diagnosi di GIST, né dovrebbe precludere il trattamento con Gleevec/Glivec.

c-kit pharmdx Codice K1906 25 test per uso manuale Uso previsto Per uso diagnostico In Vitro. Il saggio c-kit pharmdx è un kit di analisi immunoistochimica (IHC) qualitativa che consente di identificare l'espressione dell'antigene della proteina c-kit (CD117) in tessuti normali e neoplastici fissati in formalina e inclusi in paraffina per la valutazione istologica. Gli anticorpi policlonali di coniglio del c-kit pharmdx individuano in maniera specifica la proteina c-kit nelle cellule che esprimono l'antigene CD117. L'analisi c-kit pharmdx è uno strumento diagnostico valido nella diagnosi differenziale dei tumori stromali gastrointestinali (in sigla, GIST). Dopo la diagnosi del GIST, i risultati del c-kit pharmdx si possono applicare alla identificazione dei pazienti idonei ad una terapia a base di Gleevec /Glivec (imatinib mesilato). I risultati della colorazione con ematossilina ed eosina (H&E) e un pannello di anticorpi possono contribuire alla diagnosi differenziale dei GIST. L'interpretazione deve tenere conto dell'anamnesi del paziente e deve basarsi su ulteriori esami diagnostici eseguiti da un patologo qualificato. Nota: questo test non è concepito né come la sola base della diagnosi di GIST né come la sola base della scelta della terapia a base di Gleevec/Glivec. Non sono stati stabiliti gli esiti su pazienti GIST con c-kit negativo trattati con Gleevec/Glivec. Un risultato negativo non escluderebbe necessariamente la 1, 2, 3 diagnosi di GIST, né dovrebbe precludere il trattamento con Gleevec/Glivec. Tutti i pazienti ammessi agli studi clinici su Gleevec/Glivec di Novartis sono stati selezionati applicando un Novartis Clinical Trial Protocol (NCTP) di investigazione. Il reagente primario specifico per l'anticorpo policlonale di coniglio c-kit usato nell'nctp è stato acquistato dalla Dako. Il reagente primario dell'anticorpo policlonale c-kit pharmdx è stato sottoposto allo stesso metodo di produzione, purificazione e controllo qualità del reagente policlonale NCTP specifico per il c-kit. Cenni e spiegazioni Introduzione Il proto-oncogene c-kit, altrimenti noto come antigene CD117 o recettore del fattore delle cellule staminali, è un recettore tirosinchinasico transmembrana di tipo III con peso molecolare 145 kd. Il gene c-kit codifica un recettore tirosinchinasico transmembrana con una struttura analoga a quella dei recettori del fattore di crescita A e B derivati dalle piastrine, oltre che il recettore 1 del fattore di stimolazione delle colonie, e sembrerebbe svolgere un ruolo importante nell'ematopoiesi, nella spermatogenesi e nella melanogenesi. La proteina c-kit contiene dei domini extracellulari con 5 anse tipo Ig, un dominio transmembrana altamente idrofobico, e un dominio intracellulare con un'attività tirosinchinasica divisa da un inserimento chinasico in una regione ATP-legante e un dominio fosfotransferasico. L'attivazione del recettore è accompagnata da dimerizzazione del recettore, fosforilazione e autofosforilazione del substrato, internalizzazione del recettore, attivazione delle chinasi e fosfolipasi della proteina e trascrizione di diversi proto-oncogeni. 4 È stato dimostrato che il percorso del recettore della tirosinchinasi c-kit è importante per la crescita e l'evoluzione tumorale in svariati tipi di cancro. 5 Le mutazioni nel gene c-kit provocano una fosforilazione legante-indipendente (attivazione) della tirosinchinasi c-kit e sono sospettate di svolgere un'azione patogena rilevante, ad esempio nei tumori stromali gastrointestinali. 6 Da sempre i tumori mesenchimali gastrointestinali sono difficili da riconoscere e diagnosticare. Nel 2001 l'agenzia statunitense Food and Drug Administration ha approvato l'uso dell'imatinib mesilato (Gleevec, Novartis, Basilea, Svizzera) nella terapia contro i tumori stromali gastrointestinali (GIST). L'approvazione è maturata sulla base di uno studio clinico riguardante la somministrazione di imatinib mesilato ad un gruppo selezionato di pazienti adulti affetti da GIST, nei quali era stata accertata l'espressione della proteina c-kit mediante le tecniche immunoistochimiche (Protocollo per studi clinici Novartis). 7 I casi di GIST sono descritti in base a tre categorie morfologiche: a cellule fusiformi, epitelioidi o di tipo misto. A prescindere dalla morfologia, la maggioranza dei GIST esprime la proteina c-kit in una proporzione significativa delle cellule tumorali. 8-11 Va tuttavia sottolineato che in una percentuale minima di GIST non è riscontrabile alcuna espressione della proteina c-kit. È possibile che un numero relativamente basso di altri tumori risulti positivo alla proteina c-kit. Tra questi, il melanoma metastatico, l'angiosarcoma, il sarcoma di Ewing, il mastocitoma, il seminoma e il carcinoma polmonare a piccole cellule. I GIST sono generalmente positivi anche al caldesmon ad elevato peso molecolare, spesso positivi al CD34 (60-80%) e in genere negativi alla desmina e alla proteina S100. 12 Specificità Anticorpi policlonali di coniglio anti proteina c-kit sono stati ottenuti iniettando per via sottocutanea un peptide (aa) a 14 aminoacidi (posizioni 963-976 della porzione C-terminale intracellulare della proteina c-kit) accoppiato alla tireoglobulina. L'antisiero è stato purificato in modo specifico mediante cromatografia di affinità con AvidGel F tiolo-attivato legato all'antigene. (111763-003) 305757IT_001 p. 1/15

Anche un piccolo numero di sarcomi del tessuto molle è risultato positivo alla proteina c-kit. 6 Alcuni di questi campioni (ad esempio, leiomiosarcoma) sono stati sottoposti a test per individuare l'espressione di c-kit. Lo studio prevedeva un confronto tra il saggio c-kit pharmdx e il Novartis Clinical Trial Protocol (NCTP) così come viene impiegato per la selezione dei pazienti da sottoporre al trattamento con Gleevec negli studi clinici condotti da Novartis. Su un totale di ventotto campioni testati, soltanto due hanno riportato una colorazione positiva. Il risultato è identico in entrambi i protocolli. Tutta l'immunocolorazione positiva è stata annullata dopo l'assorbimento dell'anticorpo primario con un peptide sintetico (estremo C-terminale a 16 aminoacidi della proteina c-kit). Significa che l'anticorpo primario utilizzato nel saggio c-kit pharmdx ha reagito in modo specifico con la proteina c-kit nei due sarcomi del tessuto molle con colorazione positiva. Studi sul c-kit pharmdx svolti internamente hanno dimostrato l'espressione della proteina c-kit in diverse cellule normali. Queste cellule comprendono cellule duttali e mioepiteliali del seno, processi delle cellule di Purkinje, cellule della lamina propria del colon, l'epitelio tubulare renale, melanociti e cellule mioepiteliali della pelle, cellule interstiziali di Cajal nell'intestino tenue e mastociti. La reattività citoplasmatica nei granulociti è stata provocata dall'attività perossidasica endogena ed era visibile con il Reagente di controllo negativo. Reagenti Il codice K1906 si riferisce alla colorazione manuale. Il materiale elencato è sufficiente per effettuare 25 test (25 vetrini di pazienti e 10 vetrini di controllo incubati con il reagente anticorpale primario anti-proteina c-kit e 25 vetrini incubati con il corrispondente Reagente di controllo negativo). Il numero di test si basa sul protocollo manuale c-kit pharmdx con tutti i reagenti pronti all'uso. Il kit contiene materiale sufficiente per effettuare un massimo di 10 cicli di colorazione singoli. Materiale fornito Quantità Descrizione 1x4 ml IgG policlonale di coniglio c-kit pharmdx Anticorpo policlonale IgG anti-c-kit umana di coniglio in tampone Tris-HCl, contenente proteina stabilizzante e sodio azide 0,015 mol/l. 1x4 ml Reagente di controllo negativo dell'igg di coniglio Anticorpo policlonale IgG di coniglio ad una concentrazione maggiore o uguale a quella dell'anticorpo positivo anti-c-kit in tampone Tris-HCl, contenente proteina stabilizzante e sodio azide 0,015 mol/l. 2x5 vetrini Vetrini di controllo c-kit pharmdx Ogni vetrino contiene: sezioni di due linee cellulari murine (+) e umane (-) pellettizzate, fissate in formalina, incluse in paraffina, che rappresentano un livello moderato di espressione della proteina c-kit e assenza di espressione di c-kit. I valori di intensità della colorazione IHC dei pellet cellulari sono pari a 2+ e 0. Principio della Il kit per IHC c-kit pharmdx contiene anticorpi policlonali e vetrini di controllo che consentono di completare procedura una procedura di colorazione IHC su campioni fissati in formalina e inclusi in paraffina. Al termine dell'incubazione con anticorpi policlonali primari anti-proteina c-kit umana, il kit prevede l'impiego di un reagente di visualizzazione pronto all'uso, il quale sfrutta la tecnologia a base di destrano. Il reagente è composto da molecole di anticorpo secondario di capra anti-coniglio e da molecole di perossidasi di rafano, legate ad una comune catena principale di destrano. Questa tecnologia elimina la necessità di applicare in modo sequenziale un anticorpo di collegamento e un coniugato con perossidasi. La conversione enzimatica del cromogeno aggiunto successivamente porta alla formazione di un prodotto di reazione visibile nel sito antigenico. A questo punto è possibile procedere alla colorazione di contrasto del campione e montare un vetrino coprioggetto. L'interpretazione dei risultati avviene per mezzo di un microscopio ottico. Per effettuare il controllo qualità del rendimento del reagente del kit vengono forniti dei vetrini di controllo contenenti due linee cellulari umane fissate in formalina e incluse in paraffina, con valori di intensità di colorazione pari rispettivamente a 2+ e 0. (111763-003) 305757IT_001 p. 2/15

Materiali necessari ma non forniti Il protocollo per IHC c-kit pharmdx è stato collaudato con i reagenti di colorazione Dako elencati di seguito: Wash Buffer (codice S3006) Dual Endogenous Enzyme Block (codice S2003) Target Retrieval Solution (codice S1699 o S1700) EnVision+ HRP, Anti-Rabbit (codici K4002 e K4003) DAB+ (codici K3467 e K3468) Nota: per ottenere risultati validi con la colorazione, utilizzare solo questi reagenti con il saggio c-kit pharmdx. Non sono state approvate variazioni rispetto al protocollo consigliato. Altro materiale necessario per eseguire il saggio c-kit pharmdx : ematossilina, a base di alcol o acqua, ad esempio Dako Hematoxylin (codice S3301 o S3302) Vetrini coprioggetto Bagnomaria, ben calibrato e in grado di mantenere una temperatura di 95 99 C; oppure pentola a pressio ne, in grado di raggiungere una temperatura di 125 C Acqua distillata o deionizzata (acqua di grado reagente) Forno essiccante, in grado di mantenere una temperatura di 56 60 C Etanolo, assoluto e al 95% Microscopio ottico (ingrandimento dell'obiettivo 4x-40x) Mezzo di montaggio, ad esempio Dako Faramount (codice S3025) o Dako Glycergel (codice C0563) o Dako Ultramount (codice S1964) Tessuti positivi e negativi da utilizzare come controlli di lavoro (vedi Controllo della qualità) Vetrini Fisher SuperFrost Plus, vetrini rivestiti di poli-l-lisina, vetrini caricati positivamente, o vetrini silanizzati Dako Silanized Slides (codice S3003) (vedi la sezione Preparazione del campione) Vaschette o bagni per la colorazione Contaminuti (per intervalli di 2-30 minuti) Spruzzetta Xilene, toluene o sostituti dello xilene Pipetta da 1 ml Camera umidificata Nota: tutti i reagenti inclusi o disponibili a parte, come il Dako Wash Buffer (codice S3006), sono formulati in modo specifico per questo test. Affinché il test abbia il livello di rendimento specificato, evitare sostituzioni di qualsiasi genere. Precauzioni 1. Per uso professionale. Per uso diagnostico in vitro.. 2. Questo prodotto contiene sodio azide (NaN 3), una sostanza chimica fortemente tossica in forma pura. Sebbene non sia classificato come prodotto a rischio, un accumulo di NaN 3 alle concentrazioni indicate può reagire con il rame e il piombo delle tubature formando azidi metalliche fortemente esplosive. Durante lo smaltimento, sciacquare le tubature con abbondante acqua per prevenire l'accumulo di azide nelle tubature. 3. Sia per i campioni che per i reagenti, si consiglia di adottare le normali procedure previste per il trattamento dei prodotti di origine biologica. 4. Tempi, temperature e modalità di incubazione diversi da quelli specificati possono generare risultati erronei. 5. Non sostituire gli anticorpi primari o i reagenti di controllo negativi con anticorpi primari e reagenti di controllo negativi appartenenti a lotti di produzione diversi (il numero di lotto è riportato sull'etichetta delle fiale) o con reagenti di altri produttori. Questo può produrre risultati erronei. 6. I reagenti contenuti nel kit sono stati diluiti in modo ottimale per l'uso con i reagenti consigliati. Si sconsiglia di procedere ad un'ulteriore diluizione, in quanto potrebbe causare la perdita di colorazione antigenica. Spetta all'utente verificare tali modifiche. 7. Indossare indumenti di protezione personale adeguati, così da evitare il contatto con gli occhi e la pelle. 8. Smaltire la soluzione inutilizzata nel rispetto delle disposizioni locali, regionali e nazionali in materia. 9. Su richiesta è disponibile una scheda di sicurezza per utenti professionisti. Dichiarazioni sui rischi e la sicurezza DAB Chromogen* Contiene: 1-5% tetracloruro di bifenil-3,3',4,4'-tetrailtetraammonio / Simbolo di pericolo: Nocivo R 40 Possibilità di effetti cancerogeni - prove insufficienti. R43 Può provocare sensibilizzazione per contatto con la pelle. R68 Possibilità di effetti irreversibili. S35 Non disfarsi del prodotto e del recipiente se non con le dovute precauzioni. S 36/37 Usare indumenti protettivi e guanti adatti. Di regola, non è consentito ai minori di 18 anni di lavorare con questo prodotto. È necessario preparare con attenzione gli utenti sulle corrette procedure di lavoro, le proprietà rischiose del prodotto e le norme di sicurezza necessarie. (Come da Direttiva dell'unione Europea 94/33/CE). Fare riferimento alla scheda di sicurezza del materiale (MSDS) per ulteriori informazioni. (*DAB Chromogen è un materiale necessario ma non fornito con questo kit). (111763-003) 305757IT_001 p. 3/15

Conservazione Conservare il kit per analisi c-kit pharmdx a 2 8 C. Conservare anche i vetrini di controllo a 2 8 C. Non utilizzare il kit dopo la data di scadenza stampata all'esterno della confezione del kit. Non sono stati osservati segni evidenti che suggeriscano l'instabilità di questo prodotto, pertanto è opportuno analizzare un controllo positivo e un controllo negativo contemporaneamente ai campioni dei pazienti. Se i reagenti sono conservati in condizioni diverse da quelle specificate nel relativo foglietto illustrativo, il loro uso dovrà essere convalidato dall'utente. 13 Dichiarazione di qualità Preparazione dei campioni La qualità dei reagenti del kit di analisi c-kit pharmdx è stata controllata con metodiche immunoistochimiche eseguite nelle condizioni riportate di seguito: recupero del bersaglio nella pentola a pressione Pascal (codice S2800) programmata per 30 secondi a 125 C, con raff reddamento fino a 90 C, seguito da EnVision+ Rabbit, HRP system. I campioni bioptici devono essere manipolati in modo da preservare il tessuto per la colorazione IHC. Adottare i metodi standard per il trattamento dei tessuti di tutti i campioni. 14 Sezioni incluse in paraffina Si possono utilizzare i tessuti fissati in formalina e inclusi in paraffina. Non sono stati convalidati dei fissativi alternativi e possono produrre risultati erronei. I campioni bioptici devono essere bloccati in uno spessore di 3 o 4 mm e fissati per il periodo di tempo necessario, in base al tipo di fissativo utilizzato. In seguito i tessuti vengono disidratati e diafanizzati in una serie di alcoli e xilene, quindi infiltrati con paraffina fusa. La temperatura della paraffina non deve superare i 60 C. I blocchi di tessuto adeguatamente fissati e inclusi in paraffina che esprimono la proteina c-kit si conserveranno a tempo indeterminato prima del sezionamento e del montaggio sui vetrini, purché conservati in un luogo fresco (15 25 C). 14,15 I campioni di tessuto devono essere tagliati in sezioni di 3 5 µm. Dopo il sezionamento, i tessuti devono essere montati su vetrini del tipo Fisher SuperFrost Plus, Dako Silanized (codice S3003), vetrini a carica positiva o rivestiti con poli-l-lisina e infine collocati sugli appositi rack per l'essiccamento. Scuotere il rack portavetrini su una salviettina assorbente, in modo da eliminare l'acqua intrappolata sotto la paraffina e sul vetro. Lasciare asciugare il rack portavetrini a temperatura ambiente per un'ora, quindi metterlo in un'incubatrice a 56 60 C per un'altra ora. È necessario eliminare tutta l'eventuale acqua in eccesso trattenuta sui vetrini dopo il periodo in incubatrice. A questo scopo, scuotere i vetrini su salviettine assorbenti e lasciarli asciugare nell'incubatrice per un'altra ora. Dopo il periodo trascorso nell'incubatrice, i vetrini devono essere lasciati a temperatura ambiente finché non si raffreddano e finché la paraffina non si indurisce. Per preservare l'antigenicità, le sezioni di tessuto già montate sui vetrini dovranno essere sottoposte alla colorazione entro 2 mesi dal sezionamento se conservate a temperatura ambiente (20 25 C). Con sultare il manuale della Dako intitolato: "Immunochemical Staining Methods" 16 o i riferimenti bibliografici 14 e 15 per ulteriori informazioni sulla preparazione dei campioni. L'uso di tessuti decalcificati non è stato convalidato ed è sconsigliato. I vetrini da utilizzare per la valutazione c-kit e per la verifica della presenza di tumore devono essere preparati in contemporanea. Preparare almeno 5 vetrini: 1 per la presenza di tumore, 2 per la valutazione della proteina c-kit e 2 di riserva. Preparazione dei reagenti Preparare i seguenti reagenti prima della colorazione. Target Retrieval Solution (codice S1699) Preparare una quantità sufficiente di Target Retrieval Solution. A questo scopo, diluire il prodotto Target Retrieval Solution 10x con rapporto 1:10 usando acqua distillata o deionizzata (acqua di grado reagente) per i cicli di lavaggio. Eliminare la quantità rimanente di Target Retrieval Solution dopo l'uso. Nota: quando si utilizza la Dako Target Retrieval Solution (codice S1700), non occorre diluire ulteriormente il prodotto. Wash Buffer Solution (codice S3006) Preparare una quantità sufficiente di Wash Buffer. A questo scopo, diluire il prodotto Wash Buffer 10x con rapporto 1:10 usando acqua distillata o deionizzata (acqua di grado reagente) per i cicli di lavaggio. Conservare la soluzione inutilizzata a 2 8 C per 7 giorni al m assimo. Eliminare la soluzione tampone se appare torbida. Soluzione cromogeno-substrato (DAB+)(codice 3467 o K3468) Miscelare accuratamente questa soluzione prima dell'uso. L'eventuale presenza di precipitato nella soluzione non altera la qualità della colorazione. Per preparare la DAB+ Substrate-Chromogen Solution, aggiungere 1 goccia di Liquid DAB+ Chromogen a 1 ml di DAB+ Substrate Buffer e miscelare. Gettare via la soluzione che non viene utilizzata. La soluzione DAB+ così preparata è stabile per circa 5 giorni, purché conservata a 2 8 C. Nota importante: il colore della soluzione Liquid DAB+ Chromogen nel flacone può variare da trasparente a violetto chiaro-marrone. Questa caratteristica non altera il rendimento del prodotto. Diluire in base alle istruzioni fornite sopra. L'aggiunta di una quantità eccessiva di Liquid DAB+ Chromogen al DAB+ Substrate Buffer causa un deterioramento del segnale positivo. (111763-003) 305757IT_001 p. 4/15

Mezzo di montaggio Si consiglia di usare un mezzo di montaggio permanente non acquoso, ad esempio Dako Ultramount (codice S1964). Sono anche adatti mezzi di montaggio come ad esempio Dako Faramount Mounting Medium, pronto all'uso (codice S3025) o Dako Glycergel Mounting Medium (codice C0563). Liquefare il Glycergel prima dell'uso riscaldando il mezzo fino a 40 C (±5) circ a. Procedura di colorazione per uso manuale Note sulla procedura Prima dell'uso, l'utente deve leggere attentamente le istruzioni fornite di seguito e studiare tutti i componenti (vedi Precauzioni). Tutti i reagenti devono essere equilibrati a temperatura ambiente (20 25 C) prima dell'immunocolorazio ne. Analogamente, tutte le fasi di incubazione devono svolgersi a temperatura ambiente. Evitare che le sezioni di tessuto si secchino durante la procedura di colorazione. Sezioni di tessuto essiccato possono presentare un fenomeno di colorazione aspecifica. Per prevenire l'essiccamento, collocare i vetrini in una camera umidificata. Nota: le istruzioni e i reagenti forniti con questo sistema assicurano un rendimento ottimale quando si usano con i reagenti e i materiali consigliati. L'ulteriore diluizione dei reagenti o una variazione dei tempi o delle temperature di incubazione potrebbero generare risultati erronei o discordanti. Deparaffinazione e reidratazione Prima della colorazione, i vetrini contenenti i tessuti devono essere deparaffinati per rimuovere il mezzo di inclusione e successivamente reidratati. Non rimuovere la paraffina solo parzialmente: la presenza di eventuali residui del mezzo di inclusione può provocare un aumento della colorazione aspecifica. FASE 1. Immergere i vetrini in un bagno di xilene e incubare per 5 (±1) minuti. Cambiare il bagno e ripetere una volta. FASE 2. Picchiettare i vetrini per eliminare il liquido in eccesso e immergerli in etanolo assoluto per 3 (±1) minuti. Cambiare il bagno e ripetere una volta. FASE 3. Picchiettare i vetrini per eliminare il liquido in eccesso e immergerli in etanolo al 95% per 3 (±1) minuti. Cambiare il bagno e ripetere una volta. FASE 4. Picchiettare i vetrini per eliminare il liquido in eccesso e immergerli in acqua di grado reagente per 5 (±1) minuti. FASE 5. Picchiettare i vetrini per eliminare il liquido in eccesso e immergerli nel Wash Buffer. Iniziare il saggio come specificato nella Procedura per la colorazione. Le soluzioni di xilene e di alcol devono essere sostituite dopo 40 vetrini. Al posto dello xilene è possibile utilizzare dei sostituti di toluene o xilene, ad esempio Histoclear. Target Retrieval (recupero del target) Procedura consigliata: bagnomaria FASE 1. Riempire le vaschette per la colorazione (ad esempio, vaschette Coplin), con la soluzione diluita Target Retrieval Solution (vedi "Preparazione dei reagenti"). Collocare le vaschette contenenti Target Retrieval Solution nel bagnomaria. Riscaldare il bagnomaria e portare la Target Retrieval Solution a 95 99 C (non portare all'ebollizione). R ichiudere le vaschette con i coperchi in modo da stabilizzare la temperatura ed evitare l'evaporazione. FASE 2. Immergere le sezioni deparaffinate a temperatura ambiente nella Target Retrieval Solution preriscaldata presente nelle vaschette di colorazione. Riequilibrare la temperatura del bagnomaria e della soluzione Target Retrieval Solution a 95 99 C. Incubare per 20 (±1) minuti a 95 99 C. FASE 3. Estrarre completamente la vaschetta con i vetrini dal bagnomaria. Lasciare che i vetrini si raffreddino nel Target Retrieval Solution per 20 (±1) minuti a temperatura ambiente. FASE 4. Decantare la Target Retrieval Solution e sciacquare le sezioni nel Wash Buffer (vedi "Preparazione dei reagenti"). FASE 5. Per un rendimento ottimale, immergere le sezioni nel Wash Buffer per 5 (±1) minuti dopo il recupero del bersaglio e prima della colorazione. Target Retrieval con la pentola a pressione (30 secondi a 125 C) È molto importante mantenere l'omogeneità nel protocollo di recupero del bersaglio per assicurare la riproducibilità dei risultati della colorazione. La pentola a pressione usata deve essere in grado di raggiungere e mantenere 125 C e ogni ciclo della pe ntola a pressione deve comprendere lo stesso volume totale di liquido (Target Retrieval Solution e acqua nella pentola a pressione) come pure lo stesso numero totale di vetrini. Il protocollo ottimale è riportato di seguito: FASE 1. Per ciascun ciclo aggiungere un volume consistente di acqua di grado reagente alla pentola a pressione (500 ml o consultare le istruzioni del produttore). (111763-003) 305757IT_001 p. 5/15

FASE 2. Riempire le due vaschette per la colorazione realizzate in plastica e resistenti al calore che possono contenere un rack da 24 vetrini assieme a 250 ml di Target Retrieval Solution già preparato (vedi Preparazione dei reagenti). FASE 3. Immergere le sezioni deparaffinate a temperatura ambiente nella Target Retrieval Solution nelle vaschette di colorazione. Nota: Per assicurare l'omogeneità delle procedure, durante ciascun ciclo porre 48 vetrini nella pentola a pressione usando vetrini bianchi per riempire i rack se ci fossero meno di 48 vetrini allestiti con campioni da trattare (se il numero di vetrini da trattare è pari a 24 o meno). Per preservare la Target Retrieval Solution è possibile riempire la seconda vaschetta di colorazione con 250 ml di acqua. FASE 4. Collocare le vaschette nella pentola a pressione e chiudere bene il coperchio. FASE 5. Riscaldare la pentola a pressione fino a 125 C, incubare i vetrini a 125 C per qualche second o. Lasciar raffreddare la pentola a pressione per 30 minuti senza rilasciare la pressione prima di aprire. FASE 6. Prima di aprire la pentola a pressione assicurarsi che la pressione sia stata rilasciata. Togliere le vaschette di colorazione, decantare la Target Retrieval Solution e sciacquare le sezioni nel Wash Buffer nell'acqua di grado reagente. FASE 7. Immergere le sezioni nel Wash Buffer per 5 (±1) minuti dopo il recupero del bersaglio e prima della colorazione. Nota: la Target Retrieval Solution è un prodotto monouso. Non riutilizzare. Protocollo di colorazione manuale FASE 1. Dual Endogenous Enzyme Block (codice S2003) Picchiettare per eliminare l'acqua in eccesso. Usare un tessuto privo di lanugine per asciugare con attenzione attorno all'area del campione al fine di rimuovere ogni liquido restante e per tenere il reagente all'interno dell'area prescritta. Applicare una quantità di soluzione Dual Endogenous Enzyme Block sufficiente per coprire il campione (almeno 3 gocce, 100 µl). Incubare per 5 (±1) minuti. Sciacquare delicatamente con Wash Buffer da una spruzzetta (fare attenzione a non dirigere il flusso direttamente sul tessuto per evitare che lo stesso si stacchi dal vetrino). Immergere in un bagno di Wash Buffer per 5 (±1) minuti. FASE 2. Anticorpo primario o reagente di controllo negativo Collocare i vetrini in una camera umidificata durante le incubazioni con l'anticorpo primario/reagente di controllo negativo e un polimero marcato in modo da evitare che i tessuti si secchino. Picchiettare per eliminare il tampone in eccesso come prima. Applicare una quantità di anticorpo primario o di reagente di controllo negativo sufficiente per coprire il campione [almeno 3 gocce (100 µl)]. Incubare per 30 (±1) minuti in una camera umidificata. Sciacquare i vetrini come nella fase 1. FASE 3. EnVision+ HRP, Anti-Rabbit (codici K4002 e K4003) Picchiettare per eliminare il tampone in eccesso e pulire i vetrini come prima. Applicare una quantità di polimero marcato sufficiente per coprire il campione (almeno 3 gocce, 100 µl). Incubare per 30 (±1) minuti in una camera umidificata. Sciacquare i vetrini come nella fase 1. FASE 4. DAB+ Substrate-Chromogen Solution (codici K3467 o K3468) Picchiettare per eliminare il tampone in eccesso come prima. Applicare la DAB+ Substrate-Chromogen Solution preparata in quantità sufficiente a coprire il campione [almeno 3 gocce (100 µl)]. Incubare per 10 (±1) minuti. Sciacquare delicatamente con acqua di grado reagente da una spruzzetta (fare attenzione a non dirigere il flusso direttamente sul tessuto per evitare che lo stesso si stacchi dal vetrino). Raccogliere la DAB+ Substrate-Chromogen Solution da eliminare in un contenitore per materiali pericolosi e smaltire in modo appropriato. Immergere in un bagno di acqua di grado reagente per 2 5 minuti. Proseguire con la colorazione di contrasto e il montaggio. Colorazione di contrasto (istruzioni per ematossilina) Il prodotto finale della reazione di colorazione è insolubile in alcol e in acqua. Si possono usare ematossilina, a base di alcol o acqua, ad esempio Dako Hematoxylin (codice S3301, automatizzato, o S3302, manuale). Non utilizzare colorazioni di contrasto regressive. FASE 1. Immergere i vetrini in un bagno di ematossilina. Incubare per 2 5 minuti, a seconda dell'intensità dell'ematossilina usata. FASE 2. Sciacquare delicatamente in un bagno di acqua di grado reagente. Verificare che tutta l'ematossilina residua venga lavata via. Nota: si consiglia vivamente di utilizzare Dako Hematoxylin (codice S3302). Con un'incubazione di 3 minuti, questa colorazione di contrasto genera un prodotto finale viola chiaro/blu che non oscura l'immunocolorazione specifica. Una colorazione di contrasto troppo forte potrebbe mascherare un'espressione debole della proteina c-kit/cd117. FASE 3. Sciacquare delicatamente in un bagno di acqua di grado reagente per 2 5 minuti. (111763-003) 305757IT_001 p. 6/15

Montaggio Si consiglia di usare un mezzo di montaggio permanente non acquoso, ad esempio Dako Ultramount (codice S1964). Sono anche adatti mezzi di montaggio acquosi come ad esempio Dako Faramount Mounting Medium, pronto all'uso (codice S3025) o Dako Glycergel Mounting Medium (codice C0563). Liquefare il Glycergel prima dell'uso riscaldando il mezzo fino a 40 C (±5) circ a. Nota: si consiglia di leggere i vetrini entro sei settimane dalla colorazione. Tuttavia il colore può attenuarsi a seconda di vari fattori che comprendono, ma non sono solo, la colorazione di contrasto, materiali di montaggio, metodiche e condizioni di conservazione dei vetrini. Per minimizzare l'attenuazione della colorazione conservare i vetrini al buio a temperatura ambiente (20 25 C). Controllo della qualità Se le procedure consigliate per la fissazione, il trattamento e l'inclusione dei tessuti vengono modificate in laboratorio, è possibile che i risultati presentino variazioni significative. In tal caso, oltre ad utilizzare i vetrini di controllo forniti da Dako, occorre effettuare tutta una serie di controlli interni con regolarità. Negli USA, consultare le linee guida sul controllo della qualità stabilite nel "College of American Pathologists (CAP) Certification Program for Immunohistochemistry". Fare inoltre riferimento alle istruzioni "CLIS Quality Assurance for Immunocytochemistry Approved Guideline" 17 e ai riferimenti bibliografici 18-21 per ulteriori informazioni. Vetrini di controllo c-kit pharmdx (forniti nel kit) Tutti i vetrini di controllo forniti nel kit contengono due linee cellulari murine (+) e umane (-) pellettizzate, fissate in formalina e incluse in paraffina, con valori di intensità di colorazione pari a 2+ e 0. È necessario utilizzare un vetrino in ogni procedura di colorazione. Valutando le linee cellulari sul vetrino di controllo fornito da Dako è possibile verificare la validità della procedura di colorazione. Non utilizzare i vetrini di controllo per l'interpretazione dei risultati dei campioni. Tessuto di controllo positivo I controlli dovrebbero essere costituiti da campioni freschi di autopsia/biopsia/chirurgia che sono stati fissati, trattati e inclusi in paraffina nei tempi più brevi possibili, seguendo la medesima procedura utilizzata per i campioni dei pazienti da analizzare. I controlli positivi confermano se i tessuti sono stati preparati correttamente e se sono state adottate tecniche di colorazione corrette. È necessario includere un controllo positivo per ogni set di condizioni di analisi previsto in ogni ciclo di colorazione. I controlli positivi devono produrre una colorazione positiva debole, così da evidenziare variazioni leggere nella sensibilità dell'anticorpo primario. I vetrini di controllo forniti nel kit o i campioni trattati diversamente dai campioni dei pazienti consentono di convalidare soltanto il rendimento del reagente, ma non verificano la preparazione del tessuto. I controlli positivi noti devono essere utilizzati esclusivamente per verificare il corretto rendimento dei tessuti trattati e dei reagenti per l'analisi, NON per formulare una diagnosi specifica dei campioni dei pazienti. Se i controlli positivi non presentano una colorazione positiva, significa che i risultati ottenuti con i campioni dei pazienti analizzati non sono validi. I tipi di cellule normali che possono essere utilizzati come controlli positivi aventi c-kit deboli sono: melanociti epidermici basali e cellule mioepiteliali ghiandolari della cute oltre a cellule epiteliali e mioepiteliali del seno. Come controlli interni forti è possibile utilizzare le cellule neuronali (cellule interstiziali di Cajal) e mastociti nell'intestino. Tessuto di controllo negativo In ogni ciclo di colorazione è necessario utilizzare un tessuto di controllo negativo (negativo alla proteina c-kit) che sia stato fissato, trattato e incluso in paraffina secondo la medesima procedura adottata per i campioni dei pazienti da analizzare. In questo modo è possibile verificare la specificità dell'anticorpo primario e fornire un'indicazione della colorazione di fondo specifica. Molteplici tipi di cellule presenti nella maggior parte delle sezioni tissutali offrono siti interni di controllo negativo (è necessaria una verifica dell'utente). Se si osserva una colorazione specifica nel tessuto di controllo negativo, significa che i risultati ottenuti con i campioni dei pazienti analizzati non sono validi. Tra gli elementi del tessuto che possono essere utilizzati come controlli negativi vanno citati i miociti cardiaci. Anche le cellule acinose pancreatiche sono negative alla proteina c-kit, mentre l'epitelio del dotto biliare pancreatico assume una colorazione positiva. Reagente di controllo negativo aspecifico Al posto dell'anticorpo primario, è possibile utilizzare il Reagente di controllo negativo (fornito nel kit) su una sezione di ogni campione con lo scopo di valutare la colorazione aspecifica e favorire l'interpretazione della colorazione specifica nel sito dell'antigene. Il periodo di incubazione del reagente di controllo negativo deve corrispondere a quello dell'anticorpo primario. Se si utilizza un pannello di anticorpi su sezioni di tessuto seriali, le aree a colorazione negativa presenti su un vetrino possono essere impiegate come materiale di controllo del legame aspecifico/negativo del fondo per gli altri anticorpi. Verifica del saggio Prima di utilizzare per la prima volta un anticorpo o un sistema di colorazione in una procedura diagnostica, l'utente deve verificare la specificità dell'anticorpo testandolo su una serie di tessuti interni con caratteristiche note di rendimento IHC, che rappresentano tessuti positivi e negativi noti. Fare riferimento alle procedure sul (111763-003) 305757IT_001 p. 7/15

controllo della qualità descritte in questa sezione del foglietto illustrativo e ai requisiti descritti nelle istruzioni "CAP Certification Program for Immunohistochemistry" e/o "CLIS Quality Assurance for Immunocytochemistry, Approved Guideline". 17 Le procedure per il controllo della qualità vanno ripetute per ogni nuovo lotto di anticorpi o tutte le volte che viene apportata una modifica ai parametri del saggio. Per la verifica sono idonei i tumori stromali gastrointestinali (GIST) con colorazioni di intensità note della proteina c-kit e i tessuti negativi. Tabella 1. Finalità del controllo di qualità giornaliero Tessuto: fissato e trattato come il campione del paziente Anticorpo specifico e sistema di rivelazione Vetrino di controllo fornito da Dako. Controllo della sola procedura di colorazione. Valutando le linee cellulari sul vetrino di controllo fornito da Dako è possibile verificare la validità della procedura di colorazione. Controllo positivo: tessuti o cellule che contengono l'antigene bersaglio da individuare (potrebbe essere presente nel tessuto del paziente). Il controllo ideale è un tessuto con una colorazione positiva debole, in quanto è più sensibile al deterioramento dell'anticorpo o dell'antigene. Controllo negativo: tessuti o cellule che si presume negativi (potrebbero trovarsi nel tessuto del paziente o nel tessuto di controllo positivo). Controllo di tutte le fasi dell'analisi. Convalida i reagenti e le procedure seguite per la colorazione della proteina c-kit. Rilevamento di reattività crociata indesiderata dell'anticorpo rispetto alle cellule e/o ai componenti cellulari. Fondo: anticorpo aspecifico (Rabbit Negative Control Reagent) Rilevamento della colorazione di fondo aspecifica. Rilevamento della colorazione di fondo aspecifica. Tessuto del paziente. Rilevamento della colorazione specifica. Rilevamento della colorazione di fondo aspecifica. Interpretazione della procedura di colorazione La valutazione dei vetrini deve essere effettuata da un patologo con un microscopio ottico. Tutte le valutazioni devono essere effettuate sulla regione tumorale del campione. Per la valutazione della colorazione immunocitochimica e la determinazione dell'intensità, serve un obiettivo con un ingrandimento 10x o 20x. Per l'interpretazione dei risultati della colorazione, prendere in considerazione le cellule intatte: spesso le cellule necrotiche o degradate assumono una colorazione aspecifica. 14,17 In ogni kit c-kit pharmdx sono contenute linee cellulari di colorazione positiva e negativa, che consentono di convalidare il rendimento del saggio. Una colorazione adeguata dei vetrini di controllo indica che i reagenti del kit c-kit pharmdx funzionano correttamente e che il protocollo è stato eseguito in modo preciso. L'assenza di colorazione della linea cellulare di controllo HT-29 (0) e una colorazione marrone chiaro a livello di perinucleo o citoplasma nella linea cellulare di controllo P815 (2+) indicano che il ciclo di colorazione è valido. In caso di deviazioni dall'intensità ottimale della colorazione della linea cellulare di controllo positiva (troppo debole o troppo forte), è possibile che vengano generati risultati falsi-negativi o falsi-positivi. In questo caso è necessario ripetere il test. È necessario valutare il tessuto di controllo positivo. Colorazione debole della cellule mioepiteliali della pelle indicano il corretto funzionamento dei reagenti. Se i tessuti di controllo positivi non producono una colorazione positiva, significa che i risultati generati dai campioni analizzati non sono validi. Dopo il tessuto di controllo positivo è necessario analizzare il tessuto di controllo negativo per verificare la specificità della marcatura dell'antigene bersaglio ad opera dell'anticorpo primario. L'assenza di colorazione specifica nel tessuto di controllo negativo conferma l'assenza di reattività crociata dell'anticorpo nei confronti di cellule/componenti cellulari. Se si osserva una colorazione specifica nel tessuto di controllo negativo, i risultati ottenuti con i campioni dei pazienti analizzati non sono da ritenersi validi. Se presente, la colorazione aspecifica apparirà piuttosto diffusa. È possibile osservare anche la colorazione sporadica del tessuto connettivo nelle sezioni sottoposte ad eccessiva fissazione in formalina. Per l'interpretazione dei risultati utilizzare cellule intatte: spesso le cellule necrotiche o degenerate si colorano in modo aspecifico. 18 In ultimo esaminare i campioni dei pazienti. L'intensità della colorazione positiva deve essere valutata tenendo conto di possibili colorazioni di fondo aspecifiche ad opera del reagente di controllo negativo. L'interpretazione dell'espressione della proteina c-kit/cd117 deve necessariamente tenere conto del quadro morfologico generale e clinico del tumore. I casi di GIST sono suddivisi in tre categorie morfologiche: a cellule fusiformi (70%), epitelioidi (20%) o di tipo misto. 22 A prescindere dalla morfologia, la maggioranza dei GIST esprimono la proteina c-kit secondo un rapporto significativo rispetto alle cellule tumorali. L'immunocolorazione omogenea con il kit c-kit pharmdx è osservabile principalmente in sede di citoplasma (con o senza un pattern puntiforme a livello di golgi/perinucleo) e nella membrana cellulare (con una colorazione circonferenziale che può essere completa o incompleta). In alcuni casi si è riscontrato un pattern di colorazione eterogeneo (un (111763-003) 305757IT_001 p. 8/15

insieme di colorazione citoplasmatica e/o membranosa forte e debole). È stata osservata anche la colorazione di spazi extracellulari. I risultati del test c-kit pharmdx devono essere classificati come positivi o negativi. La struttura da valutare è la colorazione del citoplasma e della membrana (Tabella 2). La positività all'espressione della proteina c-kit è definita come colorazione specifica del citoplasma e/o della membrana nelle cellule tumorali. Si deve interpretare con cautela una positività o colorazione focale delle cellule tumorali inferiore al 10%. 23 Come accade per tutti gli esami immunocitochimici, un risultato negativo significa che l'antigene ricercato non è stato trovato, ma non significa che l'antigene non è presente nelle cellule e nei tessuti analizzati. Occorre anche sottolineare che una piccola percentuale di GIST non esprime affatto la proteina c-kit. Ciò significa che l'assenza di colorazione della proteina c-kit non esclude a priori la diagnosi di GIST. Tabella 2. Risultati della colorazione con il kit c-kit pharmdx Riferire al medico curante Proteina c-kit negativa Proteina c-kit positiva Definizione Percentuale di colorazione delle cellule tumorali La colorazione positiva è definita come una qualsiasi colorazione IHC del citoplasma e/o delle membrane della cellula tumorale oltre il livello di fondo. Intensità della colorazione: 1+, 2+ o 3+ Se necessario, è possibile utilizzare un pannello di anticorpi per identificare le reazioni false-negative. Quando la colorazione focale è positiva, considerare la possibilità di eseguire ulteriori analisi per confermare la diagnosi di GIST. L'analisi genetica come pure i pattern di colorazione specificati nella Tabella 3 contribuiscono alla diagnosi differenziale fra GIST e altri sarcomi mesenchimali. Per informazioni specifiche sulla immunoreattività, vedere i paragrafi "Cenni e spiegazioni" e "Limiti e Caratteristiche prestazionali". Tabella 3. Schema immunoistochimico per la diagnosi differenziale dei tumori a cellule fusiformi nel tratto GI. 5 SMA ckit CD34 Actina nel S-100 Desmina muscolo liscio GIST 95% 60-70% 30-40% 5% 2% Tumore del muscolo liscio - 10-15% + Raro + Neurilemma - Usualmente - + - Fibromatosi Controverso* Raro + - Raro * La maggior parte degli autori, ma non tutti, riferiscono che le fibromatosi risultano negative al c-kit. A seconda della durata dell'incubazione o della potenza dell'ematossilina impiegata, la colorazione di contrasto può produrre un blu più o meno scuro nel nucleo della cellula. Una colorazione di contrasto eccessiva può compromettere la corretta interpretazione dei risultati. Limiti Limiti generali L'IHC è una tecnica diagnostica multifase che richiede un addestramento specifico per quanto riguarda la scelta dei reagenti appropriati, la selezione, la fissazione e il trattamento dei tessuti, la preparazione del vetrino per IHC e l'interpretazione dei risultati della colorazione. La colorazione del tessuto dipende dal modo in cui il tessuto viene maneggiato e pretrattato. Una fissazione eseguita in maniera scorretta, il congelamento, lo scongelamento, il lavaggio, l'essiccazione, il riscaldamento, il sezionamento o la contaminazione con altri tessuti o fluidi possono produrre artefatti, intrappolare l'anticorpo o generare risultati falsi-negativi. Risultati incoerenti possono essere provocati anche da modifiche apportate ai metodi di fissazione e di inclusione o da irregolarità intrinseche del tessuto. L'interpretazione clinica di qualsiasi colorazione positiva o assenza di colorazione non può prescindere dal contesto della presentazione clinica, della morfologia e di altri criteri istopatologici e deve sempre essere accompagnata da studi morfologici e da controlli adeguati, oltre che da altri test diagnostici. L'interpretazione della colorazione è compito di un patologo qualificato, che deve avere una profonda conoscenza degli anticorpi, dei reagenti e dei metodi impiegati. La colorazione deve essere eseguita in un laboratorio autorizzato certificato, sotto la supervisione di un patologo, il quale esaminerà i vetrini colorati e garantirà la correttezza dei controlli positivi e negativi. Questo prodotto non è concepito per l'uso nella citometria a flusso. Non sono state studiate le caratteristiche prestazionali per la citometria a flusso. I tessuti delle persone infette dal virus dell'epatite B e contenenti l'antigene di superficie dell'epatite B (HBsAg) possono essere interessati da una colorazione aspecifica con la perossidasi di rafano. 24 I reagenti potrebbero provocare reazioni impreviste in tessuti che non sono mai stati analizzati in passato. Inoltre non è possibile escludere la possibilità che si verifichino reazioni impreviste anche in gruppi di tessuti (111763-003) 305757IT_001 p. 9/15

già analizzati in passato, vista l'elevata variabilità biologica dell'espressione antigenica nelle neoplasie o in altri tessuti patologici. 20 Si prega di voler comunicare eventuali reazioni impreviste all'assistenza Tecnica Dako, fornendo tutta la documentazione del caso. Limiti specifici del prodotto Una piccola percentuale di GIST non esprime affatto la proteina c-kit. Ciò significa che l'assenza di colorazione con la proteina c-kit non esclude a priori la diagnosi di GIST. Eventuali risultati falsi-positivi potrebbero essere dovuti ad un legame non immunologico delle proteine o dei prodotti di reazione del substrato, oltre che all'attività di pseudoperossidasi (eritrociti) e all'attività di perossidasi endogena (citocromo C). 19 Per garantire risultati ottimali e riproducibili, la proteina c-kit richiede una fase di recupero del bersaglio quando i tessuti sono fissati come di routine (in formalina tamponata neutra) e inclusi in paraffina. Dako consiglia l'uso del c-kit pharmdx sul Dako Autostainer o sull'autostainer Plus. Non è stato convalidato l'uso del c-kit pharmdx su piattaforme automatizzate alternative che possono produrre risultati erronei. Le linee cellulari di controllo che si colorano servono esclusivamente per convalidare la correttezza del ciclo di colorazione e non devono essere impiegate per valutare la reazione della colorazione nelle sezioni di tessuto. I campioni trattati secondo i metodi tradizionali e conservati in formalina tamponata neutra sono idonei ad essere analizzati con il kit c-kit pharmdx. Non sono state eseguite prove per convalidare l'uso di tessuti fissati in altri fissativi. Caratteristiche prestazionali Specificità Il reagente anticorpale della proteina c-kit è stato testato per studiare la reattività contro le linee cellulari che esprimono la proteina c-kit. Negli esperimenti di Western blotting eseguiti su un lisato della linea cellulare SY appartenente al carcinoma polmonare a piccole cellule, che esprime una quantità elevata di mrna c-kit, il reagente anticorpale ha marcato una banda di peso molecolare 145 kd corrispondente alla proteina c-kit. La banda marcata è piuttosto ampia (da 120 a 155 kd). L'anticorpo ha marcato un'altra banda di 100 kd. 25 Inoltre, è stato applicato un diverso anticorpo anti-c-kit che pure ha marcato la proteina 100 kd. La marcatura è stata annullata incubando il reagente anticorpale con l'antigene sintetico del peptide c-kit impiegato per l'immunizzazione. 26 In studi aggiuntivi il reagente anticorpale del c-kit è stato testato applicando la metodica del Western blotting per rilevare la reattività crociata alle proteine che presentano delle omologie strutturali, come ad esempio il recettore del fattore di crescita derivato dalle piastrine (PDGFRa), il recettore del fattore di stimolazione della colonia di macrofagi (c-fms) e la tirosinchinasi 3 FMS-simile (FLT-3). Non è stata osservata alcuna reattività crociata con queste proteine omologhe. Inoltre, nell'analisi Western blotting il reagente anticorpale della Dako non ha mostrato reazioni con un lisato della linea cellulare HS appartenente all'adenocarcinoma, la quale non esprime il gene c-kit. 25 Studi comparativi L'immunocolorazione con il saggio c-kit pharmdx è stata eseguita su sarcomi fissati in formalina e inclusi in paraffina e su matrici di tessuti multipli (multi-tissue arrays, MTA) contenenti una selezione di sarcomi che presentavano un'espressione sia positiva che negativa della proteina c-kit. Gli stessi MTA sono stati analizzati con il saggio c-kit pharmdx dopo l'impiego di due metodi HIER (Heat Induced Epitope Retrieval) consigliati. In breve, le fonti termiche utilizzate sono state un bagnomaria (95 99 C) per 20 minuti e una pentola a p ressione (121 C) per 5 minuti, entrambi seguiti da 20 minuti di raffreddamento. Le fasi restanti della procedura di colorazione erano identiche. Questi studi sono stati confrontati con una simulazione eseguita in contemporanea del Novartis Clinical Trial Protocol (NCTP) così come viene impiegato per la selezione dei pazienti da arruolare nello studio clinico autorizzato dalla FDA per la somministrazione di Gleevec/Glivec a pazienti diagnosticati con GIST. Nello studio NCTP, la concentrazione dell'anticorpo primario policlonale della Dako usato contro la proteina c-kit (A4502) (lo stesso reagente usato nel c-kit pharmdx) era 2 volte più alta e non sono state impiegate tecniche HIER. I risultati di uno studio di comparazione tra i test NCTP e i test c-kit pharmdx (con l'uso della pentola a pressione come fonte termica) sono riassunti nella Tabella 3. Risultati analoghi (concordanza complessiva del 98,7%) sono stati ottenuti con l'uso della bagnomaria come fonte termica. Le concordanze percentuali positive e negative si sono dimostrate simili nei due gruppi messi a confronto. Tabella 4. Tabella 2x2 del protocollo c-kit pharmdx con confronto tra i risultati della procedura con la pentola a pressione e i risultati dei test "NCTP" Risultato del test c-kit pharmdx con pentola a pressione TR NCTP contemporaneo Risultati della prova del saggio Positivi n (%) Negativi n (%) Percentuale di concordanza positiva = 188/(188 +1); = 0,995 x 100 = 99,5% (esattamente 95% CI: 97,1% 100%) Percentuale di concordanza negativa = 117/(117+3); = 0,975 x 100 = 97,5% (esattamente 95% CI: 92,9% 99,5%) Concordanza complessiva = (188+117)/309 = 0,987 x 100 = 98,7% (esattamente 95% CI: 96,7% 99,7%) Un sottogruppo di questi campioni (35 casi) rappresentava tessuti provenienti da pazienti che partecipavano (111763-003) 305757IT_001 p. 10/15 Totale Positivi 188 (60,8) 3 (0,9) 191 Negativi 1 (0,3) 117 (37,9) 118 Totale 189 120 309

allo studio clinico Novartis Gleevec. Tra questi pazienti, 21 si erano sottoposti a terapia con Gleevec (58,3%). Quando gli stessi campioni sono stati rianalizzati con il test NCTP e il test c-kit pharmdx simulati, 20 sono risultati positivi in tutte e tre le procedure mentre 1 è risultato negativo. Dei 147 pazienti sottoposti alla terapia a base di Gleevec nel Novartis Gleevec Clinical Trial, è stato riferito che il 54% ha manifestato una risposta parziale e il 28% ha mantenuto stabile la malattia. 7 Per il sottoguppo di 259 campioni presentati nella Tabella 4, il risultato del test della proteina c-kit è stato determinato quando i campioni sono stati introdotti negli MTA. Trentacinque di questi casi sono stati arruolati negli studi clinici Gleevec (n=35) e quelli rimanenti sono stati analizzati negli stessi laboratori che hanno partecipato agli studi clinici Gleevec. I risultati di 179 campioni (il totale era meno di 259 a causa della perdita del campione o dell'assenza del tumore negli MTA) sono presentati nella Tabella 5 riportata di seguito. Questi campioni hanno dimostrato una concordanza complessiva con lo stato della proteina c-kit del 94,9% (esattamente 95% CI: 90,7% - 97,7%). Tabella 5. Tabella 2x2 dei risultati della pentola a pressione rispetto ai risultati del test originario Risultato del test con la pentola a pressione Stato originario del tessuto c-kit Positivi Negativi Totale n n n (%) Positivi 136 3 139 (78%) Negativi 6 34 40 (22%) Totale 142 37 179 Percentuale di concordanza positiva = 136 / (136+6); = 0,957 x 100 = 95,7% (esattamente 95% CI: 91,0% 98,4%) Percentuale di concordanza negativa = 34/ (34+3); = 0,919 x 100 = 91,9% (esattamente 95% CI: 78,1% 98,3%) Concordanza complessiva = (136+34)/ (179); = 0,949 x 100 = 94,9% (esattamente 95% CI: 90,7% 97,7%) Riproducibilità Riproducibilità tra serie (colorazione manuale) La riproducibilità tra serie è stata analizzata manualmente presso tre laboratori, in ognuno dei quali due tecnici hanno lavorato per 3 giorni con 5 campioni diversi (4 positivi, 1 negativo in ogni laboratorio). Nei 30 tessuti testati, l'intensità della colorazione ha presentato variazioni non superiori a +/- un grado di intensità di colorazione con le seguenti eccezioni: nei siti 1 e 3, un vetrino (ciascuno) presentava una variazione di due gradi di intensità. Questo risultava dalla disgregazione tissutale nel sito 1. Si è osservata una riproducibilità complessiva eccellente (100%) nel rapporto fra risultati positivi e negativi. La riproducibilità fra laboratori (colorazione manuale e automatizzata con il sistema Dako Autostainer). La colorazione immunoistochimica di 30 campioni randomizzati e mascherati con vari livelli di espressione della proteina c-kit (10 negativi e 20 positivi) è stata eseguita in tre laboratori in siti geografici diversi. I vetrini tagliati sono stati inviati a tutti i laboratori scelti per il test, affinché venissero sottoposti a colorazione manuale e automatizzata e valutati da un patologo. In due siti la determinazione dell'espressione positiva o negativa della proteina c-kit è risultata perfetta (100%) all'interno dei laboratori e fra di essi nelle procedure di colorazione sia manuali che automatizzate. Nel sito 2, i vetrini duplicati di due tessuti, che dovevano essere negativi prima dello studio si sono dimostrati essere in realtà positivi. Un'analisi di controllo ha rivelato che una piccola area (circa il 20% delle cellule tumorali) si era colorata positivamente. Questa zona del tumore non si è vista nei campioni analizzati negli altri laboratori. Riproducibilità tra serie (colorazione manuale) In ciascuno dei siti di studio, 5 vetrini allestiti con lo stesso campione positivo sono stati aggiunti al gruppo di 30 campioni colorati manualmente. È stata valutata l'intensità della colorazione e la percentuale di colorazione delle cellule tumorali. Il risultato fornito dal tessuto è rimasto positivo in ciascuno dei siti di studio e l'intensità della colorazione è rimasta entro +/- 1 grado di variazione dell'intensità. Immunoreattività La Tabella 6 mostra un quadro riepilogativo dell'immunoreattività del saggio c-kit pharmdx sul gruppo di tessuti normali consigliato. Tutti i tessuti erano stati fissati in formalina e inclusi in paraffina. Le istruzioni fornite e i reagenti consigliati nel foglietto illustrativo sono stati usati per eseguire 30 analisi di tessuti normali sul DAKO Autostainer. (111763-003) 305757IT_001 p. 11/15

Tabella 6. Valutazione della colorazione del tessuto normale con il kit c-kit pharmdx * Tipo di tessuto (n. di campioni) Surrene (3) Midollo osseo (3) Pattern di colorazione Mastociti rari (2+): citoplasma Mammella (3) Cellule epiteliali (3+): cellule mioepiteliali di membrana e citoplasmatiche: (1+): citoplasma Cervello/cervelletto (3) Cervello/cerebrum (3) Cervice (3) Colon (3) Esofago (3) Cuore (3) Rene (3) Fegato (3) Polmone (3) Cellule mesoteliali (3) Ovaio (3) Processi cellule di Purkinje (1+): citoplasma Mastociti della sottomucosa (2+) e lamina propria (2+) citoplasmatica Mastociti della sottomucosa (2+): citoplasma Epitelio tubulare (2+): citoplasma Mastociti e macrofagi (2+): citoplasma Pancreas (3) Rare cellule epiteliali del dotto pancreatico principale (3+): Mastociti (2+): citoplasma Paratiroide (3) Nervo periferico (3) Ipofisi (3) Prostata (3) Ghiandola salivare (3) Muscolo scheletrico (3) Cute (3) Intestino tenue (3) Milza (3) Stomaco (3) Testicolo (3) Timo (3) Tiroide (3) Tonsilla (3) Utero (3) Mastociti nel tessuto molle (2+): citoplasma Mastociti (2+): citoplasma Melanociti epidermici basali (1+): citoplasma Cellule mioepiteliali ghiandolari (1+): citoplasma Cellule neuronali (1+): citoplasma Mastociti (2+): citoplasma Mastociti (2+): citoplasma Mastociti nella lamina propria (2+): citoplasma * La maggior parte dei tessuti analizzati ha prodotto una colorazione positiva dei fibroblasti nel tessuto stromale (1+, fibroso) nonché dei mastociti e dei macrofagi. In alcuni casi è stata osservata una colorazione degli eosinofili indotta dalla perossidasi endogena. Studi sul c-kit pharmdx svolti all'interno hanno dimostrato l'espressione della proteina c-kit in diverse cellule normali. Queste cellule comprendono cellule duttali e mioepiteliali del seno, processi delle cellule di Purkinje, cellule della lamina propria del colon, l'epitelio tubulare del rene, melanociti e cellule mioepiteliali della cute, cellule interstiziali di Cajal nell'intestino tenue e mastociti. La reattività citoplasmatica nei granulociti è stata provocata dall'attività perossidasica endogena ed era visibile con il Reagente di controllo negativo. (111763-003) 305757IT_001 p. 12/15

Risoluzione dei problemi Tabella 7. Risoluzione dei problemi Problema Probabile causa Intervento consigliato 1. Nessuna colorazione dei vetrini. 2. Colorazione debole dei vetrini. 3. Eccessiva colorazione del fondo nei vetrini. 4. Il tessuto si stacca dai vetrini. 5. Colorazione specifica troppo intensa. 6. Colorazione debole della linea cellulare del vetrino di controllo 2+. 1a. I reagenti non sono stati utilizzati nell'ordine corretto. 1b. Sodio azide nel bagno tampone. 2a. Tempi di incubazione del reagente insufficienti. 2b. È stato utilizzato un metodo di fissazione inadeguato. 2c. Recupero del bersaglio insufficiente con la Target Retrieval Solution. 3a. La paraffina è stata rimossa parzialmente. 3b. Sono stati utilizzati additivi amidacei nel montaggio delle sezioni sui vetrini. 3c. I vetrini sono stati risciacquati male. 3d. Le sezioni si sono asciugate durante la procedura di colorazione. 3e. Legame aspecifico dei reagenti con la sezione di tessuto. 1a. Rivedere l'applicazione dei reagenti. 1b. Utilizzare un tampone fresco, privo di azide. 2a. Rivedere le istruzioni della procedura di colorazione. 2b. Controllare che il tessuto del paziente non sia fissato troppo e che il fissativo utilizzato sia quello giusto. 2c. Verificare che il bagnomaria e la pentola a pressione funzionino correttamente e che la procedura di recupero del bersaglio venga eseguita in modo corretto. (Temperature basse e/o intervalli di tempo inadeguati produrranno una colorazione debole). 3a. Utilizzare soluzioni di rimozione fresche e seguire la procedura descritta nella sezione Deparaffinazione e reidratazione. 3b. Evitare l'uso di qualsiasi additivo per fare aderire le sezioni ai vetrini. Molti di questi additivi sono immunoreattivi. 3c. Utilizzare soluzioni fresche in bagni tampone e spruzzette. 3d. Utilizzare una camera umidificata per le incubazioni di 30 minuti. 3e. Controllare che il campione sia fissato correttamente e/o verificare la presenza di necrosi. 4a. Uso di vetrini sbagliati. 4a. Utilizzare vetrini a carica positiva (Fisher SuperFrost Plus) o vetrini silanizzati (Dako Silanized Slides, codice S3003). 5a. È stato utilizzato un metodo di fissazione inadeguato. 5b. Eccessivi tempi di incubazione del reagente. 5c. Uso di un tampone di lavaggio inadatto. 5d. Uso scorretto della camera umidificata. 6a. Recupero del bersaglio insufficiente. 6b. Tempi di incubazione del reagente insufficienti. 6c. Deterioramento del vetrino di controllo. 5a. Assicurarsi di utilizzare solo i fissativi e i metodi di fissazione approvati 5b. Rivedere le istruzioni della procedura di colorazione. 5c. Utilizzare solo il tampone di lavaggio consigliato per il kit. 5d. Utilizzare una camera umidificata per le incubazioni di 30 minuti. 6a. Verificare che la procedura di recupero del bersaglio venga eseguita in modo corretto. 6b. Rivedere le istruzioni della procedura di colorazione. 6c. Controllare la data di scadenza e le condizioni per la conservazione del kit stampate sull'etichetta della confezione. Nota: fare riferimento alla sezione Risoluzione dei problemi del manuale Dako: Immunochemical Staining Methods, 3rd Edition 16, Atlas of Immunohistology 21, oppure Immunoperoxidase Techniques. A Practical Approach to Tumor Diagnosis. 18 Contattare l'assistenza Tecnica Dako per riferire di eventuali colorazioni insolite. (111763-003) 305757IT_001 p. 13/15

Bibliografia 1. Heinrich, M., Corless, C., Duensing, A., McGreevey, L., Chen, C.J., Joseph, N., Singer, S., Griffith, D., Haley, A., Town, A., Demetri, G., Fletcher, C. and Fletcher, J. PDGFRA Activating Mutations in Gastrointestinal Stromal Tumors, Science 229: 708-710, 2003 2. Taniguchi, M., Nishida, T., Hirota, S.. Isozaki, K., Ito, T., Nomura, T., Matsuda, and Kitamura, Y. Effect of c- KIT mutation on prognosis of gastrointestinal stromal tumors. Cancer Res 59: 4297-300, 1999 3. Medeiros, F., Codess. C.L., Duensing, A., Homick, J.L., Oliveira, AM., Heinrich, MC., Fletcher, J.A., Fletcher, C.D. KIT-negative gastrointestinal stromal tumors: Proof of concept and therapeutic implications. Am J Surg Pathol. Jul 28(7): 889-894 2004 4. Bühring H-J, Ashman LK, Gattei V, Kniep B, Larregina A, Pinto A, et al. CR2.7 Stem-cell factor receptor (p145(c-kit)) summary report (CD117). Schlossman SF, Boumsell L, Gilks W, Harlan JM, Kishimoto T, Morimoto C, et al., editors. Leukocyte typing V. White cell differentiation antigens. Proceedings of the 5 th International Workshop and Conference; 1993 Nov 3 7; Boston, USA. Oxford, New York, Tokyo: Oxford University Press 1995; 1882 5. Smithey BE, Pappo AS, Hill DA. C-kit expression in pediatric tumors: a comparative immunohistochemical study. Am J Surg Pathol 2002; 26:486 6. Hornick JL and Fletcher CDM. Immunohistochemical staining for KIT (CD117) in soft tissue sarcomas is very limited in distribution. Am J Pathol 2002; 117:188. 7. Demetri GD, von Mehren M, Blanke CD, Van den Abbeele AD, Eisenberg B, Roberts PJ, Heinrich MC, Tuveson DA, Singer S, Janicek M, Fletcher JA, Silverman SG, Silberman SL, Capdeville R, Kiese B, Peng B, Dimitrijevic S, Druker BJ, Corless C, Fletcher CD, Joensuu H. Efficacy and safety of imatinib mesylate in advanced gastrointestinal stromal tumors. NEJM 2002; 347, 7:472. 8. Fletcher CDM, Berman J, Corless C, Gorstein F, Lasota J, Longley JB, Miettinen M, O'Leary TJ, Remotti H, Rubin BP, Shmookler B, Sobin LH, and Weiss SW. Diagnosis of Gastrointestinal Stromal Tumors: A Consensus Approach. Human Pathology May 2002; 33:5 459 9. Dematteo RP, Heinrich MC, El-Rifai WM, Demetri G: Clinical management of gastrointestinal stromal tumors: before and after STI-571. Human Pathol 2002; 33:466. 10. Hasegawa T, Matsuno Y, Shimoda T, Hirohashi S: Gastrointestinal stromal tumor: Consistent CD117 immunostaining for diagnostic and prognostic classification based on tumor size and MIB-1 grade. Human Pathol 2002; 33:669. 11. Graadt van Roggen JF, Van Velthuysen MLF, Hogendoorn PCW. The histopathological differential diagnosis of gastrointestinal stromal tumors. J Clin Pathol 2001; 54:96. 12. Kindblom LG, Remotti HE, Aldenborg F, Meis-Kindblom JM. Gastrointestinal pacemaker cell tumor (GIPACT): gastrointestinal stromal tumors show phenotypic characteristics of the interstitial cells of Cajal. Am J of Pathol 1998; 152, 5:1259. 13. Clinical Laboratory Improvement Amendments of 1988: Final Rule, 57 FR7163, February 28, 1992 14. Sheehan DC, Hrapchak BB. Theory and practice of histotechnology. St. Louis: The C. V. Mosby Co. 1980 15. Kiernan JA. Histological and histochemical methods: Theory and practice. New York: Pergamon Press 1981 16. Boenisch T, Farmilo AJ, Stead RH. Handbook: Immunochemical Staining Methods. 3rd Edition. Dako 2001. 17. CLIS (formerly National Committee for Clinical Laboratory Standards, NCCLS). Quality Assurance for Immunocytochemistry; Approved guideline. Villanova, PA 1999. Order code MM4-A 18. Nadji M, Morales AR. Immunoperoxidase techniques. A practical approach to tumor diagnosis. Chicago: Amer Soc Clin Pathol Press 1986 19. Elias JM, Gown AM, Nakamura RM, Wilbur DC, Herman GE, Jaffe ES, Battifora H, Brigati DJ. Special Report: quality control in Immunohistochemistry. Amer J Clin Pathol 1989; 92:836 20. Herman GE, Effont EA. The taming of Immunohistochemistry: The new era of quality control. Biotech Histochem 1991; 66:194 21. Tubbs RR, Gephardt GN, Petras RE. Specimen processing and quality assurance. Atlas of Immunohistotechnology. Chicago: Amer Soc Clin Pathol Press 1986; 16 22. Demtri GD, Benjamin R, Blanke CD, Choi H, Corless C, DeMatteo RP, Eisenberg BL, Fletcher CDM, Maki RG, Rubin BP, Van den Abbeele AD, and Margaret von Mehren. NCCN Task Force Report: Optimal Management of Patients with Gastrointestinal Stromal Tumor (GIST) Expansion and Update of NCCN Clinical Practice Guideline. Journal of the National Comprehensive Cancer Network 2004, Volume 1: Supplement 1. 23. Berman J, O'Leary TJ. Gastrointestinal Stromal Tumor Workshop. Human Pathology 2001; 32(6):578 24. Omata M, Liew CT, Ascavali M, Peters RL. Nonimmunologic binding of horseradish peroxidase to hepatitis B surface antigen: A possible source of error in immunohistochemsitry. Amer J Clin Pathol 1980; 73:626 25. Tsura Y, Hiraki H, Watanabe K, Igarashi S, Shimamura K, Fukuda T, et al. Preferential localization of c-kit product in tissue mast cells, basal cells of skin, epithelial cells of breast, small cell lung carcinoma and seminoma/dysgerminoma in human: immunohistochemical study on formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. Virchows Arch 1994; 424:135 26. Yardern Y, Kuang W-J, Yang-Feng T, Coussens L, Munemitsu S, Dull TJ, et al. Human proto-oncogene c- kit: a new cell surface receptor tyrosine kinase for an unidentified ligand. EMBO J 1987; 6:3341 (111763-003) 305757IT_001 p. 14/15

Edition 07/08 (111763-003) 305757IT_001 p. 15/15