Eredita e Materiale Ereditario La vita e comparsa sulla terra circa tre miliardi e mezzo di anni fa. Due cara5eris6che dis6nguono le en6ta viven6 da quelle non viven6: Il ricambio: processo con il quale i viven6 traggono dal mondo esterno le sostanze con cui edificano il proprio corpo e da cui traggono l energia per il compimento delle loro funzioni. L ereditarieta : la cara5eris6ca per la quale il vivente genera discendenze a lui simili, sia nelle forme che nelle funzioni. La cellula: sistema capace di autoregolarsi e autoriprodursi, due cara5eris6che del vivente. La riproduzione con la formazione di nuovi individui assicura la con6nuita della vita. Eredita e Variabilita I figli sono in una certa misura somiglian6 ai genitori e tra di loro (eredita ) ma nello stesso tempo mostrano anche delle differenze piu o meno marcate (variabilita ).
La vita e comparsa sulla terra circa tre miliardi e mezzo di anni fa. Due cara5eris6che dis6nguono le en6ta viven6 da quelle non viven6: Esseri viventi o forme di vita Ereditarietà È la caratteristica per la quale il vivente genera discendenze (riproduzione) a lui simili sia nelle forme che nelle funzioni Ricambio Processo con il quale i viventi traggono dal mondo esterno le sostanze con cui edificano il proprio corpo e da cui traggono l energia per il compimento delle loro funzioni; ciò che non viene utilizzato è restituito in genere trasformato all ambiente Il ricambio e l ereditarietà sono i due caratteri che distinguono le entità viventi dalle entità non viventi La materia vivente è sempre organizzata in cellule
La cellula è l unico sistema conosciuto, che essendo capace di autoregolarsi e autoriprodursi, possiede pienamente i caratteri del vivente Procariotica Eucariotica Cellule batteriche e alghe verdi-azzurre Tutte le altre cellule
Virus Possibilità di riprodursi = esseri viventi soltanto all interno di una cellula Test a Coll Collar o e Stilo Fibre della coda
Duplicazione dei virus
Cellula procariotica Dimensione (ø): 0,1 6 µm Visibilità: microscopio Forma: diversificata (sferica, bastoncello, etc.) Composta da: Parete cellulare Membrana plasmatica Citoplasma Ribosomi Mesosoma Nucleoide
Forma: variabile Composta da: Cellula eucariotica Parete cellulare Membrana plasmatica Citoplasma Mitocondri Reticolo endoplasmatico Ribosomi Apparato del Golgi Lisosomi Centrioli (animali) Plastidi (vegetali) Vacuoli (vegetali) Nucleo circondato da un involucro nucleare Nucleoplasma (o succo nucleare) Acido nucleico + proteine Cromatina ð Cromosomi (divisione cellulare) Nucleoli
Eredità e Materiale ereditario Come si propagano gli esseri viventi? Riproduzione: assicura la continuità della vita e consiste nella formazione di nuovi individui Eredità: individui somiglianti in una certa misura ai genitori e tra di loro Variabilità: individui mostrano, rispetto ai genitori e tra loro, delle differenze più o meno marcate
Eredità Organismi pluricellulari: nel processo riproduttivo alcune cellule si separano dai genitori per dare origine a individui nuovi Riproduzione: Asessuata o Agamica Sessuata o Gamica La singola cellula o il gruppo di cellule destinate alla creazione di nuovi individui sono geneticamente uguali tra loro e uguali al genitore. Essi costituiscono nel loro insieme un Clone o Stirpe clonale DUE cellule riproduttive ben distinte (GAMETI : u o v o :spermi) si uniscono in un processo detto FECONDAZIONE per dare origine ad UNA singola cellula chiamata ZIGOTE da cui avrà origine un nuovo individuo
Eredità Patrimonio ereditario Gameti Individuo ð nucleo Informazioni in Codice Mutazione Eredità Modificazione del messaggio
Eredità Espressione di un carattere Fattore Genetico Insieme delle informazioni in codice contenute nei nuclei di un individuo costituiscono: Fattore Ambientale Espressione somatica dei caratteri la cui informazione è contenuta nel genotipo GENOTIPO AMBIENTE FENOTIPO
Eredità Carattere = Colore del mantello T corporea che inibisce la formazione del pigmento nero dei peli Coniglio imalaiano Eredità possibilità che il sistema di formazione del pigmento reagisca alla T in un determinato modo Grado Fenotipico del Genotipo Ampiezza entro cui il colore del mantello può variare Il gene per il colore nero ha un grado limitato di espressione fenotipica
Eredità Carattere = Colore del grasso Conigli selvatici = Grasso bianco Conigli allevati = Grasso giallo Coniglio selvatico Eredità Produzione di un enzima nel fegato capace di scomporre la xantofilla (pigmento giallo contenuto negli alimenti) Fenotipo Produzione di grasso bianco nei conigli allevati quando non alimentati con razione priva di xantofilla 1) Grasso bianco = azione genica 2) Grasso bianco = azione ambientale FENOCOPIE
Variabilità VARIABILITA (o diversità): presenza di individui dissimili in una popolazione Variabilità Genetica Variabilità Ambientale Sistema Riproduttivo della specie RIPRODUZIONE AGAMICA CLONE o Stirpe clonale Deriva, direttamente o indirettamente, da parti somatiche di un unico individuo iniziale NON PRESENTA VARIABILITA DI ORIGINE GENETICA SOLTANTO DI ORIGINE AMBIENTALE
Variabilità VARIABILITA (o diversità): presenza di individui dissimili in una popolazione Variabilità Genetica Variabilità Ambientale Sistema Riproduttivo della specie Come viene scambiato il materiale genetico all interno delle popolazioni??????
Variabilità Piante ALLOGAME Piante in cui prevale l INCROCIO La fecondazione di un gamete femminile avviene ad opera di un gamete maschile fornito da un ALTRO individuo AMPIA VARIABILITA FENOTIPICA DETERMINATA SIA DA EFFETTI GENETICI CHE AMBIENTALI
Variabilità Piante AUTOGAME Piante in cui prevale l AUTOFECONDAZIONE Il gamete femminile viene fecondato da un gamete maschile fornito dallo STESSO individuo GLI INDIVIDUI CHE PROVENGONO DA UN UNICO CAPOSTIPITE NON DIFFERISCONO TRA DI LORO E DALLA PIANTA MADRE LINEA PURA = VARIABILITA AMBIENTALE
Variabilità La VARIABILITA è un mezzo che consente agli individui (variabilità ambientale) e alle popolazioni (variabilità genetica) di adattarsi alle mutevoli condizioni ambientali Perpetuazione della specie Specie: insieme di individui che si possono fecondare liberamente dando progenie illimitatamente feconde
Materiale Ereditario Le informazioni genetiche di un individuo sono contenute, in codice, nel NUCLEO Quali possono essere le sostanze (proteine, lipidi, acidi, ecc.) nelle quali sono scritte queste informazioni?
Materiale Ereditario Caratteristiche del materiale ereditario 1) Replicarsi accuratamente durante la crescita e la divisione cellulare 2) Possedere una struttura sufficientemente stabile in modo che i cambiamenti ereditari (mutazioni) avvengano raramente 3) Portare tutta l informazione biologica 4) Essere capace di trasferire tale informazione a tutte le cellule 1869: Miescher - separazione nucleo citoplasma - acidi nucleici - nucleoproteine = acidi nucleici + proteine
Esperimenti di Griffith (1928) Ceppi di batterio Diplococcus pneumoniae, agente patogeno della polmonite dei topi: 1) Con superficie cellulare liscia (S, smooth) - virulento 2) Con superficie cellulare rugosa (R, rough) non virulento Conclusione: Un cos6tuente cellulare e passato dalle cellule S uccise alle cellule R vive determinando la trasformazione in cellule S.
Esperimen6 di Avery, McLeod e McCarty (1944) Stessi ceppi di Griffith Mortaio, pestello e sostanza abrasiva Ceppo R +
Esperimen6 di Avery, McLeod e McCarty (1944)
Esperimen6 di Hershey e Chase (1952) Involucro proteico Batteriofago: virus (0,1-0,2 µm), contengono sia proteine che acidi nucleici Acido nucleico Fibre della coda Viroidi: molecole circolari di RNA non codificanti per proteine, agenti di malattie delle piante. Prioni: contengono solo proteine mutate capaci di catalizzare il cambiamento delle proteine non mutate presenti nell organismo in proteine mutate. Di solito agenti di malattie nei mammiferi (encelofalopatie spongiformi trasmissibili). - P fa parte degli acidi nucleici - S fa parte delle proteine
Materiale Ereditario 1952 Fraenkel-Conrat Eredità dei virus legata all acido nucleico RNA Mutanti Proteine Acido nucleico Tutti questi esperimenti hanno dimostrato in modo definitivo che gli ACIDI NUCLEICI sono il MATERIALE EREDITARIO
DNA (nucleo) RNA (citoplasma) Acidi Nucleici Struttura chimica 1931 - Levene Acidi nucleici (DNA e RNA) Nucleotidi Gruppo fosforico Zucchero pentoso Base azotata
Struttura chimica Acidi Nucleici Basi azotate RNA
Acidi Nucleici
Struttura chimica Acidi Nucleici Nel DNA e RNA 4 nucleosidi diversi a seconda della base azotata Adenosina Guanosina Citidina Timidina e Uridina Zucchero C1 Purine N9 9 c 1 c 1 1 Zucchero C1 Pirimidine N1
Struttura chimica Acidi Nucleici Zucchero C5 Adenosina monofosfato
Acidi Nucleici
Acidi Nucleici I 4 nucleotidi sono presenti in uguali proporzioni? Rapporto tra Purine e Pirimidine 1:1
Base Gruppo fosforico Nucleoside Zucchero Nucleotide
Un Gene Un Enzima Garrod (1902) me5e in relazione il materiale ereditario con par6colari reazioni chimiche. L alcaptonuria si manifesta con il colore nero delle urine per il malfunzionamento di un enzima (C). Studiando gli alberi genealogici dimostrò che la trasmissione della malattia non dipende direttamente dal materiale ereditario ma è ad esso collegato tramite un enzima Un gene una catena polipep6dica. Ad es. Anemia Falciforme: I sogget affet della malata hanno un alterazione della molecola di emoglobina che provoca la forme falciforme dei globuli rossi in condizioni di carenza di ossigeno (dovuto alla sos6tuzione di un aminoacido).
Watson e Crick (1953): ipotizzarono che la molecola di DNA consiste di due nastri di strutture complementari avvolti a spirale l uno sull altro (doppia elica). Ogni nastro è un polinucleotide in cui i nucleotidi sono legati tra di loro dal gruppo fosforico in posizione 3 dello zucchero che li costituisce. Le basi sono situate perpendicolarmente all asse dell elica e quelle che appartengono alle due eliche diverse sono tenute insieme da legami idrogeno I legami idrogeno sono molto specifici: Adenina legata a Timina e Guanina alla Citosina. (Premio Nobel con Wilkins nel 1962) Struttura del DNA Passi successivi Chargaff Stessa quantità di purine e pirimidine nel DNA Si trovano appaiate nel DNA Wilkins e Franklin Ai raggi X la molecola era costituita da più di un filamento (diametro di circa 1 A (Angstrom) = 1 X 10-10 m)
Acidi Nucleici Molecola di DNA = catena costituita da più di un filamento filamento Catena di diametro di 20 Å caratterizzata da gruppi omogenei ogni 3,4 Å 1953 - Watson e Crick
Acidi Nucleici Due nastri di strutture complementari avvolte ad elica C5 C5 C3 C3 Nastro o filamento = Polinucleotide Il gruppo fosforico di un nucleotide si lega con il C3 dello zucchero dell altro nucleotide (Legame Fosfodiesterico) Basi situate perpendicolarmente all asse dell elica Struttura a doppia elica
Acidi Nucleici I due filamenti sono uniti da legami idrogeno specifici tra le basi C3 C3 C5 C5 Struttura a doppia elica
Acidi Nucleici Legami idrogeno specifici tra le basi Adenina - Timina 2 legami H Combinazioni A-T T-A C-G G-C Guanina - Citosina 3 legami H
Acidi Nucleici Visto le dimensioni molecolari delle basi soltanto questo tipo di appaiamento assicura la formazione di una struttura ad elica regolare (diametro costante)
Le basi si susseguono lungo i filamenti in modo complementare (catena polinucleotidica) Acidi Nucleici Zuccheri + Gruppi fosforici sempre uguali NESSUNA INFORMAZIONE GENETICA costituiscono lo scheletro INFORMAZIONE ECLUSIVAMENTE NELLA SEQUENZA DELLE BASI
Acidi Nucleici
La Replicazione del DNA La trasmissione del codice gene6co dai genitori ai figli avviene grazie a due funzioni del DNA: la replicazione e la sintesi proteica. Prima di ogni mitosi le molecole del DNA che formano i cromosomi si replicano e così si formano cellule uguali tra di loro. Il DNA si apre come una cerniera: i legami tra le basi azotate si rompono e i due filamen6 si separano, ciascun filamento funge da stampo per la formazione di un nuovo filamento, rispe5ando i legami A- T, C- G.
Replicazione del DNA Molecola di DNA: sistema a due filamenti fra loro complementari (es. cerniera) Rottura dei legami H Ciascun filamento può servire da stampo per la formazione di un secondo filamento ad esso complementare I vecchi filamenti si integrano con due nuovi complementari. ESATTA REPLICAZIONE DEL DNA E DELL INFORMAZIONE GENETICA
Due legami Idrogeno tra Adenina e Timina Tre legami Idrogeno tra Guanina e Citosina
Direzione 5-3 Direzione 3-5
Replicazione del DNA La replicazione del DNA comporta la replicazione dell intero corredo cellulare nell ambito di un solo ciclo, sia nel caso che la cellula possieda un solo cromosoma (procario6) che in quello in cui possieda piu cromosomi (eucario6). La replicazione avviene per compar6 che cos6tuiscono le unita di replicazione, ciascuna denominata replicone che possiede una propria origine di replicazione.
Forcella di replicazione
I tre 6pi di replicazione
Esperimento di Meselson e Stahl (1958) 14 N isotopo di azoto più leggero di 15 N. 15 N 14 N Estrazione di DNA da cellule crescite in mezzi di crescita con i due isotopi L esperimento dimostra che la replicazione del DNA e di 6po semiconserva6vo. 14 N 14 N
DNA polimerasi Tutte le reazioni chimiche che hanno luogo nella cellula sono catalizzate da enzimi che abbassano l energia richiesta. Anche la biosintesi degli acidi nucleici e catalizzata da enzimi: le DNA Polimerasi (scoperta di Kornberg, anni 50). La DNA polimerasi non e in grado di iniziare la sintesi ex novo di catene polinucleotidiche, ma deve essere sempre trovare un frammento di catena con un OH libero in posizione 3 a cui attaccare il nucleotide successivo. Dato che i due filamenti di DNA sono antiparalleli si formano delle Y (un elica si forma dal basso verso l alto mentre l altra si forma in direzione opposta).
Replicazione del DNA: biochimica 1950 - Kornberg Come avviene la replicazione del DNA????? Realizzazione della prima sintesi di DNA in vitro e scoperta dell enzima che sintetizza il DNA: DNA polimerasi Estratto proteico di E. coli Ioni Mg++ in soluzione DNA batterico 4 deossinucleotidi marcati con 14 C Presenza di enzimi (sintesi DNA) Stampo e innesco per la sintesi di nuove molecole (replicazione semiconservativa) 4 nucleotidi con energia per la sintesi Marcatura radioattiva come etichetta
Replicazione del DNA: biochimica 1950 - Kornberg Deossinucleotidi ATP + Nucleoside = Nucleosidi + 3 gruppi fosfato Deossiribonucleosidi 5 trifosfato - dttp = deossitimidintrifosfato - datp = deossiadenosintrifosfato - dgtp = deossiguanosintrifosfato - dctp = deossicitidintrifosfato
Replicazione del DNA: biochimica 1950 - Kornberg Dopo un periodo di incubazione presenza di molecole di DNA radioattive 1) L estratto proteico conteneva l enzima catalizzatore della sintesi: DNA polimerasi 2) Il DNA originario fungeva da stampo 3) La replicazione avveniva soltanto in presenza di tutti e quattro i nucleotidi In seguito Kornberg riuscì a replicare interamente e fedelmente il DNA del batteriofago
Replicazione del DNA: biochimica Come avviene la replicazione del DNA????? Quale è il meccanismo di azione del DNA polimerasi??? DNA formato da 2 eliche avvolte - Destrorse (senso avvolgimento) - Antiparallele (direzione 5-3 e 3-5 )
Replicazione del DNA: biochimica
Replicazione del DNA: biochimica Durante la duplicazione del DNA, il doppio filamento è separato attraverso un enzima ELICASI Si origina in questo modo la cosidetta FORCELLA DI REPLICAZIONE
Replicazione del DNA: biochimica Ogni filamento di DNA serve come stampo per la sintesi di un nuovo filamento, prodotto grazie alla DNA polimerasi Durante la replicazione del DNA la direzione di sintesi è da 5' a 3
Replicazione del DNA: biochimica REAZIONE: aggiunta di un nucleoside attivato nel filamento di DNA C5
Replicazione del DNA: biochimica La DNA polimerasi è in grado di accrescere la catena polinucleotidica in formazione solamente legando un gruppo fosfato in posizione 5 di un nucleotide che viene addizionato ad un ossidrile in posizione 3 del nucleotide già facente parte della catena Direzione di crescita 5-3 Filamento stampo Direzione di crescita 5-3 DNA polimerasi Nucleotide attivato
Replicazione del DNA: biochimica DNA stampo con sintesi di un nuovo filamento in direzione 5' - 3' IL 5' trifosfato può essere aggiunto solo al 3'OH libero del deossiribosio
Replicazione del DNA: biochimica I due filamenti antiparalleli vengono replicati simultaneamente in entrambe le direzioni In un filamento (detto leader) la sintesi avviene normalmente in modo continuo, mentre nell'altro filamento (detto tardivo) avviene in modo discontinuo. Replicazione semidiscontinua del DNA
Replicazione del DNA: biochimica I due filamenti antiparalleli vengono replicati simultaneamente in entrambe le direzioni
Replicazione del DNA: biochimica Alcune proteine specifiche si associano in modo sequenziale e costituiscono il complesso di preinnesco..che determinano la denaturazione (separazione dei filamenti della doppia elica) di una porzione di DNA
Replicazione del DNA: biochimica Altre particolari proteine stabilizzano i filamenti singoli (single strand banding proteins o SSB).. mentre la proteina enzimatica ELICASI procede nello srotolamento del DNA
Replicazione del DNA: biochimica La DNA polimerasi non è in grado di iniziare la sintesi ex novo di catene polinucleotidiche, ma deve sempre trovare un frammento di catena con un OH libero in posizione 3 a cui attaccare il nucleoside successivo.. quindi, ha bisogno di un innesco per dare inizio alla sintesi
Replicazione del DNA: biochimica In stretta associazione con l elicasi agisce una seconda proteina enzimatica, la Primasi o RNA polimerasi capace di sintetizzare un corto filamento di RNA d innesco o Primer (circa 10 basi) che presenta un -OH libero in posizione 3 La Primasi è un enzima che, al contrario della DNA polimerasi, può iniziare la sintesi di RNA ex novo senza bisogno di innesco direttamente sullo stampo di DNA a filamento singolo Un RNA iniziatore (Primer) viene usato per iniziare un nuovo filamento
Replicazione del DNA: biochimica La presenza di un OH libero in posizione 3 nell RNA Primer rende possibile l entrata in funzione della DNA polimerasi (o replicasi) La formazione dell innesco si verifica una sola volta per la sintesi continua del filamento leader (5 3 ) mentre si verifica molteplici volte nel caso della sintesi discontinua del filamento tardivo
Replicazione del DNA: biochimica Il filamento parentale all'estremità 5' dello stampo produce il filamento ritardato sotto forma di corti tratti di DNA (100-200 nucleotidi negli eucarioti e più lunghi nei procarioti) I frammenti del filamento ritardato sono chiamati frammenti di Okazakis dal nome dello scopritore, Reiji Okazaki.
Replicazione del DNA: biochimica La DNA polimerasi operante nel filamento tardivo si muove insieme all elicasi e primasi sintetizzando in successione i frammenti di Okazaki La sintesi si blocca quando l DNA polimerasi incontra un altro RNA primer lungo il filamento La DNA ligasi provvede infine a saldare i frammenti tra loro fino alla costituzione dell intero filamento tardivo
Replicazione del DNA: biochimica La Primasi o RNA polimerasi sintetizza un corto filamento di RNA d innesco o Primer La presenza dell RNA Primer rende possibile l entrata in funzione della DNA polimerasi (o replicasi) La sintesi si blocca quando l DNA polimerasi incontra un altro RNA primer lungo il filamento Una volta sintetizzati i frammenti di Okazaki vengono privati dell RNA primer e sostituiti con DNA tramite la DNA polimerasi I (enzima di Kornberg) La DNA ligasi provvede infine a saldare i frammenti tra loro fino alla costituzione dell intero filamento tardivo
Forma proposta Forma osservata Filamento «Guida» Filamento «Tardivo»
La fase di allungamento del filamento guida e continua mentre quella dell altro tardivo e discontinua e implica la sintesi di corte catene nucleotidiche e la loro successiva unione mediante legami covalenti.
Direzione 5-3 Direzione 3-5
Determina il grado di avvolgimento del DNA Rompe i legami tra le basi complementari Si legano al filamento singolo e ne impediscono l appaiamento. Sintetizzano brevi molecole di RNA (11+/- 1 nucleotidi) Enzima principale della replicazione Ripara gli errori di replicazione Lega le porzioni sintetizzate a tratti
Replicazione dei Cromosomi Lineari negli Eucario6 Tipi di DNA Polimerasi eucario6che Immagine al microscopio elettronico di una molecola di DNA che mostra origini di replicazioni
Le Telomerasi I telomeri sono le parti finali dei cromosomi eucariotici, sono formati da sequenze oligomeriche ripetute. La DNA polimerasi non è in grado di iniziare la sintesi ex novo delle catene poli-nucleotidiche Innesco dellatelomerasi Le telomerasi contengono delle sequenze di RNA che fungono da primer e permettono di sintetizzare le sequenze terminali del cromosoma polimerizzano l estremita del filamento tardivo Ogni volta che una cellula si duplica perde una sequenza di telomeri e muore. La telomerasi può scongiurare questo destino sintetizzando (duplicando) nuove sequenze telomeriche La riattivazione dell'enzima telomerasi nelle cellule somatiche potrebbe portare secondo gli studiosi ad un rallentamento del processo di invecchiamento. Attenzione ad evitare la crescita incontrollata delle cellule (cancro)!! Polimerizzazione delle sequenze ripetute Traslocazione della telomerasi Allungamento del DNA complementare
Meccanismi di Riparazione del DNA Endonucleasi: Taglia il DNA nel punto dove è presente l errore. Polimerizzazione del filamento per mezzo della DNA polimerasi e saldatura ad opera delle DNA ligasi.
Forme del DNA Forma B: destrorsa (piu comune) con un giro completo ogni 10 coppie di basi. Forma A: destrorsa ma con minore idratazione rispetto alla B e che ha un giro completo ogni 10,4 coppie di basi. E tipica delle zone di appaiamento RNA-RNA. Forma Z: sinistrorsa, con andamento a zig-zag. E presente in particolari tratti cromosomici per cui piccole regioni di Z- DNA potrebbero servire come siti di riconoscimento per proteine dotate di azione regolatrice dell espressione genica.
La procedura è simile per l RNA. Estrazione, Purificazione, Elettroforesi Il DNA e una molecola dotata di grande stabilita chimica ed e quindi possibile estrarre DNA separandolo dalle altre molecole organiche a partire da ogni tipo di tessuto Es. Il DNA e stato estratto da frammenti di ossa di un uomo di Neanderthal risalenti a 30000 anni fa. -Disgregazione delle cellule (detergente, sale, EDTA lisi cellulare) -Denaturazione delle proteine mediante fenolo e separazione del DNA dalle proteine per centrifugazione -Precipitazione con alcool (etanolo o isopropanolo) -Centrifugazione e solubilizzazione in acqua DNAse-free.
Fusione o Denaturazione La rigidita della molecola di DNA fa si che quando manipolate, vadano incontro a forti tensioni che possono causare la frammentazione del polimero. La stabilita della doppia elica e assicurata dal grande numero di legami deboli che legano le due catene (ponti idrogeno). La struttura a doppia elica puo essere distrutta da agenti chimici o fisici che rompono i legami deboli (urea ad alta concentrazione, ph estremi, solventi organici, calore). Denaturazione: processo che determina la rottura dei legami idrogeno specifici tra basi con conseguente separazione dei due filamenti.
Il modo piu semplice per denaturare il DNA e quello di aumentare la temperatura. Il DNA denaturato ha un assorbimento a 260 nm maggiore.
Estrazione di DNA Mortaio e pestelli Piastre di porcellana per la macinazione CAMPIONAMENTO FOGLIE Omogeneizzatori ad alta intensita Geno-Grinder ESTRAZIONI DI DNA
Estrazione di DNA (protocollo) Protocolli Sperimentali I campioni sono trattati con soluzioni di fenolocloroformio (separa acidi nucleici da proteine) Centrifugazione Precipitazione del DNA con cloruro di litio Mantenimento a 20 C per 1 ora Lavaggi del DNA con etanolo (70 %) Centrifugazione Eliminazione di Etanolo e Solubilizzazione del DNA in Acqua Dnase-free) Kit Commerciali Lisi delle cellle Legame del DNA alla colonnina Lavaggio delle colonnine con EtOH Eluizione del DNA e RNA con acqua Dnase-free
Estrazione di DNA (protocollo) Possono essere utilizzati protocolli sviluppati in laboratorio e presenti in letteratura o Kits commerciali (Qiagen, Sigma, Invitrogen etc..) Kits commerciali Vantaggi -sono piu veloci e facili da utilizzare, necessitano di minore quantita di materiale Svantaggi -Non sono adatti per tutte le specie Protocolli sperimentali Vantaggi -sono meno costosi e di solito permettono rese maggiori (DNA piu concentrato) Svantaggi -Piu laboriosi
Ele5roforesi Per studiare le enormi molecole di DNA e necessario frammentarle e isolare i frammen6 interessan6, sfru5ando il fa5o che il DNA ha carica nega6va ed u6lizzando l ele<roforesi. I frammen6 migrano dal catodo verso l anodo ed i piu piccoli lo faranno piu rapidamente di quelli grandi. Si realizza in una soluzione contenente ioni che consente il passaggio di corrente (soluzione tampone). La soluzione viene resa solida mediante una matrice gela6nosa (agarosio o poliacrilammide). Il gel viene formato in uno stampo che con6ene alla estremita un petne per formare i pozzet dove viene caricato il DNA. Il DNA viene visualizzato mediante e6dio bromuro (tossico) o molecola alterna6va che diventa fluorescente agli UV.
Elettroforesi su Gel di Agarosio http://arbl.cvmbs.colostate.edu/hbooks/genetics/biotech/gels/agardna.html Luce UV Analizzatore di Immagini
Elettroforesi su Gel di Acrilammide UV transilluminator UV light
PCR = ( Polymerase Chain Reaction ) = tecnica che permette di amplificare ripetutamente in vitro o per via enzimatica uno specifico segmento di DNA situato tra due regioni di sequenza nucleotidica nota, producendone un numero elevato di copie. Enzimi di Restrizione = Enzima (Endonucleasi) di origine batterica capace di tagliare molecole di DNA a doppia elica in corrispondenza di una specifica sequenza nucleotidica (sito di restrizione) producendone frammenti di dimensioni variabili. Ibridazione Southernblotting = Tecnica che permette di visualizzare uno o pochi frammenti di DNA genomico ottenuti mediante trattamento con enzimi di restrizione, separati mediante elettroforesi su gel di agarosio, trasferiti su membrana e visualizzati usando una sonda marcata mediante tracciante fluorimetrico.
Restrizione e Ligazione Il DNA puo essere mainipolato e studiato anche grazie ad enzimi che tagliano (nucleasi), modificano e congiungono (ligasi) in maniera specifica le molecole di acido nucleico. Nucleasi: esonucleasi (agiscono su molecole polinucleo6che con terminazioni libere) ed endonucleasi (possono tagliare anche internamente e quindi anche molecole circolari). Enzimi di restrizione: sono enzimi di origine ba5erica che tagliano il DNA a doppia leica in pun6 specifici dove riconoscono una determinata sequenza di basi, specifica per ciascun enzima, peme5endo di frammentare il DNA in maniera precisa e riproducibile. Possono essere estrat e purifica6. Servono ai ba5eri per difendersi dai virus. Il ba5erio modifica il suo DNA me6landolo, in modo che l enzima di restrizione non tagli il DNA ba5erico, ma solo quello del virus (non me6lato).
Produzione di frammen6 ad estremita coesive (s"cky ends) o appiatte (blunt ends). Enzimi di restrizione (endonucleasi)
Ibridazione Il DNA denaturato puo essere riportato allo stato na6vo (doppio filamento) operando un lento raffreddamento oppure riportando il ph alla neutralita. Riscaldando al di sopra del punto di fusione una soluzione acquosa contenente DNA appartenente a due specie differen6 e successivamente operando un lento raffreddamento si o5erranno DNA na6vi delle specie in ques6one e DNA ibrido. La formazione del DNA ibrido sara tanto maggiore quanto piu i due DNA avranno sequenze iden6che. SourthernbloDng: Introdo5a da Edward Southern (1975) - Taglio del DNA genomico con enzima di restrizione - Ele5roforesi su gel di agarosio - Trasferimento su membrana di nitrocellulosa - Si tra5a la membrana con una sonda (sequenza di DNA marcata).
Southernblotting Sonde = sequenza di DNA o RNA marcata mediante molecole radiattive o fluorescenti utilizzata in esperimenti di ibridazione per individuare una o piu sequenze complementari negli acidi nucleici di un determinato campione. Marcatori RFLP ( Random Fragment Length Polymorphisms ) = polimorfismi nella lunghezza dei frammenti di restrizione
Amplificazione del DNA mediante la reazione a catena della polimerasi (PCR) La PCR e stata inventata da Cary Mullis (Premio Nobel per la chimica, 1993). Permette di copiare un gran numero di volte (amplificare), mediante enzima DNA polimerasi, uno specifico frammento di DNA (target) in poche ore, accumulandone un numero di copie molto elevato, anche a partire da una sola copia. La reazione viene innescata da due oligonucleotidi (primers) di lunghezza tra 10 e 25 nucleotidi. Costituiti da DNA anziche RNA (utilizzati nella replicazione). Cicli ripetuti di: 1) Denaturazione, 2) appaiamento dei primers 3) estensione per opera della DNA polimerasi
PCR
Sequenziamento del DNA Significa determinare l esa5a successione delle basi azotate Metodo Sanger (anni 70) Metodo dei dideossiribonucleo6di: richiede l impiego di nucleo6di che contengono di- deossi- ribosio (mancano due atomi di ossigeno) anziche deosssiribosio (manca un atomo di ossigeno).
Figura Sequenziamento Metodo Sanger (Anni 70)
Sequenziamento dei Genomi L insieme del DNA presente in una cellula cos6tuisce il suo genoma. A par6re dagli anni 90 del secolo scorso e stato possibile determinare la sequenza completa del genoma di diverse specie: virus, ba5eri, plas6di, mitocondri, genomi di organismi superiori tra cui uomo, topo, bovino. Nelle piante la prima specie sequenziata e stata la pianta considerata come modello Arabidopsis thaliana e successivamente riso, vite, pioppo. La disponibilita di genomi sequenzia6 rende piu agevole isolare e sequenziare geni in specie il cui genoma non e sequenziato mediante poten6 socware che perme5ono di ricercare in pochi secondi sequenze simili a quella di nostro interesse. Genomica stru<urale: Determina la sequenza dei geni e l organizzazione dei genomi. Genomica funzionale: studia la funzione dei geni.
Plasmidi: DNA circolare che può attraversare la parete ed entrare nelle cellule batteriche