RICERCA DI SOSTANZE PROTEICHE DI ORIGINE VEGETALE NEI VINI E NEI MOSTI L'ASSEMBLEA GENERALE, Visto l'articolo 2 paragrafo 2 iv dell'accordo del 3 aprile 2001 che istituisce l'organizzazione internazionale della vite e del vino Su proposta della Sottocommissione dei metodi di analisi e valutazione dei vini, DECIDE di completare l Allegato A della Raccolta dei metodi internazionali d'analisi dei vini e dei mosti, con il seguente metodo di tipo IV: RICERCA DI SOSTANZE PROTEICHE DI ORIGINE VEGETALE NEI VINI E NEI MOSTI La tecnica descritta qui appresso permette di determinare la quantità di proteine di origine vegetale eventualmente residue nei mosti e nei vini trattati, dopo travaso. 1 PRINCIPIO Le proteine del vino vengono precipitate mediante acido tricloroacetico, e successivamente sono separate tramite elettroforesi in gel di poliacrilamide in presenza di sodio dodecilsolfato (SDS). L aggiunta di blu di Coomassie colora le proteine. L intensità della colorazione consente di determinare il tenore in proteine mediante una curva di taratura costruita preliminarmente con soluzioni di proteine di concentrazione nota. Il potere antigenico del mosto e del vino trattato viene individuato con un test d'immunoblotting. 2 PROTOCOLLO 2.1 Concentrazione delle proteine mediante precipitazione con acido tricloroacetico (TCA) 2.1.1 Reagenti 2.1.1.1 Acido tricloroacetico puro 2.1.1.2 TCA allo 0,1 % preparato a partire da 2.1.1.1: 0,1 g in 100 ml di acqua 2.1.1.3 TCA al 100 % preparato a partire da 2.1.1.1: 100 g in 100 ml di acqua 2.1.1.4 Idrossido di sodio 0,5 M 2.1.1.5 Tampone Tris/HCl 0,25 M ph=6,8 Sciogliere 30,27 g di Tris-(idrossimetil)amminometano in 300 ml di acqua distillata. Regolare il ph a 6,8 con acido cloridrico concentrato per analisi. Portare il volume a 1 l con acqua distillata. Conservare il tampone a 4 C. 2.1.1.6 Glicerolo puro 2.1.1.7 Sodio dodecilsolfato (SDS) puro 1
2.1.1.8 2-Mercaptoetanolo puro 2.1.1.9 Soluzione tampone per campioni: Essa è composta da tampone Tris/HCl 0,25 M, ph=6,8 (2.1.1.5); da 7,5 % di glicerolo puro (2.1.1.6); da 2 % di sodio dodecilsolfato (SDS) (2.1.1.7) e da 5 % di 2-mercaptoetanolo puro (2.1.1.8). Le percentuali e la molarità dei vari reagenti corrispondono alla concentrazione finale nella soluzione tampone. 2.1.2 Modo di operare Mettere 3 ml di acido tricloroacetico al 100 % (2.1.1.3) e 24 ml di vino (trattato o non trattato) in tubi da centrifuga da 50 ml. La concentrazione finale in TCA così ottenuta è dell 11 %. Dopo 30 minuti a 4 C, centrifugare i campioni a 10 000 rpm per 30 minuti a 4 C. Lavare i centrifugati con soluzione acquosa di TCA allo 0,1 % (2.1.1.2), ricentrifugati e rimessi in sospensione in 0,24 ml di miscela (1:1, v/v) d idrossido di sodio 0,5 M (2.1.1.4) e di soluzione tampone per campioni (2.1.1.9). Riscaldare i campioni a 100 C in un bagno d acqua per 10 minuti. 2.2 Elettroforesi in gel di poliacrilamide in presenza di SDS 2.2.1 Reagenti 2.2.1.1 Tampone Tris/HCl 1,5 M ph=8,8 Sciogliere 181,6 g di Tris-(idrossimetil)amminometano in 300 ml di acqua distillata. Portare il ph a 8,8 con acido cloridrico concentrato per analisi. Portare il volume a 1 l con acqua distillata. Conservare il tampone a 4 C. 2.2.1.2 Miscela acrilamide (30 %) bis-acrilamide (0,8 %) glicerolo (75 %) Aggiungere lentamente 300 g di acrilamide e 8 g di bis-acrilamide a 600 ml di una soluzione di glicerolo al 75 %. Dopo la dissoluzione, portare il volume a 1 l con glicerolo al 75 %. Conservare la miscela al buio e a temperatura ambiente. 2.2.1.3 SDS al 10 % Sciogliere 10 g di SDS in 100 ml di acqua distillata. Conservare a temperatura ambiente. 2.2.1.4 N,N,N',N'-tetrametiletilendiammina (TEMED) per elettroforesi. 2.2.1.5 Persolfato d ammonio al 10 % Sciogliere 1 g di persolfato d ammonio in 10 ml di acqua distillata. Conservare a 4 C. 2.2.1.6 Soluzione di blu di bromofenolo Sciogliere 10 mg di blu di bromofenolo per elettroforesi in 10 ml di acqua distillata. 2.2.1.7 Soluzione per il gel di separazione (15 % d acrilamide) Prepararla immediatamente prima del suo impiego: - 1,5 ml di Tris/HCl 1,5 M, ph=8,8 (2.2.1.1), - 1,5 ml di acqua distillata, - 3 ml di miscela acrilamide glicerolo (2.2.1.2), - 50 µl di SDS al 10 % (2.2.1.3), 2
- 10 µl di N,N,N',N'-tetrametiletilendiammina (TEMED) per elettroforesi (2.2.1.4), - 20 µl di persolfato d ammonio (2.2.1.5). - 1 goccia di blu di bromofenolo (2.2.1.6). 2.2.1.8 Tampone Tris/HCl 0,5 M ph=6,8 Sciogliere 60,4 g di Tris-(idrossimetil)amminometano in 400 ml di acqua distillata. Regolare il ph a 6,8 con acido cloridrico concentrato per analisi. Portare il volume a 1 l con acqua distillata. Conservare il tampone a 4 C. 2.2.1.9 Miscela acrilamide (30 %) bis-acrilamide (0,8 %) acqua Aggiungere lentamente 300 g di acrilamide e 8 g di bis-acrilamide a 300 ml di acqua. Dopo la dissoluzione, portare il volume a 1 l con acqua distillata. Conservare la miscela al buio e a temperatura ambiente 2.2.1.10 Stacking gel al 3,5 % di acrilamide Prepararlo immediatamente prima del suo impiego: - 0,5 ml di Tris/HCl 0,5 M ph=6,8 (2.2.1.8), - 1,27 ml di acqua distillata, - 0,23 ml di miscela acrilamide acqua (2.2.1.9), - 20 µl di SDS al 10 % (2.2.1.3), - 5 µl di N,N,N',N'-tetrametiletilendiammina (TEMED) per elettroforesi (2.2.1.4), - 25 µl di persolfato d ammonio (2.2.1.5), - 1 goccia di blu di bromofenolo (2.2.1.6). 2.2.1.11 Tampone di migrazione Sciogliere 30,27 g di Tris-(idrossimetil)amminometano, 144 g di glicina e 10 g di SDS in 600 ml di acqua distillata. Il ph deve essere di 8,8. Se necessario regolarlo con acido cloridrico concentrato per analisi. Portare il volume a 1 l con acqua distillata. Conservare il tampone a 4 C. Al momento dell utilizzo, diluire la soluzione 1/10 in acqua distillata. 2.2.1.12 Soluzione di colorazione Mescolare in successione: - 16 ml di blu di Coomassie Brillante G 250 ultrapuro al 5 % (5 g in 100 ml di acqua distillata), - 784 ml derivanti da 1 l di una soluzione in cui sono stati sciolti 100 g di solfato d ammonio e 13,8 ml di acido ortofosforico all 85 % per analisi, - 200 ml di etanolo assoluto per analisi. 2.2.1.13 Soluzione di decolorazione Mescolare in successione: - 100 ml di acido acetico glaciale al 100 % per analisi, - 200 ml di etanolo assoluto per analisi. - 700 ml di acqua distillata. 3
2.2.2 Modo di operare Colare la soluzione per il gel di separazione (2.2.1.7) tra due lastre di vetro dalle dimensioni di 7 x 10 cm. Livellare la superficie superiore del gel mediante aggiunta di 2 gocce di acqua distillata. Dopo la polimerizzazione del gel di separazione e l eliminazione dell acqua, deporre 1 ml di stacking gel (2.2.1.10) sul gel di separazione con una pipetta da 1 ml. Predisporre il pettine le cui impronte creeranno i pozzetti di depositi. Preparare i campioni necessari alla gamma di riferimento in una miscela (1:1, v/v) d idrossido di sodio 0,5 M (2.1.1.4) e di soluzione tampone (2.1.1.9), in modo che la gamma si acompresa tra 5 µg/ml e 50 µg/ml. Deporre da 20 a 30 µl di campioni di vino e di riferimento nei pozzetti. Dopo la migrazione (alla tensione costante di 90 V) a temperatura ambiente per circa 3-4 ore, rimuovere i gel. Immergerli immediatamente in 50 ml di una soluzione acquosa di TCA al 20 % per 30 minuti e quindi in 50 ml di soluzione di colorazione (2.2.1.12). Le proteine diventano visibili sotto forma di strisce colorate di blu. Successivamente decolorare il gel con 50 ml di soluzione di decolorazione (2.2.1.13). Quando il fondo del gel è trasparente, metterlo in acqua distillata per conservarlo. 3 ANALISI QUANTITATIVA Valutare l intensità di ogni macchia mediante uno scanner per gel e software per analisi delle immagini. Determinare la quantità di proteina presente sul gel attraverso il calcolo della densità media dei pixel della banda e per integrazione della larghezza di banda. Il tenore proteico di ogni campione viene ottenuto mediante una curva di riferimento. I punti di questa curva sono ottenuti tracciando i valori di concentrazioni note della proteina vegetale deposta sul gel in funzione della corrispondente superficie d integrazione. Il limite di quantificazione si situa a 0,030 ppm per i piselli e i lupini e a 0,36 ppm per il glutine, in un ambiente concentrato 100 volte. Il coefficiente di variazione è sempre inferiore al 5%. 4 RICERCA MEDIANTE IMMUNOBLOTTING DEL POTERE ANTIGENICO DEI VINI E DEI MOSTI TRATTATI Viene successivamente valutata la capacità antigenica delle proteine di origine vegetale eventualmente residue nei mosti e nei vini trattati dopo travaso. 4.1 PRINCIPIO Dopo l elettroforesi, i gel sono sottoposti alla tecnica d immunoblotting. Le proteine vengono trasferite su una membrana in cui verranno adsorbite. Si forma un complesso antigene-anticorpi mediante aggiunta di anticorpi anti-proteina vegetale (per esempio anticorpi anti-gliadine se la proteina vegetale è glutine). Il sistema viene rivelato mediante aggiunta di anticorpi diretti contro gli anticorpi anti-proteina vegetale accoppiati alla fosfatasi. In presenza del substrato cromogeno dell enzima, si svilupperà una colorazione dall intensità proporzionale alla quantità d immunocomplessi. Tale immunoreattività sarà quantificata con una curva di riferimento realizzata con soluzioni di proteina vegetale di concentrazione nota. 4
4.2 PROTOCOLLO 4.2.1 : Reagenti 4.2.1.1 Tampone di trasferimento Mescolare 3,03 g di Tris, 14,4 g di glicina (R) e 200 ml di metanolo (R) e portare a 1 l con acqua distillata. 4.2.1.2 Gelatina all 1 % Sciogliere 8,77 g di cloruro di sodio (R), 18,6 g di acido etilendiamminicotetracetico (EDTA) per analisi, 6,06 g di Tris 50 e 0,5 ml di Triton X in 800 ml di acqua distillata. Regolare il ph a 7,5 con acido cloridrico concentrato per analisi. Aggiungere 10 g di gelatina e portare il volume a 1 l. 4.2.1.3 Gelatina allo 0,25 % Sciogliere 8,77 g di cloruro di sodio (R), 18,6 g di acido etilendiamminicotetracetico (EDTA) per analisi, 6,06 g di Tris e 0,5 ml di Triton X in 800 ml di acqua distillata. Regolare il ph a 7,5 con acido cloridrico concentrato per analisi. Aggiungere 2,5 g di gelatina e portare il volume a 1 l. 4.2.1.4 Soluzione di anticorpi policlonali in commercio o descritti nell allegato - 10 µl di anticorpi policlonali anti-proteina vegetale q.s.p. 10 ml con la gelatina allo 0,25 % (4.2.1.3) 4.2.1.5 Tampone TBS Sciogliere 29,22 g di cloruro di sodio per analisi e 2.42 g di tris in 1 l di acqua distillata. 4.2.1.6 Tampone fosfatasi alcalina Sciogliere 5,84 g di cloruro di sodio (R), 1,02 g di cloruro di magnesio (R) e 12,11 g di Tris in 800 ml di acqua distillata. Regolare il ph a 9,5 con dell acido cloridrico concentrato per analisi e portare il volume a 1 l. 4.2.1.7 Rivelatore Sciogliere 15 g di bromocloroindolil fosfato (BICP), 30 g di Nitro-blu-tetrazolio (NBT) in 100 ml di tampone fosfatasi alcalina (4.2.1.6). 4.2.2 Modo di operare Dopo l elettroforesi, trasferire le proteine dal gel a una membrana di polivinildene difluoruro mediante eluizione elettroforetica: 16 ore a 4 C a 30 V nel tampone di trasferimento (4.2.1.1). Saturare le membrane con gelatina all 1 % (4.2.1.2) e lavarle 3 volte con gelatina allo 0,25 % (4.2.1.3). La gelatina si fissa sui siti liberi e impedisce l adsorbimento non specifico dei reagenti immunologici. Immergere quindi la membrana in 10 ml di soluzione di anticorpi policlonali antiproteina vegetale (4.2.1.4). Nel caso del glutine, gli anticorpi anti-gliadine sono acquistati. Nel caso dei piselli e del lupino, gli anticorpi sono prodotti secondo il protocollo indicato. Il complesso antigene-igg viene individuato mediante l aggiunta di 10 µl di anticorpi monoclonali di topo anti-igg di coniglio marcati mediante fosfatasi alcalina. Lavare 2 volte le membrane con gelatina allo 0,25 % 5
(4.2.1.3) e una volta col tampone TBS (4.2.1.5). Dopo incubazione nel rivelatore (4.2.1.7), si forma un precipitato di colore viola scuro nel punto si è fissato l enzima. 4.3 ANALISI QUANTITATIVA Per calcolare la quantità d immunoreattività residuale di un vino messo in commercio, viene costruita una curva di riferimento: concentrazioni note di proteina vegetale depositata sul gel (e trasferita su membrana) in funzione delle superfici ottenute mediante integrazione dell intensità degli spot, corrispondente alla formazione degli immunocomplessi. L analisi viene compiuta con la stessa apparecchiatura utilizzata per analizzare i gel di elettroforesi. 6
ALLEGATO Produzione degli anticorpi policlonali anti-piselli Gli anticorpi policlonali anti-piselli necessari alla determinazione della capacità antigenica delle proteine di pisello nei vini e nei mosti trattati, vengono preparati nell animale. 1 PRINCIPIO I sieri contenenti gli anticorpi policlonali si ottengono nel coniglio New Zealand successivamente all iniezione intradermica dell antigene. 2 PROTOCOLLO 2.1 Reagenti 2.1.1 Tampone fosfato PBS ph=7.4: Sciogliere 8 g di NaCl, 200 mg di KCl, 1,73 di Na 2 HPO 4 H 2 O e 200 mg di KH 2 PO 4 in 300 ml di acqua distillata. Regolare il ph a 7,4 con soda 1 M. Portare il volume a 1 l con acqua distillata. 2.1.2 Antigeni: Sciogliere 10 mg di proteina di pisello in 5 ml di tampone fosfato PBS (2.1.1). Quindi filtrare la soluzione sterilmente su 0,2 µm e conservare a 20 C fino al giorno dell immunizzazione. 2.2 Modo di operare Mescolare 1 ml di soluzione 2.1.2. a 1 ml di adiuvante completo di Freund. Iniettare per via intradermica 1 ml di questa miscela in un coniglio New Zealand dal peso di circa 3 kg. Tale iniezione va ripetuta al 15, 30 e 45 giorno. 60 giorni dopo la prima iniezione, prelevare 100µl di sangue a livello di vena auricolare e testare la sua capacità a reagire con gli antigeni. Effettuare tale valutazione mediante immunoblotting come descritto nel capitolo 4.2 del metodo di analisi a partire da un gel sul quale la proteina di pisello è migrata. Dopo la verifica della formazione di un complesso antigene-anticorpo, prelevare 15 ml di sangue a livello della vena auricolare. Il sangue va tenuto a 37 C per 30 minuti. Prelevare il siero contenente gli anticorpi policlonali anti-pisello dopo centrifugazione del sangue a 3000 rpm per 5 minuti. 7