente. 8- PREPARAZIONE E CONSERVAZIONE DEL REAGENTE Piastra con strisce di micropozzetti (R1) Dopo l apertura della busta contenente la piastra, le strisce di micropozzetti sono stabili per 5 settimane se conservate a +2-8 C nel sacchetto originale accuratamente chiuso e in presenza dell essiccante fornito. 79

Soluzione di lavaggio di lavoro (R2) Preparare la soluzione di lavaggio di lavoro secondo necessità aggiungendo una parte di soluzione di lavaggio concentrata a 9 parti di acqua deionizzata o distillata sterile. La soluzione di lavaggio di lavoro può essere conservata per 14 giorni a 2-8 C. Prepararne una quantità sufficiente per completare il ciclo (80 ml per una striscia: 8 ml R2 + 72 ml di acqua distillata). Dopo l apertura, la soluzione di lavaggio concentrata conservata a +2-25 C, in assenza di contaminazione, è stabile fino alla data di scadenza indicata sull etichetta. Siero di controllo negativo (R3) Ricostituire il contenuto di una provettina di controllo con 1000 µl (1 ml) di acqua distillata sterile (preferibilmente acqua apirogena). I sieri devono essere reidratati immediatamente prima dell esecuzione del test. Miscelare accuratamente dopo avere atteso 2-3 minuti per la reidratazione del siero. Suddividere in aliquote da 300 µl in 3 provette in polipropilene da microcentrifuga. Congelare immediatamente a 20 C le provette che non verranno utilizzate dopo la reidratazione. Nota: i sieri di controllo precedentemente reidratati e congelati immediatamente a 20 C possono essere scongelati ed utilizzati senza ulteriore reidratazione. I controlli reidratati congelati possono essere conservati a 20 C per un massimo di cinque settimane. Trattare i sieri di controllo allo stesso modo dei campioni paziente (300 µl di siero + 100 µl di soluzione di trattamento, ecc.) Siero di controllo di cut-off (R4) e siero di controllo positivo (R5) Prepararli come descritto per il siero di controllo negativo. Soluzione per la reazione substrato-cromogeno (R8 + R9) Preparare la soluzione per la reazione substrato-cromogeno aggiungendo una parte di soluzione TMB di cromogeno concentrato, R9, a 50 parti di tampone di substrato TMB, R8. Preparare 2 ml di soluzione per la reazione substrato-cromogeno per strip: 40 µl di R9 + 2 ml di R8. La soluzione è stabile per 6 ore se conservata al buio a temperatura ambiente (+18-25 C). Dopo l apertura, i reagenti R8 ed R9 conservati a +2-8 C, in assenza di contaminazione, sono stabili fino alla data di scadenza indicata sull etichetta. Coniugato (R6), soluzione di trattamento del siero (R7) e soluzione bloccante (R10) Dopo l apertura, i reagenti R6, R7 ed R10 conservati a +2-8 C, in assenza di contaminazione, sono stabili fino alla data di scadenza indicata sull etichetta. 9- RACCOLTA DEI CAMPIONI Raccogliere i campioni ematici secondo le procedure standard di laboratorio. Il test viene eseguito su siero. I campioni di siero non devono essere contaminati da spore fungine e/o batteri. Trasportare e conservare i campioni in provette sigillate non esposte all aria. I campioni non aperti possono essere conservati a 2-8 C per un massimo di 5 giorni prima del test. Dopo la prima apertura, i campioni possono essere conservati a 2-8 C per un massimo di 48 ore prima del test. Tale durata può essere prolungata conservando il siero a 70 C. I campioni di siero possono essere sottoposti a un massimo di 4 cicli di congelamento/ scongelamento. I campioni precedentemente congelati devono essere miscelati accuratamente dopo lo scongelamento prima di eseguire il test. I risultati non sono influenzati da campioni contenenti 20 mg/l di bilirubina, campioni lipemici contenenti l equivalente di 2 g/l di trioleina (trigliceride) o campioni emolizzati contenenti 165 mg/l di emoglobina. Non sono state testate interferenze legate ad albumina in eccesso. Non eliminare il complemento dai sieri. 10- PROCEDURA Materiali forniti Vedere la sezione REAGENTI. 80

Materiali richiesti ma non forniti 1. Acqua distillata o deionizzata sterile per la diluizione della soluzione di lavaggio. 2. Acqua distillata apirogena sterile per la ricostituzione dei sieri di controllo. 3. Carta assorbente. 4. Guanti monouso. 5. Occhiali protettivi. 6. Ipoclorito di sodio (candeggina) e bicarbonato di sodio. 7. Pipette o pipette multiple, regolabili o fisse, per misurare ed erogare 50 µl, 100 µl, 300 µl e 1000 µl. 8. Provette in polipropilene da microcentrifuga da 1,5 ml con tappi ermetici, in grado di sostenere un riscaldamento fino a 120 C (blocco termico) o 100 C (bagnomaria bollente). a. Provette con tappo a vite: provette coniche da 1,5 ml, Bio-Rad cat. n.224-0100 o equivalenti. b. Provette con tappo a pressione: provette EZ Micro Test da 1,5 ml, Bio-Rad cat. n. 223-9480 o equivalenti. 9. Chiusure per tappi per microprovette (VWR cat. n. 6054001 o equivalenti). Queste chiusure consentono di sigillare in modo sicuro i tappi delle provette evitando che si aprano durante i cambiamenti di temperatura e pressione e consentono inoltre di estrarre con facilità le provette dal blocco termico o dal bagnomaria bollente. 10. Centrifuga da banco per provette 1,5 ml in polipropilene in grado di ottenere 10.000 g. 11. Rack per micro-centrifuga 12. Agitatore Vortex. 13. Thermoblock : Si consigliano riscaldatori dei seguenti modelli: a. modello a 1 blocco (1x24): Grant cat. n. QBD1 (VWR cat. n. 460-0074) b. modello a 2 blocchi (2x24): Grant cat. n. QBD2 (VWR cat. n. 460-0076) 14. Blocco intercambiabile: entrambi i thermoblocks devono essere usati con il blocco Grant cat. n. QB-E1 (1x24) (VWR cat. n. 460-8517) 15. Bagnomaria bollente a 100 C 16. Incubatore per micropiastra a 37 ± 1 C. 17. Lavatore automatico o semiautomatico per micropiastra. 18. Lettore per micropiastra dotato di filtri a 450 nm e 620 nm. Commenti procedurali I controlli negativo, positivo e cut-off devono essere testati in ogni seduta per convalidarne i risultati. Trattamento dei sieri Tutti i sieri di controllo, negativo (R3), cut-off (R4) e positivo (R5), devono essere trattati allo stesso tempo dei campioni del test : 1. Pipettare 300 µl di ciascun siero e controllo del test nelle provette singole in polipropilene da 1,5 ml. 2. Aggiungere 100 µl di soluzione di trattamento del siero (R7) ad ogni provetta. 3. Miscelare le provette accuratamente agitandole vigorosamente o al vortex. Chiudere saldamente la provetta per evitarne l apertura durante il riscaldamento. Per le provette con tappo a pressione: utilizzare una chiusura per tappo. Non perforare il tappo. 4. Opzione blocco termico: Scaldare le provette per 6 minuti in un blocco termico a 120 C. Le provette devono essere inserite nel blocco solo quando viene raggiunta la temperatura consigliata.(*) OPPURE Opzione bagnomaria: Se si utilizza un bagnomaria bollente: riscaldare le provette per 3 minuti a 100 C. (*) 5. Rimuovere con cautela le provette dal blocco termico o dal bagnomaria bollente e collocarle nella centrifuga. Centrifugare le provette a 10.000 x g per 10 minuti. 81

6. Per il rilevamento dell antigene galattomannano è utilizzato il supernatante. 7. Testare i supernatanti con la procedura seguente. Dopo la preparazione il supernatante può essere rimosso e conservato a 2-8 C per un massimo di 48 ore prima del test. Se l analisi dei risultati indica la necessità di ripetere il test, occorre trattare un altra aliquota di siero. (*) Affinché il test vada a buon fine è necessario rispettare rigorosamente la temperatura e il tempo di esecuzione indicati ed utilizzare i materiali consigliati. Non fare affidamento alla temperatura indicata sul dispositivo. Controllare che la temperatura corrisponda alle specifiche utilizzando un termometro calibrato che verrà inserito in una provetta contenente olio minerale: all interno della provetta si dovranno raggiungere 120 C se posta in un bocco termico e 100 C in bagnomaria bollente. Metodo EIA Attenersi rigorosamente al protocollo proposto. Rispettare la buona pratica di laboratorio. 1. Portare i reagenti a temperatura ambiente (18-25 C) per almeno 15 minuti prima dell uso. 2. Preparare la soluzione di lavaggio, la soluzione per la reazione substrato-cromogeno e controlli negativo, positivo e cut-off. 3. Preparare una tabella per l identificazione dei sieri e dei controlli del test nella micropiastra. Utilizzare un pozzetto per il siero di controllo negativo (R3), due pozzetti per il siero di controllo cutoff (R4) ed un pozzetto per il siero di controllo positivo (R5). 4. Rimuovere dal contenitore il supporto della piastra e le strisce dei pozzetti (R1). Rimettere nella busta le strisce non utilizzate, unitamente all essiccante e richiudere la busta. 5. Miscelare il contenuto del flacone di coniugato (R6) capovolgendolo prima dell uso. Aggiungere 50 µl di coniugato (R6) ad ogni pozzetto. Successivamente, aggiungere ad ogni pozzetto 50 µl di supernatante di siero trattato, come specificato sopra. Non aggiungere i campioni di siero ai pozzetti prima del coniugato. 6. Coprire la piastra con l apposita pellicola o in altro modo per evitare l evaporazione, assicurandosi che tutta la superficie sia coperta e a tenuta d acqua. 7. Incubare la micropiastra in un incubatore a secco per micropiastre per 90 ± 5 minuti a 37 C (± 1 C). 8. Rimuovere la pellicola dalla piastra. Aspirare il contenuto di tutti i pozzetti e versarlo in un recipiente per rifiuti (contenente ipoclorito di sodio). Lavare la piastra 5 volte, utilizzando un minimo di 370 µl di soluzione di lavaggio di lavoro. Dopo l ultimo lavaggio, invertire la micropiastra e picchiettarla gentilmente su carta assorbente per eliminare il liquido rimanente. 9. Aggiungere rapidamente 200 µl di soluzione per la reazione substrato-cromogeno (R8+R9) ad ogni pozzetto, evitando l esposizione alla luce intensa. 10. Incubare la micropiastra al buio a temperatura ambiente (18-25 C) per 30 ± 5 minuti. Non utilizzare pellicola adesiva in questa fase dell incubazione. 11. Aggiungere 100 µl di soluzione bloccante (R10) ad ogni pozzetto, utilizzando lo stesso ordine di aggiunta della soluzione di substrato. Miscelare bene. 12. Pulire accuratamente il fondo di ogni piastra. 13. Leggere la densità ottica di ogni pozzetto a 450 nm (filtro di riferimento di 620 nm). Le micropiastre devono essere lette entro 30 minuti dall aggiunta della soluzione bloccante. 11- CONTROLLO DI QUALITÀ (CRITERI DI VALIDITÀ) Controllo di cut-off : la densità ottica (O.D.) di ogni siero di controllo di cut-off deve essere 0,300 e 0,800. Controllo positivo : l indice del siero di controllo positivo deve essere superiore a 2,00. I = O.D. controllo positivo (R5) > 2,00 O.D. media del controllo cut-off 82

Controllo negativo : l indice del siero di controllo negativo deve essere inferiore a 0,40. I = O.D. controllo negativo (R3) < 0,40 O.D. media controllo cut-off Se uno qualsiasi dei controlli non risponde ai criteri di validità descritti sopra, il test non è valido e i risultati del campione paziente non vanno riportati. L operatore può decidere di ripetere il test, dopo aver riesaminato la procedura, oppure contattare il produttore per chiedere assistenza. Se il test viene ripetuto, occorre utilizzare una nuova aliquota dello stesso campione. Esempio di calcolo: Campione Assorbanza (O.D.) O.D. Controllo negativo (R3) 0,117 O.D. Controllo cut-off (R4) 0,596 0,576 O.D. Controllo positivo (R5) 2,602 Calcoli Valore di controllo cut-off medio Per calcolare l O.D. media del controllo cut-off (R4), sommare i valori di O.D. per ogni duplicato del controllo cut-off e dividere il risultato per 2: (0,596 + 0,576) 2 = 0,586 Indice di controllo negativo Per calcolare l indice del controllo negativo, dividere l O.D. del controllo negativo per l O.D. media del controllo cut-off: Indice di controllo positivo I = 0,117 = 0,20 0,586 Per calcolare l indice del controllo positivo, dividere l O.D. del controllo positivo per l O.D. media del controllo cut-off: Validità Nell esempio precedente: I = 2,602 = 4,44 0,586 L O.D. di ogni controllo cut-off è 0,300 e 0,800, pertanto il controllo di cut-off è valido. L indice del controllo negativo è < 0,40, pertanto il controllo negativo è valido. L indice del controllo positivo è > 2,00, pertanto il controllo positivo è valido. Il test eseguito in questo esempio è considerato valido, poiché i risultati rispettano i criteri di validità per ogni controllo. 12- INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI La presenza o assenza dell antigene galattomannano nel campione del test viene determinata calcolando un indice per ogni campione paziente. L indice (I) è il valore O.D. del campione diviso per la densità ottica media dei pozzetti contenenti il siero di controllo cut-off. Calcolo della densità ottica media del siero di controllo cut-off Sommare le densità ottiche dei due pozzetti contenenti siero di controllo cut-off (R4) e dividere il risultato per 2. 83

Calcolo di un indice (I) per ogni siero del test Calcolare il rapporto seguente per ogni siero del test: O.D. campione I = O.D. media del controllo cut-off I sieri con indice < 0,50 sono considerati negativi all antigene galattomannano. Nota: un risultato negativo può indicare che il risultato del paziente è inferiore al livello rilevabile dal test. Nota: i risultati negativi non escludono la diagnosi di aspergillosi invasiva. Se il risultato è negativo ma si sospetta la presenza della malattia, è consigliabile ripetere il test. I sieri con indice 0,50 sono considerati positivi all antigene galattomannano. Per tutti i pazienti positivi, si raccomanda di ripetere una nuova aliquota dello stesso campione e di prelevare un nuovo campione del paziente per un test di follow-up. Nota: un valore di assorbanza inferiore a 0,000 può indicare un errore procedurale o dello strumento che deve essere valutato. Il risultato non sarà valido e il campione dovrà essere rianalizzato. Si raccomanda lo screening regolare (due volte alla settimana) dei pazienti ad alto rischio per aumentare la sensibilità e la positività precoce del test. Nota: il test Platelia Aspergillus EIA è concepito per essere utilizzato quale supporto nella diagnosi dell'aspergillosi invasiva. I risultati positivi ottenuti con il test Platelia Aspergillus EIA devono essere valutati congiuntamente ad altre procedure diagnostiche quali colture microbiologiche, esami istologici di campioni di biopsia e prove radiografiche. Esempio di calcolo: Campione Assorbanza (O.D.) O.D. Controllo negativo (R3) 0,117 O.D. Controllo cut-off (R4) 0,596 0,576 O.D. Controllo positivo (R5) 2,602 Campione paziente n.1 0,134 Campione paziente n. 2 0,436 Campione paziente n. 3 1,196 Calcoli Consultare la sezione Controllo di qualità (criteri di validità) per avere un esempio dei calcoli per determinare la validità dei controlli del test. Valore medio del controllo di cut-off Per calcolare l O.D. media del controllo cut-off (R4), sommare i valori di O.D. per ogni replicato del controllo di cut-off e dividere il risultato per 2: (0,596 + 0,576) 2 = 0,586 Campione paziente n. 1 Per calcolare l indice del campione paziente n. 1, dividere l O.D. del campione paziente per l O.D. media del controllo cut-off: I = 0,134 = 0,23 0,586 In questo esempio, il campione paziente n. 1 è negativo poiché l indice di 0,23 è < 0,50. Campione paziente n. 2 Per calcolare l indice del campione paziente n. 2, dividere l O.D. del campione paziente n. 2 per l O.D. media del controllo di cut-off: I = 0,436 = 0,74 0,586 84

In questo esempio, il campione paziente n. 2 è positivo poiché l indice di 0,74 è 0,50. Campione paziente n. 3 Per calcolare l indice del campione paziente n. 3, dividere l O.D. del campione paziente n. 3 per l O.D. media del controllo di cut-off: I = 1,196 = 2,04 0,586 In questo esempio, il campione paziente n. 3 è positivo poiché l indice di 2,04 è 0,50. 13- LIMITI DEL METODO 1. Un test negativo non esclude la diagnosi di aspergillosi invasiva. I pazienti a rischio di aspergillosi invasiva dovrebbero essere sottoposti a test due volte per settimana. 2. Quando si analizzano campioni per rilevare la presenza di antigene galattomannano è necessario attenersi al metodo e all interpretazione dei risultati Platelia Aspergillus EIA. Si consiglia all utilizzatore del kit di leggere attentamente il foglietto illustrativo della confezione prima di eseguire il test. In particolare, è necessario attenersi scrupolosamente al metodo durante le fasi di pipettatura del campione e reagente, lavaggio della piastra e tempi di incubazione. 3. Se il campione o il reagente non vengono aggiunti come descritto nel metodo, il test potrebbe dare un risultato falso negativo. Nel caso di sospetto clinico di aspergillosi invasiva o se si commette un errore di metodo, valutare l opportunità di ripetere il test su ulteriori campioni. 4. Se il contenuto di un pozzetto passa da un pozzetto all altro in seguito a errata manipolazione della micropiastra o se si utilizza una tecnica non idonea quando si pipettano i reagenti è possibile che i pozzetti con campione paziente negativo siano contaminati dai pozzetti con campione paziente positivo/di controllo. 5. Il rendimento del Platelia Aspergillus EIA non è stato valutato con campioni di siero pediatrico o neonatale. 6. Platelia Aspergillus EIA potrebbe rilevare il galattomannano in modo meno efficace in pazienti affetti da malattia granulomatosa cronica (CGD) e sindrome di Job 36, 37. 7. L uso concomitante di terapia antifungina attiva contro le muffe in alcuni pazienti con aspergillosi invasiva potrebbe ridurre la sensibilità del Platelia Aspergillus EIA 20. 8. Platelia Aspergillus EIA non è stato valutato per l uso con plasma o altri tipi di campioni quali urine, BAL o CSF. 9. Non è stato determinato il rendimento del Platelia Aspergillus EIA in caso di determinazione visiva del risultato. 10. Altre specie di funghi quali Penicillium, Alternaria, Paecilomyces, Geotrichum e Histoplasma hanno mostrato reattività con gli anticorpi monoclonali di ratto EBA-2 utilizzati nel test per l'individuazione dell'aspergillus galattomannano. L'istoplasmosi deve essere tenuta in debita considerazione nelle aree endemiche comprese parti degli Stati Uniti 23, 32, 38. 11. Reazioni positive senza segni clinici: considerando il rilevamento precoce dell antigene galattomannano nel siero anche prima della comparsa di caratteristiche cliniche e/o radiologiche, si osservano generalmente reazioni positive senza segni clinici; esse corrispondono a test falso positivi in pazienti per i quali viene successivamente stabilita aspergillosi invasiva accertata o probabile. Tuttavia, in alcuni casi particolari, durante l interpretazione del test occorre tenere in considerazione alcuni fattori: a. Sono state riportate reazioni positive senza segni clinici, soprattutto in bambini piccoli 26. Sebbene alcuni di questi casi possano essere collegati alla reale circolazione di antigeni di Aspergillus, possono essere considerati per la maggior parte dei falso positivi. b. È stata dimostrata la presenza di galattofuranosi in vari cibi, soprattutto cereali, prodotti a base di cereali e dolci cremosi 1,17. A differenza del latte umano, i latti umanizzati contengono spesso elevate concentrazioni di galattomannano 10. Occorre perciò tenere conto del fattore alimentare nell interpretazione del corso dell antigenemia nei bambini 85

piccoli e, più in generale, in tutti i pazienti con barriera intestinale alterata 4, 10. In tale popolazione di pazienti i casi di antigenemia non accompagnata da segni clinici dovrebbero essere interpretati con cautela ancora maggiore 17. c. Sono stati riportati risultati positivi al test del galattomannano in pazienti che assumevano piperacillina/tazobactam. Sono stati inoltre riportati alcuni lotti o partite di piperacillina/tazobactam rivelatisi positivi all antigene galattomannano. Pertanto, risultati positivi del test in pazienti che assumono piperacillina/tazobactam devono essere interpretati con cautela e confermati tramite altri metodi diagnostici. Il rilevamento del galattomannano è stato inoltre riportato in alcune partite di amoxicillina associata a preparazioni parenterali di acido clavulanico. Pertanto, quando si interpreta il test occorre prendere in considerazione i trattamenti con b-lattame semi-sintetico 1, 21. Tuttavia, poiché Platelia Aspergillus EIA può rilevare l antigene galattomannano molto prima della comparsa di segni clinici o radiologici, l insorgenza di aspergillosi invasiva non può essere esclusa. Per questo motivo i pazienti trattati con piperacillina/tazobactam con risultati del test positivi, devono essere seguiti attentamente. d. Nei pazienti che assumono per via parenterale o per via orale (in presenza di un'alterazione della barriera intestinale) prodotti contenenti galattomannano si potrebbero osservare reazioni positive in assenza di segni clinici. Spesso, la presenza di galattomannano in questi prodotti è riconducibile all'utilizzo di un procedimento di fermentazione a partire da microrganismi fungini. Tuttavia, un risultato positivo sarà osservato nel paziente solo se la concentrazione serica del galattomannano esogeno raggiunge o supera la soglia di individuazione del test. In presenza di un risultato positivo sospetto in assenza di altri segni evocatori, raccomandiamo di prendere in esame i prodotti assunti dai pazienti e in particolare il procedimento di fabbricazione e l'origine delle materie prime utilizzate 11, 24, 31. 14- VALORI PREVISTI La prevalenza attesa di aspergillosi invasiva varia in base alla popolazione di pazienti; sono stati riportati tassi del 5-20% 7, 13. Per determinare le caratteristiche di rendimento del Platelia Aspergillus EIA è stato condotto uno studio clinico presso due centri europei su un totale di 4873 campioni di siero provenienti da 239 episodi (203 pazienti) con tumori maligni ematologici o trapianto ematopoietico di cellule staminali diagnosticati con e senza aspergillosi invasiva. Poiché un paziente poteva essere incluso nello studio in più di un occasione, l analisi è stata eseguita in base a episodi per trattamento. Per episodio si intende il periodo di tempo prima e dopo un evento clinico (ad es. trapianto, GVHD, ecc.). Ne consegue che per uno stesso paziente può essere stato osservato più di un episodio. Il tasso medio di prevalenza per questo studio era del 16% (38/239). La distribuzione di valori indice per tali popolazioni è rappresentata nei grafici che seguono. Pazienti diagnosticati senza aspergillosi invasiva (popolazione di controllo) In due centri europei, sono stati testati con il test Platelia Aspergillus EIA 3691 campioni di siero ottenuti da 201 episodi (168 pazienti). La distribuzione dei valori indice è rappresentata nel grafico che segue. Numero di sieri 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500 0 3240 330 Distribuzione del valore di indice sierico dalla popolazione di pazienti controllo N= 3691 54 32 13 4 4 3 0 1 0 0 3 1 0 6 Indice 86

Questo grafico a disper sione riporta i risultati del test per il galattomannano su 3691 campioni di siero provenienti da 201 episodi (168 pazienti di controllo) (pazienti sottoposti a terapia immunosoppressiva per HSCT o per curare un tumore maligno ematologico). Índice 2 1,5 1 0,5 POPOLAZIONE DI CONTROLLO: DISTRIBUZIONE DELL'INDICE / EPISODIO (N= 201 episodi da 168 pazienti) 0 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 Numero episodi Pazienti diagnosticati con aspergillosi invasiva Questo grafico a dispersione riporta i risultati del test per il galattomannano su 1182 campioni di siero provenienti da 38 episodi (35 pazienti di controllo), diagnosticati con aspergillosi invasiva accertata o probabile in base alle definizioni EORTC/NIAID. Índice 10,0 9,0 8,0 7,0 6,0 5,0 4,0 3,0 2,0 1,0 0,0 ASPERGILLOSI INVASIVA PROBABILE/ACCERTATA: DISTRIBUZIONE DELL'INDICE / EPISODIO (N=38 episodi da 35 pazienti) 0 5 10 15 20 25 30 35 40 Numero episodi Cut-off 0,5 Non si prevede che tutti i campioni di siero di ogni paziente siano positivi. La prevalenza attesa di aspergillosi invasiva varia in base alla popolazione di pazienti; sono stati riportati tassi del 5-20% 7, 13. Il grado di prevalenza per questo studio era del 16%. I grafici seguenti rappresentano rispettivamente esempi di un paziente senza segni clinici o sintomi di aspergillosi invasiva (negativo per Aspergillus) e di un paziente con aspergillosi invasiva accertata (positivo per Aspergillus). Paziente negativo: Índice 1,6 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 PAZIENTE DI CONTROLLO 0 0 10 20 30 40 50 60 Giorni 87

Paziente positivo: ASPERGILLOSI INVASIVA ACCERTATA Índice 1,6 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 0 10 20 30 40 50 60 Giorni 15. CARATTERISTICHE SPECIFICHE DI RENDIMENTO A. Studi di riproducibilità La variabilità nel test e fra i test di Platelia Aspergillus EIA è stata determinata in uno studio utilizzando un pannello di 6 campioni di siero (uno negativo, uno debolmente positivo, due positivi e due fortemente positivi) provenienti da tre siti in Nord America. Ognuno dei 6 campioni del pannello è stato testato in triplicato (x3) in 3 giorni diversi, su un lotto, presso due centri (numero totale di replicati in ogni centro = 9). Ognuno dei 6 campioni del pannello è stato testato in duplicato (x2) in 3 giorni diversi, su un lotto, presso un terzo centro (numero totale di replicati in ogni centro = 6). Un solo (1) operatore ha eseguito tutte le analisi di precisione presso ogni centro. I dati sono stati analizzati in conformità con il National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS). Le seguenti tabelle presentano i valori per densità ottica media (O.D), valore di indice medio, deviazione standard (SD), coefficiente di variazione percentuale (CV%), precisione nella serie (nel test) e precisione nel centro (fra i test) per tutti i campioni del pannello presso ogni centro. 88

Sito 1 Campione del pannello Neg. Pos. basso Pos. #1 Pos. #2 Pos. alto #1 Pos. alto #2 Controllo neg. CO controllo Controllo pos. DO Indice DO Indice DO Indice DO Indice DO Indice DO Indice DO Indice DO Indice DO Indice N 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 3 3 6 6 3 3 Media 0,052 0,09 0,445 0,74 0,702 1,17 0,931 1,563 1,227 2,06 2,887 4,83 0,046 0,08 0,606 1,00 2,216 3,67 DS nella seduta 0,002 0,00 0,022 0,03 0,059 0,09 0,044 0,08 0,051 0,09 0,089 0,17 N/A N/A 0,02 0,03 N/A N/A (nell analisi) 1 %CV N/A N/A 4,8% 4,4% 8,4% 7,6% 4,7% 5,1% 4,2% 4,4% 3,1% 3,6% N/A N/A 3,7% 3,4% N/A N/A SD totale (fra le analisi 2 0,036 0,04 0,051 0,08 0,07 0,14 0,044 0,25 0,058 0,29 0,169 0,58 N/A N/A 0,102 0,03 0,317 0,12 %CV N/A N/A 11,5% 10,4% 10,0% 11,6% 4,7% 15,7% 4,7% 14,3% 5,9% 11,9% N/A N/A 16,9% 2,8% 14,3% 3,3% Sito 2 Campione del pannello Neg. Pos. basso Pos. #1 Pos. #2 Pos. alto #1 Pos. alto #2 Controllo neg. CO controllo Controllo pos. DO Indice DO Indice DO Indice DO Indice DO DO Indice DO Indice DO Indice DO Indice DO N 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 3 3 6 6 3 3 Media 0,040 0,10 0,280 0,70 0,364 0,89 0,602 1,49 0,801 2,01 1,361 3,43 0,074 0,18 0,415 1,00 1,197 2,97 DS nella seduta 0,006 0,01 0,041 0,09 0,023 0,07 0,045 0,11 0,046 0,10 0,047 0,11 N/A N/A 0,00 0,01 N/A N/A (nell analisi) 1 %CV N/A N/A 14,5% 13,0% 6,4% 7,6% 7,5% 7,1% 5,7% 4,8% 3,5% 3,2% N/A N/A 1,1% 1,1% N/A N/A SD totale (fra le analisi 2 0,006 0,03 0,058 0,19 0,083 0,18 0,057 0,28 0,042 0,53 0,079 1,00 N/A N/A 0,094 0,01 0,068 0,54 %CV N/A N/A 20,8% 27,0% 22,7% 19,8% 9,5% 18,7% 5,3% 26,5% 5,8% 29,2% N/A N/A 22,7% 0,9% 5,7% 18,2% Sito 3 Campione del pannello Neg. Pos. basso Pos. #1 Pos. #2 Pos. alto #1 Pos. alto #2 Controllo neg. CO controllo Controllo pos. DO Indice DO Indice DO Indice DO Indice DO DO Indice DO Indice DO Indice DO Indice DO N 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 3 3 6 6 3 3 Media 0,049 0,10 0,388 0,81 0,652 1,36 0,830 1,73 1,158 2,41 2,378 4,96 0,059 0,12 0,480 1,00 1,652 3,45 DS nella seduta 0,003 0,01 0,009 0,02 0,082 0,17 0,068 0,14 0,094 0,20 0,126 0,25 N/A N/A 0,028 0,06 N/A N/A (nell analisi) 1 %CV N/A N/A 2,4% 2,4% 12,5% 12,2% 8,2% 8,2% 8,1% 8,2% 5,3% 5,1% N/A N/A 5,8% 5,8% N/A N/A SD totale (fra le analisi 2 0,012 0,03 0,078 0,13 0,068 0,15 0,104 0,25 0,082 0,15 0,111 0,34 N/A N/A 0,028 0,04 0,056 0,23 %CV N/A N/A 20,0% 15,8% 10,5% 11,1% 12,5% 14,3% 7,1% 6,2% 4,7% 6,8% N/A N/A 5,8% 4,1% 3,4% 6,6% N/A = non applicabile 1 NCCLS EP5-A, Vol. 19, No 2, Pagina 24, Equazione (C2) 2 NCCLS EP5-A, Vol. 19, No 2, Pagina 25, Equazione (C3) e Equazione (C4) 89

B. Reattività crociata È stato eseguito uno studio su un lotto del kit Platelia Aspergillus EIA al fine di valutare l effetto di condizioni mediche non legate all aspergillosi invasiva che potrebbero interferire con il test. I seguenti campioni di siero sono stati analizzati per reattività crociata con Platelia Aspergillus EIA. Sono stati testati complessivamente 151 sieri. Patologia N. di campioni testati N. di positivi Fattore reumatoide 10 0 Positivo ANA 10 0 Ipergammaglobulinemia lgg 10 0 Ipergammaglobulinemia lgm 10 0 Tumore * 11 0 Cirrosi non virale (biliare primaria; Indotta da alcool; indotta da droghe) 10 0 Trasfusioni multiple 10 0 Donne multipare 10 0 HAV 10 0 HCV 10 0 Rosolia 10 0 CMV 10 0 Sifilide (RPR+) 10 0 Toxoplasmosi 10 0 Micoplasma 10 0 * Uno per ognuno dei seguenti tipi: vescica, seno (2), colon, endometrio, polmone, prostata, reni e cancro squamoso (3). C. Test clinici I test clinici per la valutazione di sensibilità, specificità e valore predittivo del Platelia Aspergillus EIA sono stati condotti presso due centri in Belgio e nei Paesi Bassi. Lo studio è stato condotto retrospettivamente utilizzando complessivamente 4873 campioni di siero prelevati da 203 pazienti dalle seguenti popolazioni*: pazienti senza segni di aspergillosi invasiva (pazienti di controllo) pazienti con aspergillosi invasiva probabile pazienti con aspergillosi invasiva accertata * L Invasive Fungal Infection Cooperative Group (IFICG) della European Organization for Research and Treatment of Cancer (EORTC) ed il Mycosis Study Group (MSG) del National Institute of Allergy and Infectious Diseases (NIAID) hanno definito i criteri per la diagnosi dell aspergillosi invasiva (IA) in pazienti con tumori maligni ematologici o trapianto ematopoietico di cellule staminali 2. L aspergillosi invasiva accertata è definita mediante coltura microbiologica positiva ottenuta con procedura sterile dal sito colpito e dalla dimostrazione istopatologica delle morfologie appropriate in un ospite con sintomi attribuiti all infezione fungina. L aspergillosi invasiva probabile è definita da almeno un criterio microbiologico e un criterio clinico maggiore o da due criteri clinici minori relativi ad un sito le cui caratteristiche sono compatibili con l infezione, in un ospite che presenta sintomi attribuiti all infezione fungina. L aspergillosi invasiva possibile è definita da almeno un criterio microbiologico o un criterio clinico maggiore o due criteri clinici minori relativi ad un sito con caratteristiche compatibili con l infezione, in un ospite che presenta sintomi attribuiti all infezione fungina. 90

Data la relativa rarità dell aspergillosi invasiva probabile e accertata, viene fornita di seguito la definizione di sensibilità e specificità clinica per gli scopi del presente studio. SENSIBILITÀ I risultati di questo studio sono stati analizzati in termini di sensibilità del paziente. I test di sensibilità sono stati eseguiti utilizzando Platelia Aspergillus EIA in due centri su un totale combinato di 38 episodi da 35 pazienti sottoposti a trapianto di midollo osseo (BMT) e affetti da leucemia ai quali era stata diagnosticata aspergillosi invasiva accertata o probabile. 1. Aspergillosi accertata (come definita da IFICG/EORTC; vedere quanto riportato sopra) Siti combinati N = 19 episodi da 16 pazienti Sensibilità: 100% (19/19). Nota: non è stato possibile calcolare l intervallo di confidenza del 95% a causa delle dimensioni insufficienti del campione. 2. Aspergillosi probabile (come definita da IFICG/EORTC; vedere quanto riportato sopra) Siti combinati N = 19 episodi da 19 pazienti Sensibilità: 94,7% (18/19). Nota: non è stato possibile calcolare l intervallo di confidenza del 95% a causa delle dimensioni insufficienti del campione. 3. Aspergillosi accertata e aspergillosi probabile combinate (come definita da IFICG/EORTC; vedere quanto riportato sopra) Siti combinati N = 38 episodi da 35 pazienti Sensibilità: 97,4% (37/38). L intervallo di confidenza del 95% è 86,2 99,9%. SPECIFICITÀ I test di specificità sono stati eseguiti utilizzando Platelia Aspergillus EIA in due centri su un totale combinato di 3691 campioni da 201 episodi (168 pazienti) senza segni di aspergillosi invasiva (pazienti di controllo). Centro 1: N = 3060 campioni da 103 episodi (70 pazienti) Specificità: 92,2% (95/103) L intervallo di confidenza del 95% è 85,3 96,6%. Centro 2: N = 631 campioni da 98 episodi (98 pazienti) Specificità: 88,8% (87/98) L intervallo di confidenza del 95% è 80,8-94,3%. Siti combinati N = 3691 campioni da 201 episodi (168 pazienti) Specificità: 90,5% (182/201) L intervallo di confidenza del 95% è 85,6 94,2%. VALORE PREDITTIVO I valori predittivi positivo e negativo (PPV, NPV) sono stati analizzati per la popolazione di pazienti dello studio, sulla base del tasso di prevalenza effettivo medio del 16% osservato nello studio. PPV: 66,1% (37/56) NPV: 99,4% (182/183) E stata inoltre effettuata una analisi considerando i risultati positivi quando 2 campioni consecutivi avevano un indice pari o superiore a 0,5. 91

Il rendimento è riassunto nella tabella che segue: Sensibilità* Specificità PPV NPV Siti combinati considerando 1 campione 0,5 97,4% (37/38) 90,5% (182/201) 66,1% (37/56) 99,4% (182/183) Siti combinati considerando 2 campioni consecutivi 0,5 92,1% (35/38) 97,5% (196/201) 87,5% (35/40) 98,5% (196/199) *: la sensibilità è stata calcolata su aspergillosi invasiva accertata e probabile. 16- CONTROLLO DI QUALITÀ DEL PRODUTTORE Tutti i reagenti prodotti sono preparati in base al nostro Sistema di Qualità, dal ricevimento delle materie prime fino alla commercializzazione del prodotto. Ogni lotto è sottoposto a valutazioni di controllo qualità e viene immesso sul mercato solo dopo la conferma di criteri di accettazione predefiniti. I dati relativi alla produzione e al controllo di ogni singolo lotto sono conservati da Bio-Rad. 17- BIBLIOGRAFIA Vedere la versione Inglese. 92

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