Capitolo III At t i v i t à e n z i m at i c h e d e i b at t e r i l at t i c i i s o l at i d a i m p a s t i acidi per la produzione del Cornetto di Matera Quarantuno ceppi di batteri lattici, isolati da impasti acidi per la produzione del Cornetto di Matera, sono testati sulla base di attività enzimatiche rilevanti nella fermentazione. Le attività ureasica, peptidasica, fitasica, fosfatasica e β-glucosidasica sono state determinate in substrati sintetici utilizzando metodi spettrofotometrici. L attività proteolitica è stata misurata in impasti acidi modello, utilizzando impasti neutri e acidificati come controllo. Tutti i ceppi hanno mostrato una bassa attività ureasica, glutamil aminopeptidasica e iminopeptidasica, mentre significative differenze sono state osservate all interno delle specie per le altre attività enzimatiche. I ceppi di Leuconostoc mesenteroides e Lactobacillus curvatus hanno dimostrato un elevata attività aminopeptidasica, X-prolil dipeptidil aminopeptidasica, β-glucosidasica, fitasica, mentre le attività enzimatiche dei ceppi di Lb. plantarum, Lb. pentosus e Weissella cibaria erano dipendenti dal ceppo. Al fine di classificare i ceppi sulla base di un profilo enzimatico simile, è stata condotta una cluster analysis gerarchica. Diversi ceppi di Lb. plantarum e Lb. curvatus e tutti i ceppi di Leuc. mesenteroides hanno mostrato un interessante profilo di attività enzimatiche, suggerendo il loro impiego come colture starter nel settore della panificazione. 3.1. Introduzione I batteri lattici svolgono un ruolo importante nella produzione di diversi alimenti fermentati. Grazie alla loro attività metabolica, in realtà, essi sono responsabili dei cambiamenti chimici e sensoriali che si verificano durante la fermentazione dei prodotti lattiero-caseari, carnei e vegetali. L adattamento a specifici ecosistemi alimentari, tuttavia, può influire sul metabolismo microbico e spiegare la prevalenza e il contributo di alcune specie durante i processi di fermentazione. Gli impasti acidi sono complessi sistemi biologici in cui si svolgono diverse attività microbiche. Il sistema proteolitico dei batteri lattici, caratterizzato dalla presenza di proteinasi, peptidasi e sistemi di trasporto intracellulare, è 55
in grado di idrolizzare le proteine in piccoli peptidi e aminoacidi, che sono importanti per la crescita microbica e come precursori per lo sviluppo di composti aromatici. Gli enzimi proteolitici dei batteri lattici degradano le proteine del glutine influenzando la reologia degli impasto e, di conseguenza, la tessitura del pane (Di Cagno et al., 2004). Inoltre, i peptidi rilasciati dall idrolisi delle prolammine che colpiscono la mucosa dell intestino umano nei soggetti affetti da morbo celiaco (Di Cagno et al., 2002) possono essere degradati durante la proteolisi. L attività delle X-prolil dipeptidil aminopeptidasi, in particolare, sembrano avere un grande potenziale nella riduzione del contenuto di peptidi di gliadina ricchi di prolina che causano la risposta immunitaria nel morbo celiaco (Gallo et al., 2005). Le proprietà sensoriali del pane possono essere migliorate attraverso l idrolisi dei polisaccaridi. Le β-glucosidasi sono uno dei principali gruppi di glicosil idrolasi in grado di catalizzare l idrolisi del legame β-1,4- presente in vari disaccaridi, oligosaccaridi e derivati β-d-glucosidici (Yan et al., 1998 ). L idrolisi dei glucosidi ha un ruolo importante in diversi processi biologici e applicazioni biotecnologiche. Le β-glucosidasi, infatti, sono responsabili dell idrolisi del cellobiosio nella fase terminale della degradazione della cellulosa, un importante fonte di fibre nei prodotti alimentari a base di cereali (Bhatia et al., 2002). La fermentazione degli impasti acidi, inoltre, aumenta il valore nutrizionale del pane. Nei cereali una gran parte del fosforo è presente come acido fitico (mio-inositolo esafosfato, IP6), collocato negli strati esterni del chicco. L acido fitico è considerato un composto anti-nutrizionale poichè è un agente chelante di proteine, aminoacidi e minerali bivalenti come Ca 2+, Fe 2+, Mg 2+ e Zn 2+, che quindi non possono essere assorbiti dall uomo (De Angelis et al., 2003 ). Pertanto, la degradazione dell acido fitico durante la fermentazione degli impasti acidi è auspicabile. Gli enzimi che degradano l acido fitico durante la fermentazione provengono dai batteri lattici e dai lieviti (Lopez et al., 2000; Reale et al., 2004). I bassi valori di ph causati dalla produzione di acido lattico durante la fermentazione, inoltre, promuovono l attivazione delle fitasi endogene della farina, che contribuiscono ad una maggiore degradazione dell acido fitico (Leenhardt et al., 2005; Lopez et al., 2001). Durante l uso come colture starter, i batteri lattici sono sottoposti a diversi stress che influenzano le loro attività metaboliche e ne riducono le 56
prestazioni. In particolare, la produzione di acido lattico e acetico durante la fermentazione promuove una forte diminuzione di ph che può incidere sull equilibrio microbico. La risposta dei batteri allo stress acido si verifica in modo diverso. Tra i meccanismi di risposta, l attività ureasica sembra svolgere un ruolo importante nella protezione di alcuni microrganismi ai bassi valori di ph attraverso la conversione di urea in ammoniaca e anidride carbonica (van de Guchte et al., 2002). Le attività proteolitica, peptidasica, β-glucosidasica, fitasica e ureasica sono state valutate per la maggior parte dei gruppi di batteri, ma pochi studi sulle attività enzimatiche dei batteri lattici isolati da impasti acidi sono presenti in letteratura. Nel presente lavoro è stato investigato il profilo enzimatico dei batteri lattici per comprendere il loro ruolo nel processo di fermentazione, nonché per delineare proprietà rilevanti nella produzione di pane. 3.2. Materiali e metodi 3.2.1. Ceppi e condizioni di coltura I batteri lattici utilizzati in questo studio sono stati isolati da impasti acidi utilizzati per produrre il pane Cornetto di Matera (Ricciardi et al., 2002). I ceppi sono stati mantenuti come colture liofilizzate nella collezione dei microrganismi del Dipartimento di Biologia, Difesa e Biotecnologie Agro- Forestali, Università degli Studi della Basilicata, Potenza, Italia. Gli isolati sono stati propagati in MRS liquido (Oxoid) per 16 ore a 30 C prima di effettuare i vari saggi enzimatici. 3.2.2. Attività proteolitica Le sospensioni cellulari standardizzate (DO 650 = 2) e cresciute overnight in MRS liquido, sono state utilizzate per inoculare (10% v/v) impasti acidi modello preparati mescolando acqua e farina di grano tenero (tipo 00, Divella SpA, Bari, Italia) con una spatola sterile per 3 minuti al fine di ottenere un impasto con rendimento (DY) pari a 400. Dopo 24 ore di incubazione a 30 C, i pre-impasti sono stati aggiunti (10% v/v) alla seconda serie impasti acidi e incubati per 24 ore a 30 C. Due fermentazioni, ottenute mediante l aggiunta di antibiotici all impasto, sono state effettuate asetticamente a ph 6,0 e 3,5, rispettivamente. La concentrazione totale di aminoacidi liberi negli estratti solubili in soluzione salina (solvente: 0,5 mol/l di NaCl e 150 57
mmol/l di fosfato di sodio, ph 6,8) è stata determinata utilizzando il metodo del TNBS (Adler-Nissen, 1979). Una curva di taratura è stata preparata utilizzando la glicina (Gly, Sigma), come standard (range 0,0-0,5 mmol/l di Gly) e risultati sono stati espressi come mg di Gly/kg di impasto. 3.2.3. Attività peptidasica Le cellule cresciute in fase stazionaria in MRS liquido sono state raccolte mediante centrifugazione (12000 x g, 5 min), lavate due volte con tampone potassio fosfato sterile 50 mmol/l, ph 7, e ri-sospese nello stesso tampone per ottenere una sospensione cellulare standardizzata (DO 650 = 1) da utilizzare per il dosaggio degli enzimi. Le attività delle aminopeptidasi generali (PepNC), prolina iminopeptidasi (Pepi), glutamil aminopeptidasi (Pepa) e X-prolil dipeptidil aminopeptidasi (PepX) sono state misurate, in accordo con Macedo et al. (2000), utilizzando come substrati sintetici Lys-p-nitroanilide (-p-na), Pro-p-NA, Glu-p-NA e Gly-Pro-p-NA o Arg- Pro-p-NA, rispettivamente. Per il dosaggio sono stati mescolati 30 μl di substrato ad una concentrazione finale di 20 mmol/l in metanolo, 195 μl di tampone potassio fosfato (50 mmol/l, ph 7,0), 95 μl di sodio azide 0,05% (w/v) e 75 μl di sospensione cellulare. Dopo l incubazione a 30 C per 4 ore, la reazione è stata interrotta con 900 μl di acido acetico al 10% (v/v); il rilascio di p-nitroanilina (p-na) nei surnatanti (12000 x g, 5 min) è stata misurata spettrofotometricamente a 410 nm. I dati ottenuti sono stati confrontati con una curva di taratura costruita utilizzando soluzioni di p-na (range 0,1-20,0 mmol/l p-na). Una unità di attività enzimatica (μkatal) è stata definita come la quantità di enzima necessario per liberare 1 μmol di p-na per secondo. 3.2.4. Screening per l attività ureasica L attività ureasica è stata determinata valutando qualitativamente il rilascio di ammoniaca utilizzando un metodo basato sul viraggio del rosso fenolo (Mora et al., 2004). I ceppi sono stati coltivati in MRS liquido contenente 5 g/l di urea (concentrazione finale) e 0,05 g/l di nichel solfato (concentrazione finale). Le cellule, raccolte mediante centrifugazione (12000 x g, 5 min), sono state lavate due volte con una soluzione salina sterile (0,85% w/v di NaCl) e ri-sospese in 100 μl di soluzione fisiologica sterile. Per il dosaggio enzimatico sono stati mescolati 100 58
μl di sospensione cellulare e 400 μl di una soluzione contenente 1 volume di reagente A (2 g di urea disciolta in 2 ml di etanolo e 4 ml di acqua deionizzata sterile) e 19 volumi di reagente B (1 g/l di KH 2 PO 4, 1 g/l di K 2 HPO 4, 5 g/l di NaCl e 20 μg/ml di rosso fenolo). La miscela di reazione è stata incubata a 37 C per 2 ore e lo sviluppo di un colore rosso-violaceo indicava la presenza di attività ureasica. 3.2.5. Attività fitasica e fosfatasica Le cellule cresciute in fase stazionaria in MRS liquido sono state raccolte mediante centrifugazione (12000 x g, 5 min), lavate due volte con soluzione salina sterile e ri-sospese in acqua deionizzata sterile per ottenere le sospensioni cellulari standardizzate (DO 650 = 1) da utilizzare per gli esperimenti. L attività fitasica è stata misurata utilizzando fitato di sodio (Sigma) come substrato. Il dosaggio è stato effettuato mescolando 600 μl di substrato (Na-fitato 3 mmol/l in Na-acetato 0,2 mol/l, ph 4,0) e 150 μl di sospensione cellulare. Dopo 2 ore di incubazione a 45 C, la reazione è stata stoppata con 750 μl di acido tricloroacetico al 5% (w/v) (De Angelis et al., 2003). Il fosforo inorganico liberato è stato determinato misurato l assorbanza a 700 nm. Una unità di attività fitasica (μkatal) è stata definita come la quantità di enzima necessario per liberare 1 μmol di fosforo inorganico al secondo. L attività della fosfatasi acida è stata determinata utilizzando il p-nitrofenil fosfato (p-npp) come substrato. La miscela di reazione conteneva 200 μl 1,5 mmol/l p-npp (concentrazione finale) in 0,2 mol/l di Na-acetato, ph 5,2, e 400 μl di sospensione cellulare. Dopo 2 ore di incubazione a 45 C, la reazione è stata stoppata con l aggiunta di 600 μl di NaOH 0,1 mol/l e il p-nitrofenolo (p-np) rilasciato è stato determinato misurando l assorbanza a 405 nm sui campioni centrifugati (12000 x g, 5 min). Una unità di attività della fosfatasi (μkatal) è stata definita come la quantità di enzima necessario per liberare 1 μmol di p-np al secondo. 3.2.6. Attività β-glucosidasica Le cellule cresciute in fase stazionaria in MRS liquido (1,5 ml) sono state raccolte mediante centrifugazione (12000 xg, 5 min), lavate due volte in Tris-HCl 50 mmol/l, ph 8, e ri-sospese in 150 μl dello stesso tampone 59
contenente 2 mg di lisozima/ml (Sigma). Delle biglie di vetro (0,15 a 0,212 mm di diametro, Sigma) sono state aggiunte e le sospensioni cellulari, dopo essere state agitate su vortex ad alta velocità per 3 min, sono state incubate a 37 C per 1 ora e sottoposte da tre cicli di sonicazione (10 min per ogni trattamento, potenza 10%; Sonorex Super 10P, Bandelin, Berlino). Dopo l incubazione, le biglie di vetro e i frammenti cellulari sono stati rimossi mediante centrifugazione (12000 x g, 5 min) e i surnatanti sono stati utilizzati per il dosaggio dell enzima. La concentrazione di proteine in lisati cellulari è stato determinato utilizzando il metodo Bradford (Bradford, 1976). L attività β-glucosidasica è stata misurata utilizzando il p-nitrofenil-β-dglucopiranoside (p-npg) come substrato, in accordo con Gallo (2004). Nella miscela di reazione sono stati mescolati 900 μl di p-npg 2,5 mmol/l (concentrazione finale) in tampone potassio fosfato 0,5 mol/l ph 7,5 e 100 μl di estratto cellulare. Dopo 1 ora di incubazione a 40 C, la reazione è stata bloccata riscaldando la miscela a 95 C per 5 min. L assorbanza è stata misurata a 410 nm. I dati ottenuti sono stati confrontati con una curva di taratura costruita utilizzando p-np. Una unità di attività β-glucosidasica (μkatal) è stata definita come la quantità di enzimia necessario per liberare 1 μmol di p-np al secondo sotto. L attività β-glucosidasica specifica è stata definita come unità enzimatica/mg di proteina. 3.2.7. Analisi statistica Tutte le analisi statistiche e i grafici sono state effettuati utilizzando Systat 10.0 per Windows (SPSS, Chicago, IL, USA). 3.3. Risultati e discussione Quarantuno ceppi di batteri lattici isolati da impasti acidi per la produzione del Cornetto di Matera, un pane tipico della Basilicata, sono stati analizzati in questo studio. L attività proteolitica in impasti acidi modello inoculati con colture di batteri lattici è stata espressa come concentrazione di aminoacidi liberi dopo 24 ore di incubazione. Due fermentazioni, ottenute aggiungendo antibiotici all impasto, sono state condotte a ph 6,0 e 3,5, rispettivamente, per valutare la proteolisi in assenza di metabolismo microbico. In generale, gli impasti acidi e l impasto di controllo acidificato a ph 3,5 hanno mostrato un aumento della concentrazione di aminoacidi liberi rispetto a quella dell impasto di controllo a ph neutro (Figura 1). 60
Figura 1. Grafico della concentrazione di aminoacidi liberi (espressa come mg Gly/kg di impasto) negli impasti acidi modello dopo 24 ore di fermentazione. Lb. curvatus ( ); gruppo Lb. plantarum ( ), che comprende le specie Lb. plantarum, Lb. paraplantarum e Lb. pentosus; Leuc. mesenteroides ( ); W. cibaria ( ); impasto di controllo acidificato ( ). Il maggiore contenuto di aminoacidi liberi è stato misurato negli impasti inoculati con alcuni ceppi di Lactobacillus curvatus o Lb. plantarum o Leuconostoc mesenteroides, anche se le differenze all interno della specie suggeriscono che l attività proteolitica è ceppo-specifica. I livelli di aminoacidi negli impasti dipendono da vari fattori come il valore di ph, il tempo di fermentazione, l attività proteolitica della microflora e/o degli enzimi della farina e dal consumo di aminoacidi da parte dei batteri lattici e/o dei lieviti. Gli impasti inoculati con Lb. plantarum DBPZ1019, Leuc. mesenteroides DBPZ1005, Lb. plantarum DBPZ1002 e Lb. plantarum DBPZ1008 (Figura 1) avevano una concentrazione di amminoacidi liberi 61
superiore a quella dell impasto di controllo acidificato (49,6-48,5-47,6-47,0 Gly mg/kg di impasto dopo 24 ore di fermentazione, rispettivamente), anche se il ph finale era superiore (4,39-4,32-4,01-4,21, rispettivamente) a quella del controllo acidificato. Le concentrazioni più basse di aminoacidi sono state osservate negli gli impasti inoculati con diversi ceppi di Lb. plantarum e uno con Lb. curvatus (parte inferiore del grafico). Nessun ceppo ha mostrato attività ureasica. Lo sviluppo del colore rossoviolaceo è stato rilevato solo in due ceppi di Leuc. mesenteroides dopo 2 giorni di incubazione, dimostrando che l attività enzimatica era molto bassa nelle specie di batteri lattici testate. I risultati relativi alle altre attività enzimatiche sono mostrati in Figura 2. L attività delle peptidasi sono state misurate sulle sospensioni cellulari in quanto il processo di fermentazione per la produzione di pane italiano si verifica in poche ore (5-10 ore) ed in questo periodo i ceppi sono attivi sulle proteine del glutine senza lisi cellulare. In generale, le attività delle glutamil aminopeptidasi (Pepa) e delle iminopeptidasi (Pepi) erano molto basse o assenti in tutti i ceppi. Ad eccezione di W. cibaria, le specie non presentano differenze significative rispetto all attività delle aminopeptidasi generali (PepNC). Il più alto livello di enzima PepNC è stato trovato nel ceppo Lb. pentosus DBPZ0984 e in tutti i ceppi di Lb. curvatus. I ceppi di Lb. plantarum e Lb. paraplantarum hanno mostrato un attività di PepNC inferiore a quella dei ceppi di Leuc. mesenteroides. Una notevole variabilità intraspecifica nell attività di PepX, su substrato Gly-Pro-p-NA (PepXgly), è stata osservata tra i ceppi di Lb. curvatus, del gruppo Lb. plantarum, mentre gli isolati di Leuc. mesenteroides e W. cibaria hanno mostrato livelli di attività enzimatica simili. Il valore più elevato è stato misurato per il ceppo Lb. pentosus DBPZ0984. L attività di PepX, su substrato sul Arg-Pro-p-NA (PepXarg), era inferiore a quella corrispondente di PepXgly in tutte le specie, ad eccezione dei ceppi Lb. plantarum DBPZ1021, Lb. paraplantarum DBPZ1027 e Lb. curvatus DBPZ1009 e DBPZ1020. Le attività fitasica e fosfatasica sono state determinate sulle sospensioni cellulari perché questi enzimi sono sia intracellulari che associati alla parete cellulare. E stato dimostrato che la maggior parte dei ceppi era in grado di degradare il fitato, anche se i livelli di attività enzimatica erano ceppo-specifici. Sono state riscontrate differenze all interno della specie Lb. curvatus e del gruppo Lb. plantarum per quanto riguarda 62
Figura 2. Grafico della distribuzione delle attività enzimatiche (attività proteolitica, glutamil aminopeptidasica, prolina iminopeptidasica, X-prolil dipeptidil aminopeptidasica su Gly-pro-pNA e Arg-pro-pNA, β-glucosidasica, fitasica, fosfatasica) dei ceppi di batteri lattici isolati dagli impasti acidi per la produzione del Cornetto di Matera. Lb. curvatus (Lbcu); Lb. paraplantarum, Lb. pentosus, Lb. plantarum (Lbplgroup); Leuc. mesenteroides (Leme); W. cibaria (Wecb). l attività fitasica e all interno della specie Leuc. mesenteroides e del gruppo Lb. plantarum rispetto all attività della fosfatasi. I livelli più alti di degradazione del fitato (0,488 μkatal/ml) sono stati misurati nei ceppi di Leuc. mesenteroides e in alcuni ceppi appartenenti al gruppo Lb. plantarum. Gli isolati di Lb. curvatus e W. cibaria hanno mostrato valori di attività enzimatica da 0,042 a 0,263 μkatal/ml, mentre un elevato numero di Lb. plantarum presentavano bassi valori di attività fitasica. Le 63
diverse specie, al contrario, hanno mostrato livelli di attività fosfatasica simili. La massima produzione di enzima è stata misurata nei ceppi Lb. plantarum DBPZ1019 e DBPZ1003, Lb. paraplantarum DBPZ1027 e nei due ceppi di W. cibaria, mentre i più bassi valori di idrolisi di p-npp sono stati osservati per alcuni ceppi di Leuc. mesenteroides e per alcuni ceppi di del gruppo Lb. plantarum. L attività β-glucosidasica è stata misurata sugli estratti cellulari dei batteri lattici. Le maggiori differenze nella produzione di quest enzima sono state trovate nei ceppi del gruppo Lb. plantarum e della specie Leuc. mesenteroides. Gli isolati di Lb. curvatus hanno mostrato una moderata produzione di β-glucosidasi, mentre quelli di W. cibaria, insieme con alcuni ceppi di Lb. plantarum, avevano la più bassa attività enzimatica. Al fine di classificare i ceppi sulla base di un profilo enzimatico simile è stata condotta una cluster analysis gerarchica (UPGMA) sulle attività enzimatiche. La classificazione ha generato sette gruppi principali a una distanza di 0,3 (Figura 3). Solo due ceppi (posizione 1 bis e 2 bis) non erano raggruppati in nessun cluster, poiché avevano un profilo enzimatico diverso da quello degli altri ceppi. Le repliche dello stesso ceppo (Lb. plantarum DBPZ1023) erano raggruppate ad una distanza massima di 0,022, dimostrando che l analisi era ripetibile. I più alti livelli di attività enzimatiche sono stati individuati tra i ceppi appartenenti ai cluster C1 e C4. I tre ceppi di Lb. plantarum, raggruppati nel cluster C1, erano caratterizzati da un elevato livello di PepA e PepI, ma da bassi livelli di PepNC e PepXarg. Il cluster C2 raggruppava un ceppo di Lb. plantarum e uno di Leuc. mesenteroides caratterizzati da una forte attività proteolitica e da elevati livelli di PepI e fitasi. Il cluster maggiore C3 comprendeva la maggior parte degli isolati di Leuc. mesenteroides e diversi ceppi di Lb. plantarum con un elevata attività di PepI, β-glucosidasica e fitasica. Il cluster C4 comprendeva quattro ceppi di Lb. curvatus con un profilo simile a quello dei ceppi del cluster C3, ad eccezione della maggiore attività di PepNC. I cluster C5, C6 e C7, nella parte inferiore del dendrogramma, includevano i ceppi con le più basse attività enzimatiche. Il cluster C6 raggruppava tre ceppi di Lb. plantarum con un elevata attività proteolitica, insieme ad una buona attività β-glucosidasica e fosfatasica. I cluster C5 e C7, al contrario, includevano ceppi con una bassa attività proteolitica, ma elevati valori di β-glucosidasi e fosfatasi, rispettivamente. 64
Figura 3. Dendrogramma mostrante la classificazione dei ceppi di batteri lattici sulla base del profilo enzimatico; le barre rappresentano la mediana delle attività all interno del cluster. Attività proteolitica a 24 ore espresso come mg Gly/kg di impasto (barra 1); glutamil aminopeptidasi (barra 2); prolina iminopeptidasi (barra 3); aminopeptidasi generale (barra 4); X-prolil dipeptidil aminopeptidasi su Gly-pro-pNA (barra 5); X-prolil dipeptidil aminopeptidasi su Arg-pro-pNA (barra 6); β-glucosidasi (barra 7); fitasi (barra 8); fosfatasi (barra 9). I batteri lattici, insieme ai lieviti, sono i microrganismi dominanti negli impasti acidi (Gobbetti et al., 2005) e la reologia, il sapore e le proprietà nutrizionali dei prodotti da forno sono strettamente legati alle attività di questo gruppo di batteri. Tuttavia, l esatto ruolo svolto dai batteri lattici durante la fermentazione non è ancora pienamente compreso. Lo studio delle attività enzimatiche, pertanto, potrebbe essere utile per la selezione di ceppi da impiegare come starter nel settore della panificazione. 65
Durante la fermentazione degli impasti acidi, gli eventi proteolitici sono da attribuire all attività dei batteri lattici e/o lieviti o a quella degli enzimi indigeni della farina, e di conseguenza, diverse teorie sulle fonti della proteolisi sono state proposte in letteratura. In questo studio, le differenze tra il contenuto di aminoacidi nell impasto di controllo a ph neutro (Gly 20,6 mg/kg di impasto) e in quello a ph acidificato (Gly 45,7 mg/kg di impasto) suggeriscono che i principali effetti dell idrolisi delle proteine sono imputabili alle condizioni di ph e all attività proteolitica degli enzimi della farina. Tuttavia, i risultati hanno dimostrato che il ph non è l unico fattore che determina il livello di aminoacidi liberi. Diversi ceppi di batteri lattici possono svolgere un ruolo importante nella degradazione delle proteine della farina, in accordo con diversi autori (Di Cagno et al., 2002; Wehrle et al., 1999). Al contrario, Thiele et al. (2002) hanno dimostrato che il rilascio di aminoacidi negli impasti inoculati con ceppi di Lb. pontis e Lb. sanfranciscensis era inferiore a quello misurato nell impasto di controllo acidificato, indicando che l attività proteolitica dei batteri lattici era trascurabile rispetto all attività proteolitica degli enzimi della farina. Inoltre, in un secondo lavoro, Thiele et al. (2004) hanno confermato che la proteolisi e le conseguenze reologiche della degradazione del glutine sono legate principalmente all attivazione degli enzimi della farina dovuta ai bassi valori di ph. Il sistema proteolitico dei batteri lattici è stato descritto in dettaglio per diversi ceppi di origine lattiero-casearia, ma in letteratura sono presenti pochi dati sul sistema dei ceppi provenienti da impasti acidi. Gobbetti et al. (1996a) hanno dimostrato che i lattobacilli hanno attività aminopeptidasica, prolina iminopeptidasica, carbossipeptidasica, endopeptidasica, dipeptidasica e tripeptidasica. In uno studio successivo, Gobbetti et al. (1996b) hanno purificato e caratterizzato il sistema proteolitico di Lb. sanfranciscensis CB1, dimostrando che consisteva principalmente in una serina proteasi, una dipeptidasi e una aminopeptidasi generale. Il sistema proteolitico di Lb. reuteri CRL 1098, invece, era costituito da una aminopeptidasi, X-prolil dipeptidil aminopeptidasi, dipeptidasi e tripeptidasi (Rollán e Font de Valdez, 2001). L attività della prolina iminopeptidasi, trascurabile nei ceppi di batteri lattici testati in questo studio, è auspicabile nella fermentazione degli impasti. Questo enzima è stato purificato e caratterizzato in molti ceppi di batteri lattici isolati da prodotti lattiero- 66
caseari ed è importante per la crescita dei microrganismi e la maturazione per i formaggi (Magboul and McSweeney, 2000; Tsakalidou et al., 1998; Bockelmann et al., 1991). Gallo et al. (2005) hanno dimostrato la presenza di PepX in dodici isolati di Lb. sanfranciscensis, giungendo alla conclusione che questo enzima è ampiamente diffuso all interno di questa specie. Recenti studi (Di Cagno et al., 2004) hanno dimostrato che la degradazione dei peptidi di gliadina ricchi di prolina può influenzare la tolleranza dell uomo alle proteine del glutine. Le proline, infatti, impongono restrizioni sulla organizzazione strutturale delle proteine tali da limitare l idrolisi da parte degli enzimi digestivi (Gallo et al., 2005) e questo suggerisce un potenziale uso dei batteri lattici per la degradazione dei peptidi tossici che inducono la risposta immunitaria delle cellule T intestinali nei pazienti affetti da morbo celiaco. L aggiunta di impasti acidi nella produzione di pane può influenzare la salute umana in vari modi. Durante la fermentazione la degradazione dell acido fitico migliora la bio-disponibilità di minerali e può avere effetti benefici sulla salute, come la riduzione del rischio di malattie cardiache, renali e alcuni tipi di tumori (Konietzny, 2004 ). Le fitasi sono enzimi distribuiti in vari batteri, ma che non sembrano essere comuni tra i batteri lattici (Palacios et al., 2005; Konietzny, 2004). Tuttavia, poiché i batteri lattici sono utilizzati negli alimenti fermentati anche di origine vegetale essi potrebbero essere una fonte di fitasi. Infatti, le specie utilizzate nella produzione prodotti lattiero-caseari, come Lb. acidophilus, Lb. casei, Lb. delbrueckii, Lactococcus lactis e Streptococcus spp. sono poveri produttore di fitasi, mentre i ceppi provenienti da alimenti di origine vegetale sono ottimi produttori di questi enzimi (De Angelis et al., 2003). Il nostro studio ha dimostrato che alcuni ceppi sono in grado di degradare l acido fitico, in particolare quelli appartenenti alle specie Leuconostoc mesenteroides, Lb. plantarum e Lb. paraplantarum. Palacios et al. (2005) hanno studiato l attività fitasica e fosfatasica in alcuni lattobacilli isolati da impasti acidi dimostrando la presenza degli enzimi in questi ceppi. Leenhardt et al. (2005) hanno dimostrato che la fermentazione effettuata con ceppi di Lb. brevis è più efficiente rispetto a quella effettuata con lievito nella riduzione dell acido fitico. In aggiunta, uno studio di Reale et al. (2004) ha evidenziato che durante la fermentazione di impasti inoculati con ceppi di Lb. plantarum, Lb. brevis 67
e Lb. curvatus l acido fitico era degradato in misura maggiore rispetto alla fermentazione di impasti inoculati con Saccharomyces cerevisiae. Una maggiore concentrazione di magnesio solubile in impasti inoculati con ceppi di Lb. plantrum o Leuc. mesenteroides subsp. mesenteroides e stato osservato da Lopez et al. (2001). La capacità di idrolizzare il fitato è stato oggetto di indagine anche in uno studio di De Angelis et al. (2003); Lb. sanfranciscensis CB1, in particolare, ha mostrato il più alto livello di attività enzimatica, ma una buona degradazione dell acido fitico è stata osservata anche per i ceppi Lb. fructivorans DA106, W. confusa 14A, Lc. lactis subsp. lactis 11M e Lb. alimentarius 5D. I nostri risultati hanno dimostrato che i più alti livelli di attività β-glucosidasica sono stati osservati nel ceppo di Lb. pentosus e in alcuni ceppi di Lb. plantarum, Lb. paraplantarum e Leuc. mesenteroides. Le β-glucosidasi sono state studiate in diversi gruppi di batteri, compresi i batteri lattici. La presenza di glicosidasi è stata osservata in Carnobacterium piscicola, una specie generalmente isolata da carne o pesce (Coombs e Branchley, 2001). Inoltre, Spano et al. (2005) hanno caratterizzato un gene che codifica per una β-glucosidasi da un ceppo commerciale di Lb. plantarum e da un ceppo di Oenococcus oeni, per dimostrare la capacità dei batteri lattici isolati dal vino a idrolizzare glicoconiugati durante la fermentazione malolattica. Diversi autori hanno scoperto che alcuni ceppi di Lb. plantarum, Lb. brevis, Lb. salivarius, Lb. fermentum e Leuc. mesenteroides sono stati in grado di idrolizzare β-glucosidi, come amigdalina e linamarina, durante la fermentazione di manioca (Obilie et al., 2004; Lei et al., 1999). L idrolisi di isoflavoni da parte di alcuni batteri lattici durante la fermentazione del latte di soia è stata anche riportata in letteratura (Choi et al., 2002). Tuttavia, sono rari gli studi sulla attività enzimatica dei batteri lattici isolati da impasti. Solo Gallo (2004) ha purificato e caratterizzato uno β-glucosidasi intracellulare da Lb. sanfranciscensis CB1. L attività ureasica è stata ampiamente studiata in batteri lattici isolati da bevande fermentate, vino, prodotti lattiero-caseari (Mora et al., 2004; Pernoud et al., 2004; Kodama e Yotsuzuka, 1996), tratto gastrointestinale (Sebbane et al., 2002, Toledo et al., 2002) e cavità orale (Sisson et al., 1999; Clancy e Burne, 1997), ma nessuno lavoro sulla presenza dell enzima nei batteri lattici isolati da impasti LAB è stato riportato 68
in letteratura. In questo lavoro, nessuno dei ceppi ha mostrato attività ureasica. Tuttavia, è stato utilizzato un metodo rapido qualitativo e l implicazione dell enzima nella resistenza allo stress acido deve essere confermata. In questo lavoro sono state esaminate alcune proprietà enzimatiche dei batteri lattici per selezionare ceppi da utilizzare come colture starter nella produzione di pane. In generale, i ceppi di Lb. plantarum, Lb. curvatus e Leuc. mesenteroides hanno mostrato una interessante profilo enzimatico, che potrebbe rappresentare un criterio importante per la preparazione di una coltura starter mista. Alcuni ceppi di Lb. plantarum e Lb. curvatus potrebbero essere selezionati per la loro attività proteolitica e peptidasica, al fine di ottimizzare il sapore e la consistenza del pane; gli elevati livelli di attività β-glucosidasica e fitasica riscontrati in ceppi di Leuc. mesenteroides, invece, potrebbero costituire un utile caratteristica per migliorare il valore nutrizionale del prodotto. BIBLIOGRAFIA Adler-Nissen, J., 1979. Determination of degree of hydrolysis of food proteins hydrolysates by trinitrobenzensulfonic acid. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 27, 1256-1262. Bhatia, Y., Mishra, S., Binaria, V.S., 2002. Microbial β-glucosidases: cloning, properties and applications. Critical Reviews in Biotechnology, 22, 375-407. Bockelmann, W., Fobker, M., Teuber, M., 1991. Purification and characterization of an X-prolyl dipeptidyl aminopeptidase from Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus and Lactobacillus acidophilus. International of Dairy Journal, 1, 51-66. Bradford, M.M., 1976. A rapid and sensitive method for the quantification of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry, 72, 248-254. Choi, Y., Kim, K., Rhee, J., 2002. Hydrolysis of isoflavone glucosides by lactic acid bacteria. Biotechnology Letters, 24, 2113-2116. Clancy, A., Burne, R.A., 1997. Construction and characterization of a recombinant ureolytic Streptococcus mutans and its use to demonstrate the relationship of urease activity to ph modulating capacity. FEMS Microbiology Letters, 151, 205-211. Coombs, J., Brenchley, J.E., 2001. Characterization of two new glycosyl hydrolases from lactic acid bacterium Carnobacterium piscicola strain BA. Applied and Environmental Microbiology, 67, 5094-5099. De Angelis, M., Gallo, G., Corbo, M.R., McSweeney P.L.H., Faccia, M., Giovine, M., Gobbetti, M., 2003. Phytase activity in sourdough lactic acid bacteria: purification and 69
characterization of a phytase from Lactobacillus sanfranciscensis CB1. International Journal of Food Microbiology, 87, 259-270. Di Cagno, R., De Angelis, M., Auricchio, S., Greco, L., Clarke, C., De Vincenzi, M., Giovannini, C., D Archivio, M., Landolfo, F., Parrilli, G., Minervini, F., Arendt, E., Gobbetti, M., 2004. Sourdough bread made from wheat and non toxic flours and started with select lactobacilli is tolerated in celiac sprue patients. Applied and Environmental Microbiology, 70, 1088-1096. Di Cagno, R., De Angelis, M., Lavermicocca, P., De Vincenzi, M., Giovannini, C., Faccia, M., Gobbetti, M., 2002. Proteolysis by sourdough lactic acid bacteria: effects on wheat flour protein fractions and gliadin peptides involved in human cereal intolerance. Applied and Environmental Microbiology, 68, 623-633. Gallo, G., De Angelis M., McSweeney P.L.H., Corbo, M.R., Gobbetti, M., 2005. Partial purification and characterization of an X-prolyl dipeptidyl aminopeptidase from Lactobacillus sanfranciscensis CB1. Food Chemistry, 91, 535-544. Gallo, G., 2004. Purification and characterization of an intracellular family 3 β-glucosidase from Lactobacillus sanfranciscensis CB1. In Ph.D. thesis, Biotechnology of lactic acid bacteria: genetic engineering and enzymology, pp. 167-196. Gobbetti, M., De Angelis, M., Corsetti, A., Di Cagno, R., 2005. Biochemistry and physiology of sourdough lactic acid bacteria. Trends in Foods Science and Technology, 16, 57-69. Gobbetti, M. Smacchi, E., Fox, P., Stepaniak, L., Corsetti, A., 1996a. The sourdough microflora. Cellular localization and characterization of proteolytic enzymes in lactic acid bacteria. Lebensmittel -Wissenschaft und-technologie, 29, 561-569. Gobbetti, M., Smacchi, E., Corsetti. A., 1996b. The proteolytic system of Lactobacillus sanfranciscensis CB1: purification and characterization of a proteinase, a dipeptidase, and an aminopeptidase. Applied and Environmental Microbiology, 62, 3220-3226. Kodama, S., Yotsuzuka, F., 1996. Acid urease: Reduction of ethyl carbamate formation in sherry under simulated baking conditions. Journal of Food Science, 61, 304-307. Konietzny, U., Greiner, R., 2004. Bacterial phytase: potential application, in vivo function and regulation of its synthesis. Brazilian Journal of Microbiology, 35, 11-18. Leenhardt, F., Levrat-Verny, M., Chanliaud, E., Rémésy, C., 2005. Moderate decrease of ph by sourdough fermentation is sufficient to reduce phytate content of whole wheat flour through endogenous phytase activity. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 53, 98-102. Lei, V., Amoa-Awua, W.K.A., Brimer, L., 1999. Degradation of cyanogenic glycosides by Lactobacillus plantarum strains from spontaneous cassava fermentation and other microorganisms. International Journal of Food Microbiology, 53, 169-184. Lopez, H.W., Krespine, V., Guy, C., Messager, A., Demigne, C., Rémésy, C., 2001. Prolonged fermentation of whole wheat sourdough reduce phytate level and increase soluble magnesium. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 49, 2657-2662. 70
Lopez, H.W., Ouvry, A., Bervas, E., Guy, C., Messager, A., Demigne, C., Rémésy, C., 2000. Strains of lactic acid bacteria isolated from sour dough degrade phytic acid and improve calcium and magnesium solubility from whole wheat flour. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 48, 2281-2285. Macedo, A.C., Viera, M., Poças, R., Malcata F.X., 2000. Peptide hydrolase system of lactic acid bacteria isolated from Serra da Estrela cheese. International Dairy Journal, 10, 769-774. Magboul, A.A.A., McSweeney P.L.H., 2000. Purification and characterization of an X-prolyl dipeptidyl aminopeptidase from Lactobacillus curvatus DPC2024. Lait 80, 385-396. Mora, D., Maguin, E., Masiero, M., Parini, C., Ricci, G., Manichini, P.L., Daffonchio, D., 2004. Characterization of urease genes cluster of Streptococcus thermophilus. Journal of Applied Microbiology, 96, 209-219. Obilie, E.M, Tano-Debrah, K., Amoa-Awua, W.K. 2004. Souring and breakdown of cyanogenic glucosides during the processing of cassava into akyeke. International Journal of Food Microbiology, 93, 115-121. Palocios, M.C., Haros, M., Rosell, C.M., Sanz, Y., 2005. Characterization of an acid phosphatase from Lactobacillus pentosus: regulation and biochemical properties. Journal of Applied Microbiology, 98, 229-237. Pernoud, S., Fremaux, C., Sepulchre, A., Corrieu, G., Monnet, C., 2004. Effect on the metabolism of urea on the acidifying activity of Streptococcus thermophilus. Journal of Dairy Science, 87, 550-555. Reale, A., Mannina, L., Tremonte, P., Sobolev, A.P., Succi, M., Sorrentino, E., Coppola, R., 2004. Phytate degradation by lactic acid bacteria and yeasts during the wholemeal dough fermentation: a 31 P NMR study. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 52, 6300-6305. Ricciardi, A., Paraggio, M., Salzano, G., Andreotti, G., De Fina, M., Romano, P., 2002. La microflora degli impasti utilizzati per la produzione del Cornetto di Matera e del Pane di Altamura. Tecnica Molitoria, 780-787. Rollán, G., Font de Valdez, G., 2001. The peptide hydrolase system of Lactobacillus reuteri. International Journal of Food Microbiology, 70, 303-307. Sebbane, F., Mandrant-Berthelot, M., Simonet, M., 2002. Gene encoding specific nickel transport system flank the chromosomal urease locus of pathogenic Yersinie. Journal of Bacteriology, 184, 5706-5713. Sisson, C.H., Perinpanayagan, H.E.R, Hancock, E.M., Cutress, T.W., 1999. ph regulation of urease levels in Streptococcus salivarious. Journal of Dental Research, 69, 1131-1137. Spano, G., Rinaldi, A., Ugliano, M., Moio, L., Benedice, L., Massa, S., 2005. A β-glucosidase gene isolated from wine Lactobacillus plantarum is regulated by abiotic stresses. Journal of Applied Microbiology, 98, 855-861. Thiele, C., Grassl, S., Gänzle, M., 2004. Gluten hydrolysis and depolymerization during 71
sourdough fermentation. Journal and Agricultural and Food Chemistry, 52, 1307-1314. Thiele, C., Gänzle, M., Vogel, R.F, 2002. Contribution of sourdough lactobacilli, yeast, and cereal enzymes to the generation of amino acids in dough relevant for bread flavour. Cereal Chemistry, 79, 45-51. Toledo, H., Velenzuela, M., Rivas, A., Jerez, C.A. 2002. Acid stress response in Helicobacter pylori. FEMS Microbiology Letters, 213, 67-72. Tsakalidou, E., Anastasiou, R., Papadimitriou, K., Manolopoulou, E., Kalantzopoulos, G. 1998. Purification and characterization of an intracellular X-prolyl-dipeptidyl aminopeptidase from Streptococcus thermophilus ACA-DC 4. Journal of Biotechnology, 159, 203-211. Van de Guchte, M., Serror, P., Chervaux, C., Smokvina, T., Ehrlich, S.D., Maguin, E. 2002. Stress responses in lactic acid bacteria. Antonie van Leeuwenhoek, 82, 187-216. Yan, T., Lin, Y., Lin, C., 2004. Purification and characterization of an extracellular β-glucosidase II with high hydrolysis and transglucosylation activities from Aspergillus niger. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 46, 431-437. Wehrle, K., Crowe, N., van Boeijen, I., Arendt, E.A., 1999. Screening methods for the proteolytic breakdown of gluten by lactic acid bacteria and enzymes preparations. European Food Research and Technology, 209, 428-433. 72