Linee guida legionellosi Roma 10-11 Novembre 2016 La Real-Time PCR per la ricerca di Legionella in campioni ambientali Maria Scaturro Dipartimento di Malattie infettive parassitarie ed immunomediate maria.scaturro@iss.it
Metodo colturale: Svantaggi Sensibilità: 5-90%; Richiede terreni specifici; Adeguato trattamento del campione; 3-5 gg per rilevare la crescita delle colonie; Non è in grado di rilevare le legionelle intra-amoeba; Non è in grado di rilevare le forme VNCB; Esperienza.
Esame colturale Vs PCR Coltura Batteri coltivabili Batteri che si duplicano (Batteri in buono stato) Unità formanti colonia/l 10-13 giorni per ottenere risultati PCR DNA genomico estratto dalle cellule. Indipendentemente dalle condizioni di crescita. Independentemente dalla presenza di altri batteri Indipendentemente dalla condizione intracellulare. Unità Genomiche/ L 1 giorno
Certezza del risultato negativo By Guillemet et al: Negative predictive value= 93% By Collins et al: Negative predictive value= 100% By Guillemet et al By Collins et al.
Certezza del risultato negativo
Linee guida 2015 Poiché la q-pcr è effettivamente vantaggiosa per molteplici aspetti ma non ancora validata a livello internazionale, essa può, ad oggi, essere solo consigliata per una rapida analisi di numerosi campioni prelevati da siti probabilmente associati ad un caso o ancor più a un cluster di legionellosi, potendo in tempi brevi escludere i siti negativi ed identificare quelli positivi.
Normativa ISO/TS 12869:2012 Water quality -- Detection and quantification of Legionella spp. and/or Legionella pneumophila by concentration and genic amplification by quantitative polymerase chain reaction (qpcr) NF T90-471 Juin 2015 Qualité de l'eau - Détection et quantification des Legionella et/ou Legionella pneumophila par concentration et amplification génique par réaction de polymérisation en chaîne en temps réel (qpcr). Tale normativa specifica i requisiti metodologici generali, di valutazione della performance e di controllo di qualità. I metodi basati su qpcr non danno informazione riguardo la presenza di cellule vive e cellule morte.
Linee Guida Italiane - Allegato 6: Ricerca di Legionella in campioni ambientali mediante Real-Time PCR Aspetti generali Personale qualificato, che conosco i fondamenti della biologia molecolare e della PCR, nonché appropriate conoscenze di microbiologia. Deve usare: Camice Guanti Materiale monouso Set di micropipette
Linee Guida Italiane - Allegato 6:Ricerca di Legionella in campioni ambientali mediante Real-Time PCR Aree di lavoro Campionamento Concentrazione Estrazione di DNA Amplificazione del DNA Controllo di inibizione Decontaminazione Condizioni generali per il test
Linee Guida Italiane - Allegato 6:Ricerca di Legionella in campioni ambientali mediante Real-Time PCR Aree di lavoro Il laboratorio dovrebbe contenere almeno tre aree fisicamente distinte: 1. Un area per la concentrazione e l estrazione del DNA 2. Un area per la preparazione delle reazioni di PCR 3. Un area per l amplificazione
Linee Guida Italiane - Allegato 6:Ricerca di Legionella in campioni ambientali mediante Real-Time PCR Campionamento I campioni devono essere raccolti in contenitori sterili, con tutte le precauzioni necessarie. Sul contenitore e/o su un registro devono essere indicati: luogo e data del prelievo, volume e temperatura e se è stato effettuato un trattamento con biocidi. Nel caso in cui si utilizzi la Real Time PCR per analisi di routine, se si prevede che il/i campioni siano negativi, è possibile campionare un solo litro. Nel caso in cui si debbano investigare cluster epidemici è sempre consigliato il prelievo di 2 litri d acqua che saranno utilizzati possibilmente mescolati in sospensione omogenea. Qualora non fosse possibile fare un unica sospensione, analizzare una prima metà di ciascun litro con la Real Time PCR ed eventualmente (se positivo in Real Time PCR) la seconda metà mediante coltura. Nel caso in cui un diverso volume d acqua è prelevato, bisogna indicarlo e tenerne conto nell analisi quantitativa. I campioni devono essere analizzati immediatamente o entro 24 h dal prelievo. In questo caso, i campioni devono essere conservati a 5 ± 3 C.
Linee Guida Italiane - Allegato 6:Ricerca di Legionella in campioni ambientali mediante Real-Time PCR Concentrazione Quando la concentrazione è ottenuta mediante filtrazione, i filtri devono essere in policarbonato o altro componente con bassa capacità di adsorbimento di proteine o DNA. Non si possono usare filtri in cellulosa. I filtri devono avere porosità 0.45μm. E preferibile non conservare i filtri a 5 ± 3 C, bensì procedere subito con l estrazione del DNA genomico.
Linee Guida Italiane - Allegato 6:Ricerca di Legionella in campioni ambientali mediante Real-Time PCR Estrazione del DNA La scelta del metodo di estrazione va fatta sulla base della migliore soluzione per la successiva fase di amplificazione del DNA. Il metodo andrebbe valutato mediante prove preliminari o su campioni test. Può essere eseguita direttamente sul filtro o dopo completa rimozione dei batteri (es.: sonicazione). Il DNA estratto può essere conservato a +4 C se analizzato in giornata, oppure a - 20 C per un alcuni mesi.
Linee Guida Italiane - Allegato 6:Ricerca di Legionella in campioni ambientali mediante Real-Time PCR Amplificazione del DNA E possibile utilizzare kit commerciali purchè validati secondo la normativa vigente. E anche possibile usare sistemi in house sempre purché conformi alle norme ISO e/o AFNOR. Un controllo negativo di estrazione deve comunque essere inserito. Mix di Amplificazione
Linee Guida Italiane - Allegato 6:Ricerca di Legionella in campioni ambientali mediante Real-Time PCR Controllo di inibizione Il controllo interno positivo (IPC) da certezza del campione negativo. Molti kit commerciali includono l IPC nella miscela di amplificazione.
Linee Guida Italiane - Allegato 6:Ricerca di Legionella in campioni ambientali mediante Real-Time PCR Decontaminazione Tutti i dispositivi riutilizzabili (rampa, funnels, pinzette etc) devono essere decontaminate immergendole in una soluzione 1,7% ipoclorito o 1% acido cloridrico o un detergente non ionico per almeno 30 min. e poi sciacquati con acqua distillata filtrata e sterilizzata a 121 ± 1 C per 20 min.
Linee guida italiane 2015 IMPORTANTE!! Tutti i campioni che risultano positivi alla PCR devono essere analizzati mediante coltura per poter determinare la concentrazione di Legionella nei campioni. La valutazione del rischio è espressa come CFU/L. La PCR non è in grado di discriminare DNA da batteri vivi o morti.
Conclusioni L introduzione della PCR come primo screening di numerosi campioni al fine di individuare rapidamente i campioni positivi è un passo molto importante verso un miglioramento del nostro servizio verso i cittadini. Non siamo ancora in grado di sostituire la PCR all esame colturale, e questo fondamentalmente perché i livelli di allerta e di azione sono espressi come CFU/L di Legionella.
Conclusioni Rimane dunque necessario effettuare l esame colturale dei campioni positivi alla PCR per definire la concentrazione di Legionella nel campione. Ma l esame colturale rimane importante anche perché l isolamento dei ceppi batterici ci consente ulteriori studi di tipizzazione dei ceppi, necessari per la corretta identificazione della fonte di infezione.
Grazie per l attenzione!