UNIVERSITA' DEGLI STUDI DI CATANIA

UNIVERSITA' DEGLI STUDI DI CATANIA FACOLTA' DI SCIENZE MATEMATICHE, FISICHE E NATU- RALI CORSO DI LAUREA IN SCIENZE BIOLOGICHE DIPARTIMENTO DI BIOLOGIA ANIMALE "M. La Greca" ROSA VERNUCCIO STUDIO E APPLICAZIONE DI TECNI- CHE DI PROCREAZIONE MEDICAL- MENTE ASSISTITA DI I LIVELLO T e s i d i l a u r e a i n B i o l o g i a d e l l o S v i l u p p o Relatrice: CHIAR.MA PROF.SSA RENATA VISCUSO Correlatore: DOTT. GIOVANNI BRACCHITTA ANNO ACCADEMICO 2007-08

I N D I C E PREMESSA...1 INTRODUZIONE...3 APPARATO GENITALE FEMMINILE...3 APPARATO GENITALE MASCHILE...5 GAMETOGENESI...8 OVOGENESI...10 SPERMATOGENESI...13 MATURAZIONE EPIDIDIMARIA E CAPACITAZIONE...17 CONTROLLO NEUROENDOCRINO DELLA GAMETOGENESI...18 CONTROLLO NEUROENDOCRINO NELLA FEMMINA...19 CONTROLLO NEUROENDOCRINO NEL MASCHIO...21 DEFINIZIONE DI INFERTILITÀ E STERILITÀ...22 EPIDEMIOLOGIA APPLICATA ALL INFERTILITÀ...23 INFERTILITÀ FEMMINILE...28 INFERTILITÀ MASCHILE...34 TECNICHE DI PROCREAZIONE MEDICALMENTE ASSISTITA (PMA)...38 SCOPO DEL LAVORO...43

MATERIALI E METODI...44 SPERMIOCITOGRAMMA...44 TECNICHE DI SELEZIONE NEMASPERMICA...52 INSEMINAZIONE INTRAUTERINA (IUI)...55 RISULTATI...58 DISCUSSIONE...62 CONCLUSIONI...67 ALLEGATO LEGGE 19 FEBBRAIO 2004, N. 40...69 BIBLIOGRAFIA...79

PREMESSA Nel XX secolo abbiamo assistito, nei paesi industrializzati, ad una transizione demografica ed epidemiologica, che sono state favorite dalla rivoluzione sanitaria, avvenuta nel 1940 circa, e caratterizzata dall esplosione dell uso di pratiche vaccinali, di antibiotici e di un numero crescente di presidi farmacologici. Il forte incremento demografico, che si registra nel mondo in maniera più o meno rilevante a partire dal secolo scorso, è accompagnato dal progressivo invecchiamento della popolazione, dovuto alla riduzione dei tassi di mortalità e fecondità. Oggi la capacità riproduttiva della coppia è compromessa sempre più dall influenza combinata di molti fattori endogeni ed esogeni; stiamo assistendo ad una recrudescenza di forme patologiche dell apparato riproduttivo femminile e maschile, a causa di numerosi fattori ambientali e delle mutate abitudini sessuali. Inoltre, la ritardata età in cui le coppie giungono al matrimonio, dettata da esigenze di tipo economico-professionale, amplifica le difficoltà riproduttive, che in età più giovanile potrebbero essere facilmente superate. L infertilità maschile e femminile è una patologia ed, oltre a costituire un ovvio problema di carattere medico, comporta anche aspetti altrettanto complessi di natura psicologica e sociale. La procreazione medicalmente assistita (PMA) rappresenta un importante traguardo per la tecnologia 1

e la scienza della riproduzione; essa permette di superare alcuni ostacoli e aumenta le probabilità per alcune coppie di avere dei figli. 2

INTRODUZIONE APPARATO GENITALE FEMMINILE Nell apparato genitale femminile distinguiamo: organi genitali interni ed organi genitali esterni. Gli organi genitali interni comprendono: le ovaie, le tube, l utero e la vagina. Figura 1: apparato genitale femminile L ovaio è un organo, simmetrico e pari, rappresenta la gonade femminile ed è la sede di maturazione degli oociti. Inoltre l ovaio secerne gli ormoni sessuali femminili (estrogeni e progesterone) e una piccola quantità di ormoni androgeni. Nella donna adulta l ovaio e- sternamente è rivestito dall epitelio superficiale dell ovaio, al di sotto del quale è presente uno strato connettivale la tonaca falsa albuginea, che delimita il parenchima dell organo; quest ultimo è formato 3

da una zona midollare centrale e da una zona corticale periferica, ove sono presenti i follicoli nei vari stadi di maturazione. Le tube o trombe uterine (di Falloppio o di Salpingi) sono dei dotti pari e simmetrici, indispensabili per la captazione dell ovocita e per il suo trasporto; inoltre consentono la migrazione e la capacitazione degli spermatozoi e rappresentano la sede dell eventuale fecondazione. In connessione alle tube vi è l utero, organo cavo, impari e mediano, anatomicamente diviso in istmo, fondo, corpo e collo. L utero da tre tonache, che dall interno verso l esterno sono: 1) tonaca mucosa o endometrio; 2) tonaca muscolare o miometrio; 3) tonaca sierosa o perimetrio. L utero rappresenta l organo della gestazione nel quale si annida la blastocisti e si sviluppa il feto. La vagina è un canale muscolomembranoso impari, rappresenta l organo copulatore della femmina e dà passaggio al flusso mestruale e, durante il parto, al feto. Gli organi genitali esterni o vulva comprendono: 1) un rilievo cutaneo definito monte di venere ; 2) due spesse pliche di cute dette grandi labbra ; 3) due pieghe cutanee più sottili dette piccole labbra ; 4) un organo erettile definito clitoride ; 5) le ghiandole vestibolari maggiori o del Bartolini. 4

APPARATO GENITALE MASCHILE L apparato genitale maschile è costituito: dai testicoli, dalle vie spermatiche, dalle ghiandole a queste annesse e dai genitali esterni. Figura 2: sezione longitudinale dell apparato genitale maschile Il testicolo o didimo rappresenta la gonade maschile, ed è la sede della produzione degli spermatozoi e della secrezione degli ormoni sessuali maschili. È una ghiandola tubulare composta, pari, appiattita in senso latero-mediale, contenuta all interno di una sacca cutanea detta scroto, il quale è posto all esterno dell organismo, consentendo di mantenere i testicoli ad una temperatura di 2 C in meno rispetto a quello corporea, il che favorisce la corretta spermatogenesi. 5

Ciascun testicolo è suddiviso in 200-300 spazi di forma piramidale, denominati logge o lobuli. Ogni lobulo accoglie dei dotti convoluti, i tubuli seminiferi contorti, tra i quali sta un connettivo lasso contenente le cellule interstiziali endocrine del testicolo o cellule del Leyding, che secernono androgeni. I tubuli seminiferi sono formati da un sottile tonaca connettivale e dall epitelio germinativo, che comprende due categorie di cellule: le cellule germinali nei vari stadi di maturazione e le cellule del Sertoli; quest ultime sono cellule somatiche di forma triangolare, con la base poggiante sulla lamina basale, l apice rivolto verso il lume del tubulo e provviste di prolungamenti citoplasmatici che avvolgono gli elementi germinali fino agli stadi finali di sviluppo, ai quali danno sostegno meccanico, trofico e protezione. I tubuli seminiferi si continuano con i tubuli seminiferi retti, i quali terminano in una rete di formazioni cave denominata rete testis, le cui lacune sono in comunicazione con i condotti efferenti che formano la testa dell epididimo. L epididimo è distinto in testa, corpo e coda e presenta un lungo dotto tortuoso il canale dell epididimo ; qui gli spermatozoi completano la maturazione e soggiornano, in attesa di transitare nel dotto deferente al momento della eiaculazione. Il dotto deferente decorre dallo scroto, piegando verso l alto nella cavità addominale, fino dietro 6

la vescica dove dà origine al dotto eiaculatore, che attraversa il parenchima della prostata per sfociare poi nell uretra. L uretra trasporta il liquido seminale attraverso l asta del pene fino all esterno. Figura 3: didimo Le ghiandole annesse alle vie seminali sono: 1) le vescichette seminali: rappresentate da due sacculi posti ai lati della vescica, secernono un materiale viscoso ricco in fruttosio e prostaglandine, che stimolano le contrazioni uterine, favorendo la risalita degli spermatozoi nell apparato genitale femminile. 2) la ghiandola prostatica: secerne il liquido prostatico, che aumenta il volume del liquido seminale ed è caratterizzato da un Ph=6.5 più alcalino delle secrezioni vaginali, il che contribuisce a preser- 7

vare l integrità e la motilità degli spermatozoi nell ambiente vaginale acido. 3) le ghiandole bulbo-uretrali: secernono il liquido preeiaculatorio, che nell uretra si aggiunge al liquido seminale. Infine le strutture genitali esterne sono rappresentate dallo scroto e dal pene. Il pene è l organo copulatore del maschio, ed è costituito dai corpi cavernosi, che rappresentano le strutture erettili del pene. Nel pene si possono distinguere tre settori: radice, corpo e glande, e tutta la sua superficie è ricoperta da cute molto sensibile all altezza del glande. GAMETOGENESI La caratteristica fondamentale della riproduzione sessuale consiste nella formazione di un nuovo individuo a partire dalla fusione di cellule specializzate nella riproduzione, appartenenti alla linea germinale, definite gameti. Il gamete maschile è lo spermatozoo, il gamete femminile è la cellula uovo. I gameti sono cellule aploidi(1n), cioè presentano una copia per ogni tipo di cromosoma. Dalla fusione dello spermatozoo con la cellula uovo (processo che prende il nome di fecondazione) ha origine uno zigote diploide (2N), che rappresenta la prima cellula del nuovo organismo. 8

Lo zigote va incontro a numerose mitosi dando origine a 2 linee cellulari: cellule della linea somatica e cellule della linea germinale o protogoni (PGC); quest ultime rappresentano i precursori dei gameti. Sin dai primi stadi di sviluppo embrionale, le PGC segregano dalle cellule somatiche e si distinguono da queste in quanto hanno inglobato un particolare tipo di citoplasma, di origine ovulare, detto citoplasma germinale. Le PGC si differenziano generalmente nell endoderma, vengono individuate a livello del sacco vitellino, vicino alla connessione tra l intestino posteriore e l allantoide, ed hanno un corredo cromosomico diploide. Intorno alla IV settimana le PGC migrano verso le creste genitali; durante questo viaggio proliferano mediante ripetute mitosi, passando da una popolazione cellulare di 10-100 PGC alle 2500-3000 presenti nell abbozzo delle gonadi. Inizialmente le gonadi sono sessualmente indifferenziate, solo verso la VII settimana evolveranno in testicoli o in ovaie; questa differenziazione dipende rispettivamente dalla presenza o meno del fattore di determinazione testicolare, il cui gene mappa sul cromosoma Y. Se le gonadi evolvono in ovaie, le PGC si differenziano in ovogoni (2N); se le gonadi evolvono in testicoli, le PGC si differenziano in spermatogoni (2N). Solo quando l individuo raggiunge la maturità sessuale, sia gli ovogoni sia gli spermatogoni andranno incontro alla meiosi, formando i gameti aploidi. 9

La meiosi, infatti, è un particolare processo di divisione cellulare, che garantisce sia il dimezzamento del numero dei cromosomi sia il rimescolamento cromosomico, apportando così variabilità genetica. OVOGENESI Il processo di formazione della cellula uovo, che prende il nome di ovogenesi, si svolge lentamente e con periodi di arresto piuttosto lunghi. I precursori diploidi della cellula uovo, detti ovogoni, proliferano per mitosi nella gonade femminile solo durante il periodo embriofetale, genarando approssimativamente 7 milioni di ovogoni. La maggior parte degli ovogoni degenerano, mentre quelli restanti, circa al VII mese di sviluppo, entrano nella profase I della meiosi divenendo oociti I. Gli oociti I progrediscono attraverso la prima profase meiotica fino alla fase di diplotene, ed in questo stadio rimarranno bloccati fino alla pubertà. Durante la profase I meiotica, inoltre, gli oociti I vanno incontro ad una fase di accrescimento definita auxocitosi, durante la quale viene sintetizzato tuorlo e citoplasma attivo. Dei 2 milioni circa di oociti I presenti alla nascita, solo 400 mila maturano durante il ciclo vitale di una donna (tabella 1). 10

Tabella 1: numero di ovociti nel ciclo vitale di una donna Raggiunta la maturità sessuale, gli oociti I periodicamente a gruppi di cellule riprendono la meiosi e completano la I divisione meiotica (divisione riduzionale), generando 2 oociti II con un corredo cromosomico dimezzato cioè aploide. In queste divisioni Il fuso mitotico è spostato verso il polo animale, e le 2 cellule risultanti saranno morfologicamente differenti: un oocita II eredità tutto il citoplasma e risulta molto grande, e l altro oocita II eredita solo il bagaglio cromosomico e risulta più piccolo e viene definito polocita. L oocita II inizia la II divisione meiotica (divisione equazionale) ma rimane congelato in metafase II; il completamento della meiosi avverrà solo se l oocita II verrà fecondato. 11

Al termine della meiosi si ottengono 4 cellule: 1 cellula uovo e 3 polociti, i quali degenerano. Figura 4: ovogenesi La maturazione dell oocita avviene nella regione corticale di ciascun ovario. Al momento della nascita nella donna, ciascun oocita è circondato da uno strato di cellule appiattite, dette cellule follicolari e l insieme prende il nome di follicolo primordiale. I follicoli rimangono in uno stato di quiescenza funzionale fino all età puberale, dopo un certo numero di essi va incontro ad un processo di maturazione che giunge gradualmente fino all ovulazione. I follicoli primordiali evolvono in follicoli primari, all interno dei quali le cellule follicolari diventano cubiche e inizia la formazione della zona pellucida adesa all oolemma. Dal follicolo primario si passa al follicolo secondario: qui l oocita è circondato da più strati di cellule follicolari, dette ora cellule della granulosa. Nello spessore della granulosa si formano ampi spazi gli antri, pieni di liquor fulliculi, ricco in estrogeni. 12

Le cellule follicolari che rimangono attorno all oocita formano il cumulo ooforo, e tra queste le cellule più adese all oocita con disposizione a corona vengono definite cellule della corona radiata. Nell ultimo stadio di maturazione il follicolo, detto follicolo di Graff, si accresce, gli antri confluiscono tra di loro per formare un unica grande cavità e l oocita viene spinto alla periferia. Infine il follicolo di Graff scoppia rilasciando l oocita, avvolto dalle sue membrane (cumulo ooforo, corona radiata, zona pellucida), il quale viene raccolto dalle frange dell ovidutto dove potrà essere fecondato. Quello che rimane del follicolo scoppiato viene detto corpo luteo. Se avviene la fecondazione, il corpo luteo funge da ghiandola endocrina per il primo periodo di gestazione; in assenza di fecondazione il corpo luteo degenera in corpo albicans. SPERMATOGENESI Il processo di maturazione degli spermatozoi prende il nome di spermatogenesi. La spermatogenesi si svolge rapidamente e senza interruzione all interno dei tubuli seminiferi del testicolo, dove la maturazione degli elementi germinali maschili avviene in senso centripeto: alla periferia gli spermatogoni poggiano sulla lamina basale, procedendo verso il centro vi sono una o più generazioni di spermatociti e spermatidi e infine gli spermatozoi maturi sono rilasciati nel lume tubulare. 13

Figura 5: epitelio seminifero La spermatogenesi può essere divisa in 3 fasi: mitotica, meiotica e spermiogenesi. FASE MITOTICA Gli spermatogoni (2N) si dividono per mitosi all interno dei tubuli seminiferi del testicolo. La proliferazione degli spermatogoni è lenta durante la fase giovanile, si manifesta invece in maniera rapida e continua per tutto il periodo di attività sessuale. Gli spermatogoni durante la mitosi subiscono una citodieresi incompleta e rimangono uniti da ponti citoplasmatici; questo assicura, ad ogni ondata proliferativa, la sincronia della maturazione di tutte le cellule della popolazione destinata all eiaculazione. 14

Si possono distinguere vari tipi di spermatogoni, che rappresentano stadi successivi di maturazione: 1) spermatogoni di tipo A1 (elementi indifferenziati capaci di dividersi indefinitivamente); 2) spermatogoni di tipo intermedio A2; 3) spermatogoni di tipo B. Continuamente pool di spermatogoni, dopo un periodo di accrescimento limitato, si trasformano in spermatociti I, a livello dei quali inizia la meiosi. FASE MEIOTICA Nella linea germinale maschile la meiosi ha inizio nel periodo puberale e procede rapidamente senza interruzioni. Ciascun spermatocita I (2N) alla prima divisione meiotica da origine a 2 spermatociti II aploidi(1n), i quali vanno incontro alla seconda divisione meiotica, generando 4 spermatidi. SPERMIOGENESI Gli spermatidi sono cellule ancora molto diverse dagli spermatozoi sia morfologicamente che funzionalmente, infatti vanno incontro ad un processo di citodifferenziazione, mediante il quale si trasformeranno in spermatozoi maturi. 15

La spermiogenesi è suddivisa in 3 fasi, durante le quali si realizzano processi a carico del citoplasma e del nucleo: a) fase del golgi: in un primo momento i sacculi del golgi sono distribuiti attorno al nucleo, e assieme ai 2 centrioli formano una tipica struttura detta IDIOSOMA. Poi i sacculi golgiani si organizzano distalmente al nucleo e in essi vengono sintetizzati enzimi idrolitici, che si accumulano sottoforma di GRANULI PREACROSO- MIALI. Infine i sacculi si fondono in un unica VESCICOLA A- CROSOMIALE, che aderisce al nucleo rivestendone la porzione apicale e che contiene enzimi litici in grado di perforare gli involucri ovulari. b) fase acrosomiale: il nucleo in questa fase assume un aspetto fortemente eterocromatico, infatti la cromatina si compatta ulteriormente per la sostituzione degli istoni con proteine più basiche, le protamine. Il centriolo prossimale si addossa alla parete nucleare e mantiene la sua tipica morfologia; sembra che questo centriolo al momento della fecondazione venga utilizzato dalla cellula uovo per organizzare il fuso mitotico. Invece il centriolo distale assume il ruolo di blefaroblasto, e organizza i microtubuli dell assonema (9 coppie periferiche e 1 coppia centrale), evolvendo in flagello. c) fase iniziale e intermedia di maturazione: in queste fasi i mitocondri si spostano e si dispongono a spirale attorno al pezzo intermedio della coda. I residui dell idiosoma e tutto il citoplasma, che non 16

serve più allo spermatozoo, si raccolgono verso il polo apicale in una sacca, che si stacca dallo spermatozoo e viene fagocitata dalle cellule del Sertoli. Infine vengono meno i ponti citoplasmatici tra gli spermatozoi, che verranno liberati nel lume del tubulo seminifero. Alla fine lo spermio è una cellula nuda, sprovvista di involucri e rivestita solamente della membrana citoplasmatica; in esso si distingue una testa molto slargata, un collo e un flagello. Figura 6: spermatogenesi MATURAZIONE EPIDIDIMARIA E CAPACITAZIONE Gli spermatozoi che lasciano il testicolo sono immaturi, non sono dotati di motilità propria e sono incapaci di fecondare. Acquistano queste capacità solo dopo aver attraversato l epididimo, che secerne un liquido in cui sono contenuti enzimi, sostanze 17

nutritive e ormoni, che contribuiscono alla maturazione delle cellule seminali. Durante questo passaggio si modifica la membrana citoplasmatica dello spermatozoo mediante: l adsorbimento di nuove glicoproteine di superficie, la modificazione della carica di membrana, la glicosilazione e la modificazione dei lipidi di membrana. Gli spermatozoi, non appena eiaculati, sono incapaci di dare la reazione acrosomiale e di penetrare la cellula uovo. Affinché avvenga la fecondazione è necessario che gli spermi subiscano la capacitazione. La capacitazione si realizza nel momento in cui gli spermatozoi percorrono le vie genitali femminili. Sebbene sia un processo non ancora conosciuto in tutti i dettagli, tuttavia molto verosimilmente la capacitazione avviene grazie alla rimozione dalla membrana plasmatica degli spermatozoi di sostanze adsorbite o integrate durante il passaggio attraverso l epididimo, così il bilayer si destabilizza, per la variazione del rapporto colesterolo/fosfolipidi e lo spermatozoo aquisisce capacità fusogenetiche. CONTROLLO NEUROENDOCRINO DELLA GAMETOGENESI Sia la spermatogenesi che l ovogenesi sono regolate e controllate da fattori endocrini attraverso l interazione continua tra l asse ipotalamo- ipofisi- gonadi. 18

CONTROLLO NEUROENDOCRINO NELLA FEMMINA Nella donna la maturazione degli ovociti avviene secondo un ciclo, detto ciclo mestruale, regolato da un pool di ormoni. Il ciclo mestruale ha una durata media di 28 giorni e può essere suddiviso nelle seguenti fasi: a) fase proliferativa: l ipotalamo elabora l ormone di rilascio delle gonadotropine (GnRH), che stimola l ipofisi ad elaborare e rilasciare l ormone follicolo stimolante (FSH) e l ormone luteinizzante (LH). L FSH promuove la maturazione del follicolo e dell oocita in esso contenuti; in risposta all FSH le cellule della granulosa sintetizzano estrogeni. L aumento dei livelli ematici di estrogeni stimola la proliferazione dell endometrio e l ulteriore rilascio di FSH ed LH ipofisarie, mediante un meccanismo a feedback positivo. b) fase ovulatoria: intorno al XIV giorno del ciclo, il picco di LH induce lo scoppio del follicolo e il rilascio dell ovocita nelle tube; in questo momento la produzione di estrogeni è interrotta. c) fase secretoria o luteinica: sotto l influenza dell LH il follicolo si trasforma in un tessuto endocrino temporaneo, il corpo luteo, che secerne progesterone e in parte estrogeni. Il progesterone mantiene alto l endometrio, preparandolo ad un eventuale gravidanza. Gli estrogeni, secreti durante la fase luteinica, inibiscono il rilascio di GnRH ipotalamico e di FSH ed LH ipofisarie, mediante un meccanismo a feedback negativo. Il corpo luteo aumenta di dimensioni per 7-8 giorni, dopo se avviene la fecondazione, la secrezione di gonadotropina corionica (GC) salva il corpo luteo, che continua a 19

secernere progesterone ed estrogeni per i primi 2-3 mesi di gestazione, mantenendo spessa la parete uterina. Se la fecondazione non avviene, il corpo luteo degenera in corpo albicans, in risposta alla caduta dei livelli ematici di LH. d) fase mestruale: in seguito alla degenerazione del corpo luteo, la riduzione dei livelli ematici di estrogeni e progesterone induce sia la necrosi e lo sfaldamento dell endometrio (mestruazione), sia il rilascio nuovamente di GnRH ipotalamico e di LH ed FSH ipofisari, rinnovando il ciclo. Figura 7: ciclo mestruale 20

CONTROLLO NEUROENDOCRINO NEL MASCHIO La produzione degli spermatozoi è continua e non ciclica, ed avviene sotto il controllo di un pool di ormoni lungo l asse ipotalamoipofisi-gonadi. Il GnRH, elaborato dall ipotalamo, stimola la secrezione delle gonadotropine ipofisarie, LH ed FSH. L FSH attraverso il circolo ematico raggiunge i testicoli dove si lega ai recettori specifici presenti sulla superficie della membrana delle cellule del Sertoli, stimolando la conversione degli spermatogoni in spermatociti. L LH stimola le cellule del Leyding ad elaborare e secernere il testosterone, che diffonde nei tubuli seminiferi. Infatti la spermatogenesi, perché possa avvenire, necessita di alti livelli di testosterone all interno dei tubuli seminiferi; proprio per questo le cellule del Sertoli rilasciano la proteina legante gli androgeni (ABP), che lega il testosterone e mantiene alta la sua concentrazione nei tubuli seminiferi. Il testosterone stimola sia la proliferazione degli spermotogoni, sia l inizio della meiosi, ed è responsabile della comparsa dei caratteri sessuali secondari nel maschio. La secrezione di GnRH, FSH ed LH non è ciclica ma rimane piuttosto costante nel maschio, mediante un meccanismo a feedback operante lungo l asse ipotalamo-ipofisi-testicoli. 21

Le alte concentrazioni ematiche di testosterone agiscono sull ipotalamo e sull ipofisi, inibendo la secrezione di LH e riducendo la sua stessa sintesi; invece se la concentrazione ematica di testosterone è bassa, esso stimola un maggiore rilascio di LH, aumentando la sua sintesi. Infine, il controllo a retroazione del rilascio di FSH avviene mediante un ormone secreto dalle cellule del Sertoli, detto inibina. DEFINIZIONE DI INFERTILITÀ E STERILITÀ Nell affrontare il tema della PMA, è necessario definire cosa si intende per infertilità e per sterilità. Secondo l Organizzazione Mondiale della Sanità (O.M.S.) e l American Fertility Society (A.F.S.), per infertilità primaria si intende l incapacità di una coppia di concepire dopo 12/24 mesi di rapporti regolari non protetti (questo intervallo di tempo deve essere ridotto a 6 mesi nelle coppie più anziane, in quanto sia nella donna che nell uomo la fecondità raggiunge l apice intorno ai 24 anni e declina gradualmente dopo i 32 anni di età). Viene definita sterile una coppia nella quale uno o entrambi i coniugi sono affetti da una condizione fisica permanente che non rende possibile l evento riproduttivo. Infine viene definita affetta da infertilità secondaria una coppia, che è stata in grado precedentemente 22

di procreare un bambino e, pur essendo in età riproduttiva ed avendo rapporti sessuali non protetti da più di 12 mesi dal termine dell amenorrea puerperale, non ha avuto un ulteriore successo riproduttivo. La definizione di infertilità, proposta dall O.M.S. e dall A.F.S., trae origine da un lavoro di M.J. Whitelaw pubblicato nel 1960 che dimostrava, sulla base di uno studio condotto in una popolazione omogenea degli Stati Uniti, come circa il 56% delle coppie sane concepiva entro il 1 mese di rapporti sessuali, il 78% entro il 6 mese e ben l 86% delle coppie concepiva entro il 12 mese. Secondo le linee guida attuali, per sterilità si intende: ostacolo alla fecondazione, con assoluta mancanza della capacità riproduttiva femminile e/o maschile; e per infertilità si intende: incapacità di proseguire e portare a termine la gravidanza. Noi, come molti autori, utilizzeremo indifferentemente i termini d infertilità e sterilità come sinonimi. EPIDEMIOLOGIA APPLICATA ALL INFERTILITÀ Le stime del tasso di infertilità di una popolazione possono essere di tipo diretto o indiretto. Una stima indiretta prende in considerazione il numero complessivo di coppie in età feconda che non hanno avuto figli; tale tipo di indagine può avere il rischio di una sovrastima dei dati, in quanto l assenza di figli, in una certa percentuale di casi, è una 23

scelta e non un effetto dell infertilità. Il rischio di sovrastima dei dati è reale nei paesi industrializzati dove la scelta dell uso di mezzi contraccettivi è più diffusa, viceversa nei paesi in via di sviluppo questo rischio è irrilevante a causa delle differenti condizioni socio-culturali che non hanno portato ancora ad una completa separazione della sessualità dalla procreazione. Le stime dirette dell infertilità sono certamente più affidabili, in quanto si basano su indagini demografiche specifiche condotte sull intera popolazione o su gruppi campione. Queste indagini permettono di determinare quante coppie al momento dell inchiesta sono: 1) volontariamente o involontariamente non procreanti; 2) affette da sterilità/ infertilità primaria; 3) affette da sterilità/ infertilità secondaria. Negli ultimi decenni il progressivo calo della crescita demografica nei paesi industrializzati è dovuto, non solo a scelte socio culturali, ma anche ad un reale incremento dei casi di sterilità e infertilità. Purtroppo in Italia abbiamo esclusivamente come parametri di riferimento i dati ISTAT, che considerano gli indici di natalità e fecondità senza un analisi dell incidenza dell infertilità e della sterilità. Un inchiesta di tipo diretto condotta negli USA ha dimostrato che, nella classe d età 20-24 anni, la percentuale dei pazienti infertili è passata dal 3,5% nel 1968 al 9,7% del 1982 con un incremento del 50% (tabella 2). 24

Tabella 2: valutazione longitudinale dell incidenza dei pazienti infertili nella classe di età 20-24 anni negli USA L incremento dei casi di infertilità e sterilità nei paesi occidentali è attribuito a numerosi fattori: a) età media dei coniugi al momento del matrimonio medialmente più elevata rispetto al passato; b) difficoltà ed esigenze sociali che inducono la coppia a programmare il concepimento in età più tardiva; c) incremento delle malattie sessualmente trasmesse; d) stress; e) abitudini voluttuarie (tabagismo, uso di droghe, abuso di alcol, ed altro); f) inquinamento. 25

La World Health Organization (W.H.O.) ha stimato che, oggi nei paesi occidentali, circa l 11% delle coppie in età fertile presenta problemi di fertilità e che il problema riproduttivo riguarda maggiormente le classi d età superiori ai 30 anni, come dimostra uno studio epidemiologico di tipo diretto condotto sulla popolazione degli USA (tabella 3). Tabella 3: incidenza complessiva dei pazienti infertili e sterili per gruppi di età nella popolazione degli USA oggi Un tasso di infertilità dell 11% assume particolare rilievo se si considera che tale valore non supera il 3% nei paesi in via di sviluppo, valore pressoché sovrapponibile a quello calcolato di circa il 4%, con stime retrospettive, per l Europa del 1600. 26

L incidenza dell infertilità è molto simile in entrambe i sessi: - il fattore femminile è responsabile del 40% circa dei casi d infertilità; - il fattore maschile è responsabile del 30% circa dei casi d infertilità; - il 25% dei casi d infertilità è legato a problemi riguardanti entrambe i coniugi; - nel 5% dei casi l infertilità è idiopatica. Non va dimenticato che l infertilità maschile risulta in forte ascesa (tabella 4). Tabella 4: incidenza dell infertilità nei due sessi Se consideriamo territori diversi, i valori relativi all incidenza dell infertilità nei due sessi possono variare, in quanto sono influenzati da fattori ambientali locali. Ad esempio, nella provincia di Ragusa, 27

che rappresenta l area territoriale d Italia con la più alta concentrazione di serre, l incidenza dell infertilità maschile è molto elevata, a causa del largo consumo di fitosanitari di uso agricolo, che inquinano l ambiente. Infatti, al centro di diagnosi e cura della sterilità di Ragusa si rivolgono numerosi lavoratori serricoli, di sesso maschile, e nella maggior parte di essi si hanno gravi alterazioni dei parametri standard del liquido seminale. INFERTILITÀ FEMMINILE L infertilità femminile può essere dovuta a diversi fattori: fattore neuro-endocrino, ovulatorio, tubarico, uterino-endometriosico ed immologico. FATTORE NEUROENDOCRINO Si calcola che il 40-50% dell infertilità femminile abbia origine da disfunzioni endocrine. Qualunque anomalia lungo l asse ipotalamoipofisi-gonadi può portare o ad una mancanza di ovulazione o ad un alterato ciclo ovulatorio oppure ad una secrezione ormonale disregolata. I principali problemi ormonali che causano infertilità femminile sono: A) l ipogonadismo o ipogonadismo ipogonadotropo : consiste nello scarso funzionamento delle gonadi e nella ridotta produzione di gonadotropine. L ipogonadismo può essere centrale se l origine 28

del problema ormonale è un malfunzionamento dell ipotalamo o dell ipofisi, per esempio scarsa produzione di GnRH o dell FSH e dell LH. Si parla invece di ipogonadismo primario se l origine del problema ormonale è un mal funzionamento delle gonadi. Un particolare tipo di ipogonadismo, frequente nelle giovani donne, è quello legato alla cosiddetta amenorrea ipotalamica, che compare frequentemente in seguito a problemi psicologici (ansia, stress psichico), problemi nutrizionali e ad un eccesso di attività fisica. B) FSH elevato o ipogonadismo ipergonadotropo : consiste in una insufficienza ovarica accompagnata da un elevato rilascio di gonadotropine. Le ovaie non sono in grado di rispondere agli stimoli ormonali provenienti dall ipofisi, a causa di fattori congeniti o ambientali; di conseguenza l ipofisi mette in circolo una maggiore quantità di ormone follicolo stimolante (FSH) per sollecitare ulteriormente le ovaie. C) l iperprolattinemia : consiste nell eccessivo rilascio di prolattina ipofisaria dovuta a stress, all uso di particolari farmaci, o alla presenza di un adenoma ipofisario. Elevati livelli di prolattina interferiscono con la produzione di GnRH ipotalamico e con il funzionamento delle ovaie, causando anovulazione e irregolarità mestruali. D) l ipotiroidismo : il ridotto rilascio di ormoni tiroidei provoca un rallentamento generale del metabolismo, con conseguente riduzione del metabolismo degli ormoni sessuali, in particolare dell FSH. 29

FATTORE TUBARICO Le tube di Falloppio possono presentarsi totalmente o parzialmente occluse, interferendo con la captazione dell oocita e la sua migrazione nelle tube e impedendo la capacitazione degli spermatozoi e il processo di fecondazione. FATTORE ENDOMETRIOSICO L endometriosi è una patologia caratterizzata dalla diffusione e dalla crescita dell endometrio al di fuori dell utero. Le isole endometriosiche possono bloccare le tube di Falloppio o alterare i processi ovulatori. FATTORE CERVICALE La mucosa della cervice uterina gioca un ruolo importante nel facilitare il cammino degli spermatozoi. Qualsiasi anomalia della cervice, ad esempio malformazioni anatomiche, infezioni cervicali e qualità della mucosa, può impedire il processo di fecondazione. FATTORE OVULATORIO L infertilità femminile può essere causata anche da particolari disfunzioni ovulatorie, ad esempio: a) la sindrome dell ovario policistico (PCOS): è una disfunzione ovulatoria associata ad iperandroginismo, caratterizzata dalla pre- 30

senza di ovaie più grandi della norma, che presentano al loro interno un accumulo di piccoli follicoli, che non nella maggior parte dei casi non riescono a maturare. In assenza di un normale sviluppo follicolare si hanno cicli anovulatori e le mestruazioni sono irregolari o assenti. b) La sindrome del follicolo luteinizzato (LUF): è una rara disfunzione ovulatoria, caratterizzata dalla presenza nelle ovaie di follicoli che si trasformano direttamente in corpo luteo senza rilasciare l oocita; di conseguenza i cicli sono anovulatori. c) Si parla di insufficienza della fase luteale quando la fase luteale del ciclo (durante la quale il corpo luteo rilascia progesterone per mantenere alto l endometrio), dura meno di 10-11 giorni. Così l endometrio non si sviluppa abbastanza da consentire l impianto dell embrione. FATTORE IMMUNOLOGICO Le cause immunologiche d infertilità sono correlate a reazioni che coinvolgono antigeni spermatici. Nella donna vengono rilevati anticorpi anti-spermatozoo, appartenenti alle classi delle IgA, IgG e IgM, nel tratto cervicale (5-30% dei casi) e nel siero (tabella 5). 31

Tabella 5: incidenza delle principali cause di infertilità femminile Inoltre la letteratura medica sottolinea sempre più il ruolo di numerosi fattori psico-sociali, anche transitori, nell influenzare negativamente la fertilità femminile, tra i quali ricordiamo: lo stress fisico e psichico, l aumento delle malattie sessualmente trasmesse, l esposizione a radiazioni, l uso di droghe, l abuso di alcol, il tabagismo, l obesità e l eccessiva magrezza. Infine va ricordato che l età della donna si correla negativamente con la sua capacità riproduttiva. Il declino della fertilità femminile correlato all età, dipende dalla riduzione irreversibile della quantità e qualità degli oociti presenti nelle ovaie: quanto più un oocita invec- 32

chia, tanto più è probabile che sviluppi anomalie cromosomiche che lo rendono inadatto ad essere fecondato. Infatti nella donna la fertilità raggiunge l apice tra i 20-24 anni d età, resta stabile fino ai 30 anni, poi diminuisce gradatamente; dopo i 45 anni le probabilità di avere un figlio sono quasi nulle (tabella 6). Anche le probabilità di successo delle tecniche di procreazione medicalmente assistita (PMA) sono correlati all età della donna. Tabella 6: fertilità femminile nelle diverse classi di età 33

INFERTILITÀ MASCHILE I principali fattori che causano infertilità maschile sono: il fattore neuroendocrino, il fattore vascolare, il fattore testicolare, il fattore flogistico-infettivo, il fattore genetico e immunologico. FATTORE NEUROENDOCRINO Le disfunzioni ormonali rappresentano solo il 2-5% delle cause d infertilità maschile e determinano anomalie nella produzione e nella maturazione degli spermatozoi. Il problema ormonale più comune è rappresentato dall ipogonadismo o ipogonadismo ipogonadodropo che consiste in una diminuzione del rilascio di gonadotropine ipofisarie (FSH e LH), responsabili della produzione di testosterone e del liquido seminale. Un problema ormonale riscontrabile negli uomini è l iperprolattinemia; raramente anche l ipertiroidismo e l ipotiroidismo possono determinare infertilità maschile in quanto esercitano effetti negativi sul funzionamento sia dell ipofisi che dei testicoli. FATTORE VASCOLARE Tra le cause vascolari il varicocele è la patologia che ha maggiore associazione con l infertilità maschile (circa il 30-40%). Il varicocele consiste in una dilatazione delle vene della sacca scrotale, con conseguente reflusso e stasi del sangue nel testicolo. Proprio la stasi ematica è il motivo per cui il varicocele può diminuire la qualità del liquido seminale, determinando ipossia nel tessuto inter- 34

stiziale del testicolo, che ha un ruolo essenziale nella spermatogenesi, e un leggero aumento della temperatura testicolare, che può di per se danneggiare gli spermatozoi. FATTORE TESTICOLARE L infertilità maschile può essere una diretta conseguenza di anomalie genitali, quali ad esempio: la torsione del funicolo testicolare, l anorchia congenita e il criptorchidismo unilaterale o bilaterale; quest ultimo è caratterizzato dalla mancata discesa di uno o di entrambi i testicoli nella sacca scrotale ed ha un incidenza dell 1% tra le cause d infertilità maschile. FATTORE FLOGISTICO-INFETTIVO Le infezioni del tratto genitale possono compromettere la fertilità maschile, in quanto: causano reazioni infiammatorie, stimolano la produzione di anticorpi antispermatozoo, aumentano la produzione di radicali liberi dell ossigeno da parte dei leucociti del liquido seminale e ostruiscono i vasi deferenti e l epididimo. Le infezioni di origine batterica, come le epididimiti e le prostatiti, rappresentano la conseguenza di infezioni provenienti dalle vie urinarie e spesso sono la manifestazione di malattie a trasmissione sessuale; gli agenti patogeni maggiormente coinvolti sono i gonococchi, le chlamydie e i mycoplasmi. 35

Sono importanti anche le infezioni virali come l orchite postparotitica che compare in caso di infezioni da paramyxovirus o da coxsackie o da herpes virus. FATTORE GENETICO Sono stati condotti diversi studi in passato, dai quali risulta che l incidenza delle anomalie genetiche nei soggetti infertili è compresa tra il 2-8% con un valore medio di circa il 5%. Nei soggetti infertili si possono riscontrare sia anomalie numeriche dei cromosomi sessuali, come l aneuploidia 47xxy o sindrome di klinefelter, sia anomalie strutturali degli autosomi, che includono le traslocazioni robertsoniane, le inversioni, le duplicazioni e le delezioni. Nel braccio lungo del cromosoma Y (Yq) sono stati isolati 3 diversi loci, definiti azoospermia factors (AZFa, b, c). Si ipotizza che la presenza di microdelezioni in questi loci del Yq possa determinare azoospermia e grave oligozoospermia; queste microdelezioni nel Yq interessano più frequentemente il locus AZFa rispetto ai loci AZFb e AZFc. FATTORE IMMUNOLOGICO Il 6% dei casi di infertilità maschile è dovuta a fattori autoimmuni. La presenza di anticorpi antispermatozoo si associa ad una ridotta capacità fecondante, in quanto determinano processi di agglutinazione e riduzione della motilità spermatica. 36

Gli autoanticorpi possono trovarsi in forma solubile nel liquido seminale o nel siero oppure adesi alla superficie dello spermatozoo, e sono diretti contro antigeni presenti sulla intera superficie dello spermatozoo o solo sulla testa o solo sulla coda. In alcuni casi d infertilità maschile può non essere identificabile alcun fattore causale, si parla dunque di infertilità idiopatica (tabella 7). Tabella 7: incidenza delle principali cause di infertilità maschile Per tutto l arco della vita di un uomo, numerosi fattori non fisiologici possono influenzare negativamente la sua capacità riproduttiva, determinando condizioni di infertilità più o meno transitorie. Tali fattori possono essere: lo stress, l uso di droghe, l abuso d alcol, il fumo, l inquinamento ambientale e alimentare, le sostanze 37

tossiche, l uso di farmaci ad attività ormonale e chemioterapica, l aumento della temperatura scrotale dovuta a febbre o a posizione seduta prolungata, e altro. Alcuni di questi fattori agiscono più frequentemente in età specifiche: - PRIMA DEL CONCEPIMENTO E NEL PERIODO EMBRIO-FETALE: esposizione a farmaci assunti dalla madre. - FINO AI 10 ANNI: chirurgia erniaria. - FINO AI 20 ANNI: traumi, steroidi anabolizzanti. - FINO AI 30 ANNI: infezioni genitali, orchiepididimiti. - FINO AI 50 ANNI: uso di farmaci, patologie professionali, abuso di alcol e fumo. - DOPO I 50 ANNI: patologie prostatiche, infezioni urinarie. TECNICHE DI PROCREAZIONE MEDICALMENTE ASSISTITA (PMA) La ricerca di terapie per l infertilità è passata dai primi tentativi d inseminazione artificiale, realizzati alla fine del XVIII secolo, alla nascita di Louise Brown, la prima bimba concepita mediante fecondazione in vitro, il 25 luglio del 1978 in Gran Bretagna grazie agli studi e alle ricerche condotte dall embriologo Robert Edwards e dal ginecologo Patrik Steptoe. Parallelamente alla diffusione delle tecniche di procreazione assistita iniziarono le critiche, i processi e le proposte di legge per porre un freno e regolamentare tali pratiche. 38

In Italia, secondo l art. 1 comma 2 della legge 19 febbraio 2004 n.40, il ricorso alla procreazione medicalmente assistita è consentito qualora non vi siano altri metodi terapeutici efficaci per rimuovere le cause di sterilità o infertilità. [ ] le tecniche di procreazione medicalmente assistita sono applicate in base ai seguenti principi: - gradualità, al fine di evitare il ricorso ad interventi aventi un grado di invasività tecnico e psicologico più gravoso per i destinatari, ispirandosi al principio della minore invasività; - consenso informato. Infine è vietato il ricorso alle tecniche di procreazione medicalmente assistita di tipo eterologo (art. 4, commi 2 e 3, legge 40/2004). Per PMA si intende: assistenza medica finalizzata alla realizzazione di avere un figlio mediante opportune tecniche e strumentazioni mediche, prestata a coppie che non sono in grado di realizzare tale desiderio con metodi naturali. Le tecniche di PMA consentono di: 1) ottimizzare la produzione di ovociti, mediante stimolazione ovarica; 2) ottimizzare la qualità degli spermatozoi, mediante promozione della capacitazione del liquido seminale e selezione nemaspermica; 3) creare le condizioni migliori per la fecondazione all interno del corpo femminile, cioè in vivo, o all esterno del corpo femminile, cioè in vitro. 39

Si parla di fecondazione omologa (AIH) quando il seme appartiene al partner della donna, e di fecondazione eterologa (AID) quando il seme proviene da un donatore esterno alla coppia. Le tecniche di PMA sono attualmente rappresentate da una vasta gamma di opzioni terapeutiche a diverso grado di invasività, sia tecnica che psicologica sulla coppia. Tali tecniche vengono classificate in I, II, e III livello sulla base della loro complessità e del grado di invasività tecnica. TECNICHE DI I LIVELLO - Induzione dell ovulazione: stimolazione delle ovaie a produrre uno o più oociti associata alla fecondazione, mediante rapporti naturali programmati. - Inseminazione intrauterina (iui): immissione del liquido seminale nella cavità uterina. INDICAZIONI CLINICHE - Sterilità idiopatica; - oligoastenozoospermia; - endometriosi di I-II stadio e casi selezionati di III stadio della classificazione American Fertility Society (AFS) in particolare dopo intervento chirurgico; - ripetuti insuccessi di induzione della gravidanza con stimolazione dell ovulazione e rapporti mirati; 40

- fattore cervicale; - fattore immunologico; - patologie sessuali e coitali che non hanno trovato giovamento dall inseminazione intracervicale semplice. TECNICHE DI II LIVELLO Procedure progressivamente più impegnative eseguibili in anestesia locale e/o sedazione profonda. - Fecondazione in vitro e traferimento dell embrione (FIVET); - iniezione intracitoplasmatica dello spermatozoo (ICSI); - prelievo testicolare degli spermatozoi (TESA): per aspirazione percutanea o tramite biopsia testicolare; - trasferimento intratubarico di gameti maschili e femminili (GIFT), zigoti (ZIFT), o embrioni (TET): per via transvaginale ecoguidata o isteroscopia. INDICAZIONI CLINICHE PER L ESECUZIONE DELLA FIVET - Fattore tubarico peritoneale; - infertilità maschile di grado moderato; - endometriosi di III e IV grado; - infertilità idiopatica; - fattore immunologico; - fallimento dell iter terapeutico a bassa tecnologia. 41

INDICAZIONI CLINICHE PER L ESECUZIONE DELL ICS Sperma eiaculato: 1) infertilità maschile di grado severo; 2) disordini eiaculatori (eiaculazione retrograda); 3) ripetuti fallimenti della fertilizzazione dopo IVF-ET. Sperma epididimario: 1) assenza congenita bilaterale dei deferenti; 2) vasoepididimostomia fallita; 3) vasotomia fallita; 4) ostruzione di entrambi i dotti eiaculatori. TECNICHE DI III LIVELLO Procedure di elevata complessità e invasività, che necessitano di anestesia generale con intubazione (poco usate). - Estrazione microchirurgica di spermatozoi dal testicolo (TESE); - prelievo degli ovociti per via laparoscopica; - trasferimento intratubarico dei gameti maschili e femminili (GIFT), zigoti (ZIFT), o embrioni (TET). 42

SCOPO DEL LAVORO Lo studio condotto nella presente tesi si basa sull analisi dell efficienza delle diverse procedure di preparazione del liquido seminale, ovvero dei principali metodi di separazione degli spermatozoi dal plasma seminale, al fine di ottenere un campione contenente un alta percentuale di spermatozoi normali e mobili, privo di detriti e spermatozoi morti o anomali. I principali metodi di separazione utilizzati sono: swim-up da strato, swim-up da pellet e gradiente di densità. L efficienza di ciascuna tecnica viene generalmente espressa come il numero assoluto o relativo degli spermatozoi recuperati, morfologicamente normali e mobili. Lo scopo del nostro lavoro è rappresentato dalla necessità di scegliere la metodica di preparazione del liquido seminale più adatta, in funzione dello specifico campione e delle anomalie che esso presenta al fine di ottimizzare la qualità e la quantità degli spermatozoi iniettabili. L applicazione di un adeguata procedura di selezione nemaspermica, che porta al recupero di un elevata percentuale di spermatozoi capacitati e potenzialmente fecondanti, è fondamentale per consentire ad una coppia, candidata ad un opzione terapeutica ad elevato grado di invasività tecnico-psicologica e di elevato costo, di essere sottoposta ad una tecnica di procreazione medicalmente assistita (PMA) di I livello, meno complessa ed invasiva. 43

MATERIALI E METODI SPERMIOCITOGRAMMA L esame del liquido seminale, o spermiocitogramma, rappresenta il punto di partenza dello studio della capacità fecondante di un uomo. Sebbene la valutazione dell intera popolazione degli spermatozoi e- messi nell eiaculato non può definire la capacità fecondante di quei pochi che hanno raggiunto il sito di fecondazione, tuttavia l esame seminale fornisce essenzialmente informazioni relative alle condizioni cliniche del soggetto. RACCOLTA E CONSEGNA DEL CAMPIONE Il campione deve essere raccolto dopo un periodo di astinenza sessuale di non meno di 48 ore e non più di 7 giorni. Sul modulo di accompagnamento di ogni analisi dovranno essere registrati il nome del paziente, il periodo di astinenza, il giorno e l ora della raccolta e l intervallo intercorso tra la raccolta e l analisi. Preferibilmente, il campione andrà raccolto in un apposita stanza nei pressi del laboratorio. Altrimenti dovrà essere consegnato al laboratorio entro 1 ora dalla raccolta. Il campione dovrà essere ottenuto per masturbazione e raccolto in un contenitore pulito di vetro o di plastica. Il contenitore dovrà essere caldo (20-40 C) per evitare una diminuzione della motilità. Il campione seminale deve essere completo. 44

ESAME MACROSCOPICO INIZIALE Liquefazione Un campione seminale si liquefa entro 60 minuti a temperatura ambiente, sebbene generalmente questo avvenga entro 15 minuti. La presenza di strie di muco, segno di incompleta liquefazione, può interferire con l esecuzione dell esame seminale. Aspetto Il liquido seminale normale ha un aspetto grigio opalescente. Può apparire meno opaco se la concentrazione di spermatozoi è molto bassa, di colore rosso brunastro se ci sono emazie o giallognolo in pazienti con ittero o che assumono vitamine. Volume Il volume dell eiaculato dovrebbe essere misurato usando un cilindro graduato a base conica. Il volume normale dell eiaculato oscilla tra 2 ml e 5 ml. Viscosità La viscosità del campione liquefatto, spesso definita consistenza, viene valutata aspirando il liquido seminale in una pipetta da 5 ml dall imboccatura ampia, e lasciandolo gocciolare per gravità, osservando la lunghezza del filamento ottenuto: un campione normale lascia la pipetta come piccole gocce distinte. In caso di anormale viscosità la goccia formerà un filamento superiore ai 2 cm. 45

ph Una goccia di liquido seminale deve essere uniformemente stesa su un apposita cartina indicatrice. Dopo 30 secondi il colore della zona bagnata diventa uniforme e deve essere confrontato con la scala delle colorazioni per leggere il valore di ph. Il ph del liquido seminale varia tra 7.2 e 8.2 ed entro questi limiti si ha una vitalità ottimale degli spermatozoi. ESAME MICROSCOPICO INIZIALE Determinazione della concentrazione degli spermatozoi Per la conta degli spermatozoi viene utilizzata la camera di Makler, che ha profondità di 10 µm ed un area righettata di 1 mm² divisa in 100 quadratini. Vengono posti 10 µl di campione sul portaoggetti della camera di Makler preriscaldata, e coperti con il vetrino copri oggetti. Il numero di spermatozoi contati in 10 quadrati (ovvero una fila) corrisponde ad una concentrazione in milioni/ml. Si può ottenere una stima approssimativa della concentrazione degli spermatozoi in milioni/ml contando il numero di spermatozoi per campo microscopico. Se il numero degli spermatozoi è basso, si centrifuga il campione seminale per concentrarlo, e determinare successivamente la concentrazione di spermatozoi. 46