MODALITA' DI RICHIESTA: Pazienti interni: tramite modulo interno prestampato. Pazienti esterni: tramite richiesta del medico curante. CITOMEGALOVIRUS Ab IgM PREPARAZIONE DEL PAZIENTE ALL'ESAME: Il paziente deve trovarsi in condizioni basali dopo un digiuno di circa 10 ore. MODALITA' DI RACCOLTA DEL CAMPIONE: - Prelievo venoso. - Utilizzo del sistema sottovuoto o di siringa monouso o butterfly. - Utilizzo provetta senza additivi (rosso-marrone). MODALITA DI TRASPORTO DEL CAMPIONE: Pazienti interni: da ogni stanza i campioni sono portati da un infermiere in un contenitore adeguato in laboratorio. Pazienti esterni: dalla sala prelievi (attigua al laboratorio) i campioni, attraverso l apposita finestra, sono consegnati al laboratorio. Vedi procedura. MODALITA' DI CONSERVAZIONE DEL CAMPIONE: La provetta madre dopo essere stata processata è conservata tra 2 e 8 C per 6 giorni Se il campione non può essere processato subito, il surnatante è raccolto mediante pipetta monouso in una provetta di plastica tappata, su cui è applicata l etichetta con codice a barre, e conservata secondo le modalità previste dalla metodica descritta nella scheda tecnica. Evitare congelamenti ripetuti. FASE PRE-ANALITICA: Sulla provetta madre è posta un etichetta con codice a barre che permette la trasmissione bidirezionale dei dati (esami richiesti e relativi risultati) tra il PC dello strumento e il PC gestionale. La provetta madre è centrifugata a 3750 rpm per 8 minuti. FASE ANALITICA: La provetta madre è posizionata sul rack porta campioni dello strumento LIAISON dalla preanalitica COBAS p 312, che provvede alla registrazione del check-in e quindi processata secondo le modalità analitiche previste. FASE POST-ANALITICA: I dati ottenuti vengono validati tecnicamente poi clinicamente e quindi firmati digitalmente. CRITERI DI VALIDAZIONE DEL DATO ANALITICO: Analisi dei controlli qualità interni secondo le regole di Westgard e controlli qualità esterni (VEQ) VALORI PANICO: Non applicabile. CARATTERISTICHE E DESCRIZIONE DEL METODO (PRECISIONE ED ACCURATEZZA): Il metodo per la determinazione semi-quantitativa di IgM specifiche anti-hcmv è un test indiretto basato sul principio della chemiluminescenza (CLIA). L'antigene hcmv è usato per rivestire le particelle magnetiche (fase solida) e un anticorpo monoclonale di topo è legato ad un derivato dell'isoluminolo (coniugato anticorpo-isoluminolo). Durante la prima incubazione, gli anticorpi anti-hcmv presenti nei calibratori, nei campioni o nei controlli, legano la fase solida. Durante la seconda incubazione, l'anticorpo coniugato reagisce con le IgM anti-hcmv già legate alla fase solida. Dopo ciascuna incubazione, il materiale non legato è rimosso mediante un ciclo di lavaggio. In seguito, vengono aggiunti i reagenti starter che inducono una reazione di chemiluminescenza. Il segnale luminoso, e quindi la quantità di coniugato anticorpoisoluminolo, è misurato da un fotomoltiplicatore in unità relative di luce (RLU, relative light units) ed è indicativo della concentrazione di IgM anti-hcmv presente nei calibratori, nei campioni o nei controlli. Il tampone A contiene IgG di capra anti-igg umane come reattivo di assorbimento per ridurre le interferenze dovute alle IgG umane specifiche anti-hcmv o al fattore reumatoide.
PRECISIONE, ACCURATEZZA E SENSIBILITA : Vedi scheda tecnica. INTERFERENZE: Vedi scheda tecnica. SIGNIFICATIVITA (VARIABILITA ANALITICA E VARIABILITA BIOLOGICA): Vedi scheda tecnica. COMPILAZIONE, TRASMISSIONE E CONSEGNA REFERTI: I risultati, dopo la validazione tecnica sono controllati e validati clinicamente per poi essere firmati digitalmente dal responsabile del laboratorio o da chi ne fa le veci. Dopo la firma digitale i referti sono disponibili on line per essere visionati dai reparti se i pazienti sono interni. Per i pazienti esterni i referti possono essere stampati su richiesta alla segreteria o sono accessibili via internet tramite l utilizzo dell apposito codice rilasciato al momento dell accettazione del paziente dalla segreteria. PRINCIPALI CRITERI INTERPRETATIVI: Il Citomegalovirus (CMV) è un virus diffuso a livello globale appartenente alla famiglia degli Herpesvirus. Il virus è molto comune e può infettare chiunque, il 60-80% della popolazione risulta infettato senza sintomi. Una volta contratta l infezione, il virus rimane latente all interno dell organismo per tutta la vita, ma può riattivarsi in caso di indebolimento del sistema immunitario. Le infezioni da CMV sono nella maggior parte degli individui asintomatiche, perché un buon sistema immunitario è in grado di tenerle sotto controllo, ma negli individui immunodepressi possono causare gravi complicanze, in particolare a occhi, fegato, sistema gastrointestinale e sistema nervoso. L aspetto più importante legato al CMV, dal punto di vista medico, è rappresentato dalle infezioni congenite. Un infezione contratta durante la gravidanza nel 50% dei casi può essere trasmessa al feto, arrecandogli danni permanenti anche gravi, nel 5% dei casi può dare morte del feto o epato-splenomegalia, idrocefalia, microcefalia. TEMPO DI ATTESA PER L'ESAME: Uguale o inferiore a 8 ore. 08/04/2015
DiaSorin S.p.A. Via Crescentino snc - 13040 Saluggia (Vercelli) - Italy Tel. 39.0161.487.093 - Fax 39.0161.487.628 Attenzione alle modifiche! LIAISON CMV IgM (310750), LIAISON Control CMV IgM (310751) LIAISON CMV IgM (310750) 1. FINALITÀ DEL TEST Il test LIAISON CMV IgM impiega la tecnologia della chemiluminescenza (CLIA) in un saggio immunologico per la determinazione quantitativa di anticorpi specifici di classe IgM diretti contro il hcmv in campioni di siero o plasma umano. Il test deve essere eseguito sullo strumento LIAISON. 2. SIGNIFICATO CLINICO Il citomegalovirus umano (hcmv) appartiene alla famiglia degli Herpetoviridae ed è uno dei virus erpetici patogeni per l uomo. È ubiquitario, specie-specifico e la sua trasmissione è possibile solo in seguito a stretto contatto interumano. Il capside virale è icosaedrico, formato da 162 capsomeri e contiene il genoma a DNA. All'esterno del capside si trovano una o più membrane ovali contenenti lipidi. L'infezione da hcmv può essere primaria o secondaria. Si può contrarre l'infezione primaria attraverso diverse vie di trasmissione e in vari periodi della vita (infezione congenita e post-natale). Dopo l'infezione primaria, il hcmv entra in una fase di latenza durante la quale si riscontra nei linfociti B. Si può verificare la successiva riattivazione della replicazione virale (infezione secondaria) in occasione di modificazioni del rapporto tra ospite e virus, come nel caso di gravidanza, malattia grave, terapia immunosoppressiva o stress. L'infezione congenita è trasmessa per via transplacentare o al momento della nascita e si può osservare anche se la donna gravida presenta già anticorpi anti-hcmv (reinfezione con virus esogeno). Le conseguenze di un'infezione primaria da hcmv contratta durante la gravidanza da una donna sieronegativa possono essere aborto spontaneo, morte al momento della nascita o malformazioni neonatali, anche se si osserva la nascita di un bambino normale in quasi il 50% delle infezioni materne. Il quadro clinico dell'infezione congenita da hcmv è sempre grave e comprende ritardo psicomotorio, sordità, corioretinite, microcefalia, idrocefalo, cardiopatia, epatite, epatosplenomegalia, trombocitopenia. Il tasso di mortalità è molto elevato. La maggior parte dei soggetti (40-90%) contrae l infezione primaria da hcmv durante l infanzia o l'età adulta. Le infezioni post-natali sono trasmesse dal contatto con liquidi biologici infetti (urine, saliva, latte materno, liquido seminale, secrezioni della cervice uterina, feci), emoderivati infetti e, talvolta, trapianto di organi. Negli individui immunocompetenti, la maggioranza delle infezioni post-natali da hcmv è di lieve entità o asintomatica. La sintomatologia più comune comprende febbre, malessere generalizzato e aumento dei livelli di transaminasi sieriche senza ittero. Al contrario, negli individui immunocompromessi (pazienti sottoposti a trapianto di organi o affetti da AIDS, malattie linfoproliferative o tumori), i sintomi possono essere gravi, perché l infezione evolve in forma disseminata e/o viscerale, e comprendono splenomegalia, polmonite, anemia emolitica, miocardite ed encefalite. In questi pazienti la malattia può avere esito fatale. La risposta immunitaria al hcmv è rappresentata dalla sintesi di anticorpi della classe IgM qualche settimana dopo l'infezione e, una settimana più tardi, da quella di anticorpi della classe IgG. I livelli di IgM anti-hcmv aumentano di solito per qualche settimana e quindi diminuiscono lentamente nel corso di quattro-sei mesi. Talvolta le IgM possono persistere in circolo per anni. Il dosaggio delle IgM specifiche è importante per diagnosticare l'infezione acuta da hcmv, che resta di difficile identificazione sulla base della sola sintomatologia. Tuttavia, non è sempre possibile distinguere tra infezione primaria e secondaria, perché la riattivazione della malattia può indurre sintesi di IgM nei pazienti immunocompromessi. Il dosaggio delle IgG specifiche è utile per distinguere la popolazione che ha contratto la malattia da quella che non la ha contratta. Ciò è particolarmente importante per l'adozione di adeguate misure profilattiche nei pazienti recettivi. La determinazione dello stato immunitario nei riguardi del hcmv è importante (a) nei pazienti immunocompromessi, in cui la malattia può avere conseguenze gravi; (b) nelle donne in età fertile o in gravidanza, per evitare la trasmissione del virus al feto; (c) nei pazienti sottoposti a trapianto e nei donatori di organi e (d) nei donatori di sangue. Infatti i leucociti, in particolare i polimorfonucleati, possono veicolare il hcmv ed infettare così i pazienti trasfusi o trapiantati. La rilevazione di IgM anti-hcmv consente di adottare misure terapeutiche adeguate. La profilassi dell infezione da hcmv è attuabile mediante la somministrazione di immunoglobuline specifiche per il virus a titolo elevato. La malattia conclamata può inoltre essere trattata con agenti antivirali specifici. 3. PRINCIPIO DEL DOSAGGIO Il metodo per la determinazione quantitativa di IgM specifiche anti-hcmv è un test indiretto basato sul principio della chemiluminescenza (CLIA). L antigene hcmv è usato per rivestire le particelle magnetiche (fase solida) e un anticorpo monoclonale di topo è legato ad un derivato dell isoluminolo (coniugato anticorpo-isoluminolo). Durante la prima incubazione, i calibratori, i campioni o i controlli sono diluiti con il tampone A, che contiene IgG di capra anti-igg umane come reattivo di assorbimento per ridurre le interferenze dovute alle IgG umane specifiche anti-hcmv o al fattore reumatoide. Durante la seconda incubazione, gli anticorpi anti-hcmv presenti nei calibratori, nei campioni o nei controlli legano la fase solida. Durante la terza incubazione, l anticorpo coniugato reagisce con le IgM anti-hcmv già legate alla fase solida. Dopo ciascuna incubazione, il materiale non legato è rimosso mediante un ciclo di lavaggio. In seguito, vengono aggiunti i reagenti starter che inducono una reazione di chemiluminescenza. Il segnale luminoso, e quindi la quantità di coniugato anticorpo-isoluminolo, è misurato da un fotomoltiplicatore in unità relative di luce (RLU, relative light units) ed è indicativo della concentrazione di IgM anti-hcmv presente nei calibratori, nei campioni o nei controlli. CMV-m-it.fm 6 March 29, 2010 2:40 pm
4. MATERIALI FORNITI Integrale di reattivi Particelle magnetiche (2,3 ml) Calibratore 1 (2,3 ml) Calibratore 2 (2,3 ml) Tampone A (25 ml) Diluente dei campioni (28 ml) Coniugato (23 ml) Particelle magnetiche rivestite con antigene hcmv inattivato (ceppo AD 169), sieroalbumina bovina, tampone fosfato, < 0,1% sodio azide. Siero/plasma umano contenente bassi livelli di IgM anti-hcmv, sieroalbumina bovina, tampone fosfato, 0,2% ProClin 300 e un colorante giallo inerte. Le concentrazioni dei calibratori () sono tarate contro una preparazione anticorpale interna. Siero/plasma umano contenente alti livelli di IgM anti-hcmv, sieroalbumina bovina, tampone fosfato, 0,2% ProClin 300 e un colorante blu inerte. Le concentrazioni dei calibratori () sono tarate contro una preparazione anticorpale interna. IgG di capra anti-igg umane (reattivo di assorbimento), siero di capra, sieroalbumina bovina, tampone fosfato, 0,2% ProClin 300 e un colorante blu inerte. Sieroalbumina bovina, tampone fosfato, 0,2% ProClin 300 e un colorante giallo inerte. Anticorpi monoclonali di topo anti-igm umane coniugati con un derivato dell isoluminolo, IgG di topo policlonali aspecifiche, sieroalbumina bovina, tampone fosfato, 0,2% ProClin 300, conservanti. Numero di dosaggi 100 Tutti i reattivi sono forniti pronti per l uso. L ordine dei reattivi riflette quello con cui sono assemblati i contenitori nell integrale di reattivi. Materiali richiesti, ma non forniti Materiali raccomandati LIAISON Module (codice 319130). Controlli LIAISON CMV IgM (negativo e positivo) LIAISON Starter Kit (codice 319102). (codice 310751). LIAISON Light Check (codice 319101). LIAISON Wash/System Liquid (codice 319100). Altri materiali richiesti LIAISON Waste Bags (codice 450003). LIAISON Cleaning Kit (codice 310990). 5. AVVERTENZE E PRECAUZIONI Solo per uso diagnostico in vitro. Tutte le unità di siero e plasma utilizzate per la fabbricazione dei componenti di questo kit sono state analizzate e trovate non reattive per la presenza di HBsAg, anti-hcv, anti-hiv-1 ed anti-hiv-2. Tuttavia, poiché nessun metodo di analisi può dare assoluta certezza che siano assenti agenti patogeni, tutto il materiale di origine umana deve essere considerato potenzialmente infettivo e manipolato come tale. 6. REGOLE DI SICUREZZA Non mangiare, bere, fumare o applicare cosmetici durante l esecuzione del dosaggio. Non pipettare con la bocca. Evitare il contatto diretto con il materiale potenzialmente infetto indossando indumenti da laboratorio, occhiali protettivi e guanti monouso. Lavare accuratamente le mani al termine del dosaggio. Evitare di provocare schizzi o aerosol. Ogni goccia di reattivo biologico deve essere rimossa con una soluzione di sodio ipoclorito al 5% ed il mezzo utilizzato deve essere trattato come materiale di rifiuto infetto. Tutti i campioni, tutti i reattivi biologici del kit e tutti i materiali usati per effettuare il saggio devono essere considerati in grado di trasmettere agenti infettivi; pertanto i rifiuti devono essere smaltiti secondo le disposizioni legislative e la regolamentazione vigente in ciascun Paese. Il materiale monouso deve essere incenerito; i rifiuti liquidi devono essere decontaminati con sodio ipoclorito ad una concentrazione finale del 5% per almeno mezz ora. Qualsiasi materiale che deve essere riutilizzato va trattato in autoclave con un approccio di overkill (USP 24, 2000, p. 2143). Generalmente si considera che un'ora a 121 C sia un tempo di sterilizzazione adeguato; tuttavia si raccomanda a ciascun utilizzatore di verificare l'efficacia del ciclo di decontaminazione mediante una convalida iniziale e l'uso routinario di indicatori biologici. I reattivi contenenti ProClin 300 sono classificati irritanti secondo le Direttive Europee applicabili: R 43 - Può provocare sensibilizzazione per contatto con la pelle. S 24 - Evitare il contatto con la pelle. S 37 - Usare guanti adatti. S 60 - Questo materiale e il suo contenitore devono essere smaltiti come rifiuti pericolosi. 7. PREPARAZIONE DELL INTEGRALE DI REATTIVI Prima di rimuovere le pellicole sigillanti dai contenitori, è essenziale agitare orizzontalmente l integrale di reattivi con delicatezza ed estrema cura. Evitare la formazione di schiuma. Eliminare le pellicole sigillanti dai contenitori e ruotare avanti e indietro la rotellina dentata posta al di sotto del contenitore delle particelle magnetiche fino a che il colore della sospensione diventa bruno. Questa procedura inizia la risospensione delle particelle magnetiche. Asciugare accuratamente la superficie di ciascun setto per eliminare il liquido residuo. Posizionare quindi l integrale di reattivi nell area reagenti dello strumento con l etichetta dei codici a barre posta a sinistra e lasciar agitare per 30 minuti prima dell uso. In questo periodo le particelle magnetiche vengono tenute automaticamente in agitazione per assicurare una risospensione completa. Fare riferimento al manuale operativo dello strumento per caricare i campioni e iniziare il test. CMV-m-it.fm 7 March 29, 2010 2:40 pm
8. CONSERVAZIONE E STABILITÀ DELL INTEGRALE DI REATTIVI Al momento dell arrivo, l integrale di reattivi deve essere mantenuto in posizione verticale per facilitare la risospensione delle particelle magnetiche. Se l integrale è conservato sigillato e mantenuto in posizione verticale, i reattivi sono stabili a 2-8 C fino alla data di scadenza. Non congelare. L integrale di reattivi non deve essere usato oltre la data di scadenza riportata sulle etichette del kit e dell integrale. Dopo l eliminazione delle pellicole sigillanti, l integrale di reattivi è stabile per otto settimane se conservato refrigerato a 2-8 C oppure nell area reagenti dello strumento. 9. PRELIEVO E PREPARAZIONE DEI CAMPIONI Il dosaggio può essere effettuato in campioni di siero o plasma umano. Possono essere utilizzati anticoagulanti come citrato, EDTA e eparina. Prelevare il sangue per puntura venosa, lasciarlo coagulare e separare il siero dal coagulo al più presto. Chiarificare per filtrazione o centrifugazione prima del test i campioni che presentano materiale in sospensione, opalescenza, lipemia o residui eritrocitari. Non usare campioni fortemente emolizzati o lipemici, né campioni che presentano materiale in sospensione o evidente contaminazione microbica. Eliminare le bolle di aria eventualmente presenti prima del dosaggio. Se il dosaggio è eseguito nei sette giorni successivi al prelievo, i campioni possono essere conservati a 2-8 C. In caso contrario, devono essere suddivisi in aliquote congelate a 20 C o a temperature inferiori. Se i campioni sono stati scongelati, agitare con cura prima di dosarli. Cinque campioni di diversa reattività sono stati conservati per sette giorni a 2-8 C e sono stati sottoposti a sei cicli di congelamento e scongelamento. I risultati non hanno mostrato differenze significative. Il volume minimo di campione necessario è 170 µl (20 µl di campione + 150 µl di volume morto). 10. TARATURA Il dosaggio dei calibratori contenuti nell integrale di reattivi permette di ritarare la curva predefinita memorizzata dal fabbricante nello strumento come indicato dai codici a barre riportati sull etichetta dell integrale di reattivi. Lo strumento deve essere tarato in triplicato ogniqualvolta si verifica una delle condizioni seguenti: Viene usato un nuovo lotto di integrale di reattivi o un nuovo lotto di reagenti starter. La taratura precedente è stata eseguita più di quattro settimane prima. Lo strumento ha subito un intervento di assistenza tecnica. I valori dei controlli sono al di fuori dei limiti attesi. 11. PROCEDIMENTO OPERATIVO Per ottenere prestazioni analitiche ideali è necessario attenersi scrupolosamente al manuale operativo dello strumento. Tutti i parametri del test vengono identificati attraverso i codici a barre riportati sull etichetta dell integrale di reattivi. In caso di malfunzionamento del lettore di codici a barre, i dati possono essere inseriti manualmente. Fare riferimento al manuale operativo dello strumento per informazioni più dettagliate. Lo strumento esegue le seguenti operazioni: 1. Distribuire calibratori, controlli o campioni nel modulo di reazione. 2. Distribuire il tampone A. 3. Incubare. 4. Distribuire le particelle magnetiche rivestite. 5. Distribuire il diluente dei campioni. 6. Incubare. 7. Lavare con il liquido di lavaggio. 8. Distribuire il coniugato nel modulo di reazione. 9. Incubare. 10. Lavare con il liquido di lavaggio. 11. Aggiungere i reagenti starter e misurare la luce emessa. 12. CONTROLLO DI QUALITÀ Si suggerisce di eseguire il controllo di qualità una volta per ogni giorno di lavoro, o secondo le disposizioni legislative e la regolamentazione vigente in ciascun Paese. I controlli LIAISON sono disponibili per il controllo di qualità da eseguire all interno dei laboratori di analisi. Ogniqualvolta i valori dei controlli sono al di fuori dei limiti attesi, la taratura deve essere rieseguita e i controlli devono essere rianalizzati. Le prestazioni di altri controlli devono essere valutate per assicurarne la compatibilità con questo test prima dell uso. È indispensabile pertanto stabilire gli intervalli dei valori. 13. INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI Lo strumento calcola automaticamente le concentrazioni di IgM anti-hcmv espresse in e classifica i risultati. Fare riferimento al manuale operativo dello strumento per informazioni più dettagliate. Intervallo di misura. 0-240 di IgM anti-hcmv. I campioni contenenti concentrazioni di anticorpo maggiori dell'intervallo di misura possono essere prediluiti mediante la funzione Dilute dello strumento e ridosati (il fattore di diluizione consigliato è 1:10). I risultati saranno quindi moltiplicati automaticamente per il fattore di diluizione per ottenere i livelli anticorpali dei campioni non diluiti. Il diluente dei campioni disponibile in eccesso nell'integrale di reattivi permette la prediluizione di 100 campioni. I risultati dei campioni devono essere interpretati come segue: I campioni con concentrazioni di IgM anti-hcmv al di sotto di 15 sono da classificare negativi. I campioni con concentrazioni di IgM anti-hcmv comprese tra 15 e 30 sono da classificare dubbi. I campioni con concentrazioni di IgM anti-hcmv uguali o al di sopra di 30 sono da classificare positivi. Un risultato positivo indica la presenza di IgM in seguito ad un infezione primaria, riattivata o ad un infezione pregressa con persistenza delle IgM. Un risultato dubbio può indicare la presenza di IgM anti-hcmv a bassi livelli. I dati sierologici derivanti dalla rilevazione di altri indicatori di hcmv (per esempio, l avidità delle IgG) possono fornire informazioni utili per l interpretazione dei risultati. Un risultato negativo indica l assenza di IgM rilevabili, però, non esclude per certo un'infezione acuta da hcmv. Se si sospetta che il paziente sia stato esposto al hcmv anche se il dosaggio delle IgM è negativo, bisogna prelevare e dosare un secondo campione almeno una o due settimane più tardi. La diagnosi di una malattia infettiva non deve essere formulata sulla base del risultato di un singolo dosaggio, ma questo deve essere valutato insieme ad altri riscontri clinici, procedure diagnostiche e al giudizio del medico. CMV-m-it.fm 8 March 29, 2010 2:40 pm
Nota - Il kit LIAISON CMV IgM misura la concentrazione delle IgM anti-hcmv con altissima sensibilità e permette pertanto la rilevazione molto precoce degli anticorpi all inizio dell infezione acuta. Per interpretare correttamente il significato della reattività per le IgM, i laboratori devono adottare altre procedure diagnostiche (per esempio, determinazione dell avidità delle IgG e/o test diversi per le IgM) dal momento che le IgM anti-hcmv possono persistere nel tempo a livelli bassi nell infezione riattivata e i campioni contenenti bassi livelli di IgM persistenti sono dubbi o positivi al test. I laboratori possono anche non adottare la zona grigia per aumentare la specificità diagnostica del kit LIAISON CMV IgM. Livelli elevati o medi di anticorpi IgM anti-hcmv compaiono generalmente durante lo stadio precoce dell infezione, mentre le IgM persistenti sono presenti a livelli inferiori prima di scomparire: la finestra della positività per le IgM durante il decorso dell infezione è pertanto spostata verso la fase precoce. Il rischio di non rilevare campioni di pazienti in fase acuta è trascurabile ed ulteriormente ridotto dalla pratica di prelevare un secondo campione dai pazienti negativi una o due settimane più tardi. Se si sceglie di non adottare la zona grigia, i risultati dei campioni devono essere interpretati come segue: I campioni con concentrazioni di IgM anti-hcmv al di sotto di 30 sono da classificare negativi. I campioni con concentrazioni di IgM anti-hcmv uguali o al di sopra di 30 sono da classificare positivi. La tabella riportata nel capitolo 15.6 mostra dettagliatamente i risultati osservati durante gli studi clinici. 14. LIMITI DEL DOSAGGIO Per ottenere risultati affidabili è necessario attenersi strettamente alle istruzioni per l uso e possedere una adeguata manualità tecnica. Contaminazione batterica dei campioni o inattivazione con il calore possono influenzare i risultati del saggio. 15. PRESTAZIONI METODOLOGICHE DEL KIT 15.1. Specificità analitica La specificità analitica è definita come la capacità del test di rilevare esattamente l'analita in presenza di fattori potenzialmente interferenti nella matrice del campione (per esempio, anticoagulanti, emolisi, effetti di trattamenti del campione) o di reazioni crociate con anticorpi potenzialmente interferenti. Interferenze. Studi controllati su fattori potenzialmente interferenti hanno dimostrato che le prestazioni del test non sono influenzate da anticoagulanti (sodio citrato, EDTA, eparina), emolisi (fino a 1000 mg/dl di emoglobina), lipemia (fino a 3000 mg/dl di trigliceridi), bilirubinemia (fino a 20 mg/dl di bilirubina) o da cicli di congelamento e scongelamento dei campioni. Reazioni crociate. Di regola, la presenza di anticorpi potenzialmente interferenti non interferisce nel dosaggio. Gli anticorpi studiati sono stati: (a) immunoglobuline dirette contro vari agenti etiologici come HSV, hhv 6, EBV, VZV, parvovirus B19, HAV, Mycoplasma pneumoniae (b) anticorpi anti-nucleari (ANA) e fattore reumatoide (immunoglobuline anti-fc). 15.2. Precisione La ripetibilità e la riproducibilità del saggio (ossia la variabilità intra-saggio e inter-saggio) sono state determinate utilizzando dei campioni di riferimento a diverse concentrazioni di analita. La variabilità osservata non ha dato luogo ad errata classificazione dei campioni. Ripetibilità A B C D Numero di determinazioni 20 20 20 20 Media () 18,0 29,0 60,0 145,0 Deviazione standard 0,45 1,98 5,38 12,30 Coefficiente di variazione (%) 2,5 6,9 8,9 8,5 Riproducibilità E F D Numero di determinazioni 20 20 20 Media () 46,0 96,0 144,0 Deviazione standard 3,40 11,20 10,50 Coefficiente di variazione (%) 7,4 11,6 7,3 15.3. Esattezza L esattezza del dosaggio è stata controllata mediante il test di diluizione. Test di diluizione. Sono state dosate diluizioni scalari di quattro sieri a concentrazione elevata di IgM anti-hcmv effettuate con il diluente dei campioni. Le concentrazioni misurate di IgM anti-hcmv ottenute in funzione delle concentrazioni attese sono state analizzate con la regressione lineare. I coefficienti di correlazione (r) erano compresi tra 0,983 e 0,999. Diluizione attesa, misurata, % Recupero Diluizione attesa, misurata, % Recupero in toto 192,0 in toto 188,0 1:2 96,0 92,0 95,6 1:2 94,0 112,0 119,1 1:4 48,0 60,0 125,0 1:4 47,0 61,0 129,8 1:8 24,0 26,0 108,3 1:8 24,0 28,0 116,7 1:16 12,0 12,0 100,0 1:16 12,0 12,0 100,0 in toto 122,0 in toto 112,0 1:2 61,0 63,0 103,3 1:2 56,0 60,0 107,1 1:4 30,0 29,0 96,7 1:4 28,0 29,0 103,6 1:8 15,0 14,0 93,3 1:8 14,0 15,0 107,1 15.4. Effetto trascinamento L effetto trascinamento (carryover) è stato studiato dosando tre campioni negativi prima e dopo un campione alto positivo. I risultati ottenuti permettono di dimostrare che non si verifica effetto trascinamento utilizzando lo strumento LIAISON. CMV-m-it.fm 9 March 29, 2010 2:40 pm
15.5. Effetto saturazione ad alte dosi Quando si dosano campioni contenenti concentrazioni anticorpali estremamente elevate, è possibile ottenere dei livelli apparenti di anticorpo inferiori al reale per effetto della saturazione. Un metodo ben ottimizzato a due incubazioni esclude però che si ottengano risultati grossolanamente sottostimati, perché il segnale analitico resta sempre elevato (curva a saturazione). La presenza di un effetto saturazione è stata valutata analizzando due campioni positivi per IgM anti-hcmv ad alto titolo. Tutti i campioni hanno presentato valori di concentrazione al di sopra dell intervallo di misura, come ci si aspetta da campioni ad alto titolo, indicando che la classificazione dei campioni resta corretta. 15.6. Specificità e sensibilità diagnostiche La specificità e la sensibilità diagnostiche sono state valutate dosando 1709 campioni singoli o prelevati in successione selezionati da diverse popolazioni (soggetti mai infettati da hcmv, donne in gravidanza, soggetti affetti da malattie autoimmuni, pazienti affetti da altre malattie infettive con sintomatologia simile, pazienti affetti da infezione primaria da hcmv, soggetti con infezione pregressa da hcmv, pazienti affetti da sospetta infezione riattivata da hcmv, soggetti con persistenza delle IgM anti-hcmv, soggetti sottoposti ad esami per l individuazione di hcmv, soggetti positivi per IgM anti-hcmv). I campioni sono stati esaminati con diversi metodi di confronto e si sono impiegati la regola del consenso generale e i dati clinici e sierologici per stabilire i risultati attesi. 132 campioni sono stati classificati dubbi con i metodi di riferimento e pertanto sono stati esclusi dall analisi dei risultati. Tra i 1133 campioni presumibilmente negativi esaminati durante gli studi clinici, 17 campioni sono risultati positivi, 65 campioni sono risultati dubbi (reattivi) e 1051 campioni sono risultati negativi. La specificità diagnostica era 92,76% (1051/1133) adottando la zona grigia che classifica come reattivi i campioni positivi e dubbi (intervallo di confidenza al 95%: 91,10-94,21%). La specificità diagnostica era 98,50% (1116/1133) non adottando la zona grigia (intervallo di confidenza al 95%: 97,60-99,12%). Tra i 444 campioni presumibilmente positivi esaminati durante gli studi clinici, 432 campioni sono risultati positivi, 11 campioni sono risultati dubbi (reattivi) e un campione è risultato negativo. La sensibilità diagnostica era 99,77% (443/444) adottando la zona grigia che classifica come reattivi i campioni positivi e dubbi (intervallo di confidenza al 95%: 98,75-99,99%). La sensibilità diagnostica era 97,30% (432/444) non adottando la zona grigia (intervallo di confidenza al 95%: 95,33-98,59%). Diversi studi clinici sono stati eseguiti in laboratori specializzati per convalidare la capacità del test di rilevare correttamente l infezione acuta da hcmv. Sono stati analizzati 343 campioni selezionati di cui 211 campioni sono stati ottenuti da soggetti con sospetta infezione primaria da hcmv e 132 campioni sono stati ottenuti da soggetti con una diagnosi che escludeva l infezione primaria da hcmv. Nella popolazione studiata di pazienti con infezione acuta da hcmv, nessun campione è risultato al di sotto di 15, 3 campioni sono risultati compresi tra 15 e 30 e 208 campioni sono risultati al di sopra di 30. La sensibilità diagnostica era 98,58% non adottando la zona grigia (intervallo di confidenza al 95%: 95,90-99,70%). Nella popolazione studiata di soggetti con persistenza delle IgM, nessun campione è risultato al di sotto di 15, 8 campioni sono risultati compresi tra 15 e 30 e 124 campioni sono risultati al di sopra di 30. La sensibilità diagnostica era 93,94% non adottando la zona grigia (intervallo di confidenza al 95%: 88,41-97,35%). Valore soglia Numero di campioni Campioni negativi per IgM anti-hcmv Infezione primaria da hcmv No infezione primaria da hcmv Campioni positivi per IgM anti-hcmv < 15 1709 92,8% 0,0% 0,0% 1,0% 15-30 5,7% 1,4% 6,1% 0,0% 30 1,5% 98,6% 93,9% 99,0% LIAISON Control CMV IgM (310751) 1. Finalità del test. I controlli LIAISON Control CMV IgM (310751) devono essere impiegati nel saggio immunologico di chemiluminescenza (CLIA) LIAISON come mezzo per controllare l affidabilità delle sessioni di dosaggio. Le prestazioni metodologiche dei controlli LIAISON non sono definite con altri dosaggi o strumenti automatici. 2. Materiali forniti Controllo negativo (2 x 0,7 ml) Siero/plasma umano non reattivo per IgM anti-cmv, stabilizzato in tampone TRIS, 0,2% ProClin 300, conservanti. Controllo positivo (2 x 0,7 ml) Siero/plasma umano reattivo per IgM anti-cmv, stabilizzato in tampone PBS, sieroalbumina bovina, 0,2% ProClin 300 e un colorante giallo inerte. Tutti i reattivi sono forniti pronti per l uso. L intervallo delle concentrazioni di ogni controllo è stampato sul certificato di analisi e indica i limiti stabiliti da DiaSorin per i valori dei controlli ottenuti con dosaggi affidabili. Ogni laboratorio è responsabile di adottare limiti diversi per soddisfare esigenze specifiche. I controlli non sono specifici per lotto di kit. Si possono scambiare tra loro anche se appartengono a lotti diversi. 3. Conservazione e stabilità. Al momento dell arrivo, i controlli devono essere conservati a 2-8 C e mantenuti in posizione verticale per evitare il contatto della soluzione con il tappo del flacone. Non congelare. Se i controlli sono conservati sigillati in posizione verticale, essi sono stabili a 2-8 C fino alla data di scadenza. Dopo l apertura, i controlli sono stabili per otto settimane se conservati refrigerati a 2-8 C tra due usi successivi. Evitare la contaminazione batterica dei controlli. Non usare i controlli oltre la data di scadenza indicata sulle etichette dei flaconi. Al momento dell uso, equilibrare i controlli a temperatura ambiente (20-25 C) prima di aprire i flaconi e lasciarli nell area campioni dello strumento solo durante il tempo necessario ad eseguire il test di controllo di qualità. Dopo l uso, tappare i flaconi al più presto e conservarli a 2-8 C in posizione verticale. Il volume morto è 400 µl. 200/007-826, I - 02/2010 CMV-m-it.fm 10 March 29, 2010 2:40 pm