DEL CIRCUITO INTER-LABORATORIO BLUETONGUE-RT-PCR

Istituto G. Caporale Teramo Campo Boario 6 Teramo ITALY Telefono +9-86- Fax +9-86-5 R E P O R T F I N A L E DEL CIRCUITO INTER-LABORATORIO BLUETONGUE-RT-PCR Distribuzione /

. INTRODUZIONE.... CAMPIONI..... PREPARAZIONE..... OMOGENEITÀ E STABILITÀ..... DISTRIBUZIONE.... VALUTAZIONE STATISTICA DEI RISULTATI..... TEST QUANTTATIVO.... TEST QUALITATIVO 6. RISULTATI... 6.. DECODIFICA DEI CAMPIONI INVIATI...6.. METODI IMPIEGATI...7.. STABILITA' ED OMOGENEITA' 7.. RISULTATI TEST QUANITATIVO...7.5. RISULTATI TEST QUALITATIVO..... 5. DISCUSSIONE... ALLEGATO I...

. Introduzione Quindici laboratori hanno aderito al quinto circuito interlaboratorio per la diagnosi virologica della Bluetongue. Ogni laboratorio ha ricevuto campioni di sangue da analizzare con metodo quanti- e/o qualitativo. I campioni di sangue da esaminare sono stati inviati nel mese di gennaio.. Campioni I campioni impiegati per il circuito sono campioni di sangue in EDTA prelevati da animali non infetti... Preparazione I campioni sono stati infettati in laboratorio con ceppi del virus della Bluetongue (BTV) e del virus della malattia emorragica epizootica del cervo (EHDV) previamente titolati ed inattivati. Nello specifico, sono stati utilizzati: ceppo di campo del sierotipo del virus della Bluetongue (BTV), ceppo di campo del sierotipo (BTV), ceppo di campo del sierotipo (BTV), ceppo di campo del sierotipo 8 (BTV8), ceppo di campo del sierotipo 9 (BTV9), ceppo di campo del sierotipo (BTV), ceppo di campo del sierotipo 6 (BTV6), ceppo di campo del sierotipo (BTV), ceppi di campo del sierotipo 6 e del sierotipo 7 dell EHDV, (Tabella ). Dopo infezione la presenza dei virus BTV e EHDV è stata verificata con specifiche RT-PCR. Quattro campioni di sangue sono stati inoculati con terreno di coltura e utilizzati come campioni negativi. Tabella : Informazioni sui ceppi di virus Bluetongue ed EHDV utilizzati per infettare i campioni di sangue impiegati nel circuito interlaboratorio. Progressivo campione Ceppo Titolo (TCID5/ml) BTV 6. BTV 5. BTV 6. BTV 8 5. 5 BTV 8. 6 BTV 8. 7 BTV 9 5. 8 BTV 9. 9 BTV 9. BTV.8 BTV.8 BTV 6. BTV.9 BTV.9 5 EHDV 6 5.6 6 EHDV 7 5.5.. Omogeneità e stabilità Prima dell invio, tutti i campioni infettati sono stati testati per valutare la loro stabilità ed omogeneità. I criteri con cui sono state valutate l omogeneità e la stabilità sono stati descritti

nel protocollo del circuito. L omogeneità è stata valutata testando 8 ripetizioni per ogni livello di positività. I valori trovati, espressi in Cicli soglia (Ct), sono stati confrontati mediante analisi della varianza non parametrica di Kruskal-Wallis. La stabilità è stata invece valutata esaminando aliquote di ciascun campione, sottoposte a stress termici (temperatura ambiente) ed esaminate, a diversi intervalli di tempo (t, t (h), t (8h) t (7h)), mediante RT-PCR. Le differenze dei valori Ct ottenuti dai campioni, esaminati negli intervalli di tempo stabiliti, sono state analizzate mediante regressione lineare... Distribuzione Tutti i laboratori partecipanti hanno ricevuto il pannello di campioni. Ad ogni laboratorio è stato associato un codice numerico così come un identificativo numerico è stato attribuito ad ogni campione inviato. Nei paragrafi successivi è riportata la relativa decodifica. Ad ogni laboratorio partecipante è stato chiesto di testare i campioni per rilevare la presenza di RNA del virus della Bluetongue usando i metodi impiegati nella routine quotidiana. I risultati sono stati comunicati all Istituto organizzatore attraverso la compilazione delle schede predisposte sul sito web dell Istituto G. Caporale Teramo (ICT) (www.izs.it) Circuito interlaboratorio.. Valutazione statistica dei risultati.. Test quantitativo I risultati sono stati valutati attraverso il calcolo del valore di, previa trasformazione logaritmica dei dati: dove : x i = risultato fornito dal laboratorio i-esimo x a = valore assegnato NIQ= intervallo interquartile normalizzato =(Q -Q )*,7 Come nelle precedenti distribuzioni, il valore assegnato, considerato come stima attendibile del valore vero, è stato stabilito dal laboratorio organizzatore. L intervallo interquartile è stato calcolato mediante differenza tra il quartile ed il quartile della distribuzione dei risultati forniti da tutti i laboratori. I laboratori potranno valutare la propria attività secondo i seguenti criteri: z < z < z soddisfacente discutibile insoddisfacente Al fine di valutare la prestazione globale del laboratorio nell'ambito della singola distribuzione, è stato calcolato un indice definito dalla somma dei quadrati dei valori di del singolo laboratorio (SQZ lab ): dove n = numero di campioni analizzati per ciascun laboratorio z i = valore di relativo al campione i-esimo

I limiti di accettabilità della prestazione globale del laboratorio sono definiti mediante confronto con i valori critici di una distribuzione Χ con n gradi di libertà ed α pari a,55 e,7 (valori corrispondenti ad uno di e ). Nella tabella sono riportati i valori limite per il confronto. Tabella : Valori limite per il confronto con il valore di calcolato per ogni singolo campione. n di valori di SQZ (α =,55) SQZ (α =,7) 6,8,89 8,5,56 9,76 6,5 5, 8,5 6,89,6 7,7,86 8 5,789,57 9 7, 5,56 8,6 6,9 9,988 8,5,9,97,69,657,5,95 5 5,5,7 6 6,65 6,6 7 7,95 7,7 8 9, 9,7 9,5,6,798,8 I criteri di valutazione sono i seguenti: SQZ lab SQZ ( =,55; n) SQZ ( =,55; n) SQZ lab SQZ (α =,7; n) SQZ lab SQZ (α =,7; n) soddisfacente discutibile insoddisfacente Inoltre, per verificare la presenza di errori sistematici nei risultati forniti dai laboratori, è stato calcolato l indice RSZ basato sulla somma degli. n RSZ i= lab = dove: n = numero di campioni analizzati per ciascun laboratorio zi = valore di relativo al campione i-esimo I criteri di valutazione sono i seguenti: RSZ soddisfacente < RSZ < discutibile RSZ insoddisfacente z n i 5

.. Test qualitativo Ciascun campione esaminato mediante protocollo RT-PCR convenzionale, protocollo ICT o Kit commerciale è stato valutato dal laboratorio organizzatore come errato o corretto, sulla base dei risultati attesi. E stata quindi stimata la probabilità che il laboratorio fornisca risultati esatti attraverso l impiego di una distribuzione Beta(s+;n-s+): dove s = numero di risultati corretti forniti da ciascun laboratorio n = numero di risultati totali forniti da ciascun laboratorio. Risultati.. Decodifica dei campioni inviati La decodifica dei campioni inviati è riportata nella tabella. Tabella : Decodifica campioni. Identificativo campione 77 9 6 8 5 5 9 5 5 95 85 67 98 6 6 76 79 9 7 87 6 6 7 77 8 6 9 86 7 8 58 75 6 8 9 7 88 7 8 9 5 7 9 69 9 75 9 7 9 7 87 8 8 6 7 68 9 8 88 8 97 88 9 7 6 89 9 96 8 79 7 6 95 55 5 76 9 8 8 99 5 7 9 6 7 8 9 79 6 89 75 9 5 58 8 67 8 6 68 7 8 6 78 5 7 6 8 5 85 5 76 65 87 86 9 6 7 7 85 9 89 8 7 7 8 5 8 96 9 56 8 55 86 69 99 5 5 6 8 57 9 5 99 6 66 8 6 6 6 59 5 9 5 8 59 8 97 57 5 78 5 7 66 9 65 56 7 9 5 9 56 6 66 5 9 5 59 7 6 5 9 6 9 7 7 6 7 5 8 8 7 6 5 7 9 5 8 65 6 9 7 6 5 55 57 5 5 7 98 9 9 6 67 58 5 6 77 78 8 95 68 96 97 7 7 69 8 98 5 6 8 6 5 8 7 6

.. Metodi impiegati I laboratori partecipanti alla quinta distribuzione del circuito interlaboratorio Bluetongue PCR hanno esaminato il pannello di campioni utilizzando il Protocollo ICT, il Kit commerciale e/o il Protocollo PCR convenzionale Il Protocollo ICT, utilizzato nell attività diagnostica dei laboratori, fa riferimento alla procedura emessa dall Istituto G. Caporale Teramo e descritta nella IZS TE B..9 SOP6 Identificazione mediante RT-PCR real-time one-step del virus della Bluetongue. Il Kit commerciale, denominato Kit TaqVet Bluetongue Virus All Genotypes si basa su un metodo RT-PCR real time one-step ed è prodotto dal Laboratoire Service International (LSI) di Lissieu, Francia. Tutti i laboratori partecipanti al ring trial hanno usato il metodo real time per testare il pannello di campioni distribuiti. Sei dei 5 laboratori partecipanti hanno utilizzato il Protocollo PCR convenzionale, un metodo qualitativo che fa riferimento alla procedura IZS TE B..9 SOP5 Ricerca del virus della Bluetongue mediante retrotrascrizione e reazione a catena della polimerasi (RT-PCR) emessa dall ICT. In tabella sono elencati i laboratori e i relativi protocolli diagnostici impiegati. Tabella : Descrizione dei metodi impiegati dai laboratori partecipanti al circuito interlaboratorio Bluetongue PCR. Nome prova ID laboratorio Metodo Procedura Ente/ditta emittente Protocollo ICT / Kit commerciale 58, 6, 6, 65, 67, 68, 69, 77, 78, 8, 9, 59, 69, 68, 68 Real time RT-PCR IZS TE B..9 SOP6 Identificazione mediante RT-PCR real-time onestep del virus della Bluetongue / Kit TaqVet Bluetongue Virus All Genotypes Istituto G.Caporale Teramo / Laboratoire Service International (LSI), Lissieu, Francia Protocollo PCR convenzionale 6, 68, 78, 9, 59, 68. RT-PCR IZS TE B..9 SOP5 Ricerca del virus della Bluetongue mediante retrotrascrizione e reazione a catena della polimerasi (RT-PCR) Istituto G.Caporale Teramo.. Stabilità ed omogeneità I campioni sono risultati omogenei, riscontrando valori concordanti in tutte le ripetizioni eseguite per ogni livello di positività. Dall analisi di regressione per la valutazione della stabilità è stata rilevata una differenza significativa per i campioni (BTV 8) e (BTV 6), tuttavia, considerando che i valori del range (max-min), dei cicli soglia dei due campioni, non superano o superano di poco le unità, li abbiamo ritenuti idonei e li abbiamo inseriti nel pannello (Allegato )... Risultati test quantitativo L analisi dei risultati ottenuti dai laboratori partecipanti per i singoli campioni è riportata nei grafici - mentre i grafici e rappresentano rispettivamente l andamento dell attività complessiva dei laboratori (SQZ) e la valutazione degli errori sistematici (RSZ). 7

Grafico : andamento dei valori di - campione - - - - Grafico : andamento dei valori di - campione - - - - 8

Grafico : andamento dei valori di - campione - - - - Grafico : andamento dei valori di - campione - - - - 9

Grafico 5: andamento dei valori di - campione 5 - - - - Grafico 6: andamento dei valori di - campione 6 - - - -

Grafico 7: andamento dei valori di - campione 7 - - - - Grafico 8: andamento dei valori di - campione 8 5 - - - -

Grafico 9: andamento dei valori di - campione 9 - - - - Grafico : andamento dei valori di - campione - - - -

Grafico : andamento dei valori di - campione - - - - Grafico : andamento dei valori di - campione 5 - - - -

Grafico : andamento dei valori di - campione - - - - Grafico : andamento dei valori di - campione - - - -

Grafico 5: andamento dei valori di - campione 5 - - - - Grafico 6: andamento dei valori di - campione6 - - - - 5

Grafico 7: andamento dei valori di - campione 7 - - - - Grafico 8: andamento dei valori di - campione 8 - - - - 6

Grafico 9: andamento dei valori di - campione 9 - - - - -5 Grafico : andamento dei valori di - campione - - - - 7

Utilizzando il metodo real time RT-PCR, laboratori su 5 hanno correttamente individuato i campioni del pannello in esame. Il laboratorio 67 non è stato in grado di rilevare l RNA virale del ceppo BTV (campione n 6, titolo virale.9 TCID5/ml) mentre il laboratorio 68 non è stato in grado di rilevare RNA virale del ceppo BTV9 (campione n 6, titolo virale. TCID5/ml) ed ha identificato come positivo un campione di sangue negativo per BTV (campione n 97). Grafico : valutazione dell'attività complessiva dei laboratori (SQZ) SQZ,,, 9, 8, 7, 6, 5,,,,,, Grafico : valutazione della presenza di errori sistematici (RSZ) 6,,,, 8, RSZ 6,,,, -, 69 65 59 58 77 68 67 6 68 9 6 68 78 8 69 -, -6, 8

Nell'ambito della singola distribuzione, la prestazione globale (SQZ) è stata soddisfacente per 8 laboratori, discutibile per i laboratori 6, 8 e 59 mentre insoddisfacente per i laboratori 67, 78, 69 e 68. Per quel che concerne la presenza di errori sistematici (RSZ), 9 laboratori hanno ottenuto risultati soddisfacenti, (65, 68 e 78) discutibili e (69, 8 e 69) insoddisfacenti. Nella tabella 5 è riportata la stima della percentuale di risultati corretti ottenuta da ciascun laboratorio utilizzando il metodo real time RT-PCR. Tabella 5: Risultati ottenuti dai laboratori impiegando il metodo real time RT-PCR per rilevare presenza di RNA virale del virus della Bluetongue nel pannello di campioni di sangue distribuito. Identificativo laboratorio esaminati corretti errati l.c.i. 95% l.c.s. 95% 58 86,7% % 6 86,7% % 6 86,7% % 65 86,7% % 67 9 76,% 98,8% 68 86,7% % 69 86,7% % 77 86,7% % 78 86,7% % 8 86,7% % 9 86,7% % 59 86,7% % 69 86,7% % 68 86,7% % 68 8 69,6% 97,% l.c.s. 95%: limite superiore intervallo di confidenza al 95% l.c.i. 95%: limite inferiore intervallo di confidenza al 95% 9

Il grafico riporta la stima della percentuale di risultati corretti individuati dai 5 laboratori partecipanti. Grafico : Distribuzioni delle percentuali di risultati corretti real time RT-PCR 7% 6% 5% probabilità % % % % % % % % % % 5% 6% 7% 8% 9% % stima della percentuale di risultati corretti n risultati corretti = 8 9.5. Risultati test qualitativo Nella tabella 6 è riportata la stima della percentuale di risultati corretti ottenuta da ciascun laboratorio utilizzando il Protocollo PCR convenzionale. Tabella 6: Risultati ottenuti dai laboratori impiegando il protocollo PCR convenzionale per rilevare presenza di RNA virale del virus della Bluetongue nel pannello di campioni di sangue distribuito. Identificativo Campioni laboratorio esaminati Risultati corretti Risultati errati l.c.i. 95% l.c.s. 95% 6 86,7% % 68 8 69,6% 97% 78 86,7% % 9 86,7% % 59 7 6,7% 95% 68 6 58,% 9% l.c.s. 95%: limite superiore intervallo di confidenza al 95% l.c.i. 95%: limite inferiore intervallo di confidenza al 95%

Il grafico riporta la stima della percentuale di risultati corretti individuati dai 6 laboratori partecipanti Grafico : Distribuzioni delle percentuali di risultati corretti RT-PCR convenzionale 7% 6% 5% probabilità % % % % % % % % % % 5% 6% 7% 8% 9% % stima della percentuale di risultati corretti n risultati corretti = 6 7 8 Dei 6 laboratori che hanno utilizzato il Protocollo PCR convenzionale, laboratori (6, 78 e 9) hanno rilevato correttamente i campioni esaminati. Il laboratorio 68 non ha rilevato RNA virale del ceppo BTV9 in due campioni di sangue (campione n 9, titolo virale. TCID5/ml e campione n, titolo virale. TCID5/ml), Il laboratorio 59 non ha rilevato RNA virale del ceppo BTV9 in tre campioni di sangue (campione, titolo virale. TCID5/ml; campione n 7, titolo virale. TCID5/ml e campione n 5, titolo virale 5. TCID5/ml), Il laboratorio 68 non ha rilevato RNA virale del ceppo BTV8 (campione n 9, titolo virale. TCID5/ml), del ceppo BTV9 (campione n 6, titolo virale. TCID5/ml), del ceppo BTV6 (campione n, titolo virale. TCID5/ml) e un campione di sangue negativo è stato rilevato positivo per BTV (campione n 97).

5. Discussione Alla quinta edizione del circuito interlaboratorio Bluetongue RT-PCR hanno partecipato Istituti Zooprofilattici Sperimentali e un Istituto di Ricerca straniero. Tutti i laboratori hanno testato i campioni con il metodo Real time RT-PCR (Protocollo ICT / Kit commerciale), sei hanno utilizzato anche il saggio convenzionale della RT-PCR (Protocollo PCR convenzionale) (Tabella ). Nel complesso quasi tutti i laboratori che hanno utilizzato il metodo Real time RT-PCR sono stati in grado di rilevare correttamente i ceppi di BTV presenti nei campioni di sangue distribuiti. Due laboratori non hanno rilevato la presenza dei ceppi BTV9 (laboratorio 68, titolo virale. TCID5/ml) e BTV (laboratorio 67, titolo virale.9 TCID5/ml) nei campioni di sangue. Il laboratorio 68 ha inoltre identificato come positivo un campione di sangue negativo. In altri due laboratori (67 e 69) alcuni campioni (laboratorio 67: BTV9, titolo virale. TCID5/ml e BTV, titolo virale.8 TCID5/ml; laboratorio 69: BTV9, titolo virale. TCID5/ml), pur essendo stati correttamente classificati come positivi, hanno ottenuto valori di Ct superiori alla soglia che discrimina i campioni positivi (Protocollo ICT). Nel test quantitativo l analisi dei valori RSZ ha evidenziato diversi risultati discutibili o insoddisfacenti. L RSZ come già detto, rileva la presenza di errori sistemici. Alcuni laboratori (68, 78, 8 e 69) hanno ottenuto valori di Ct costantemente al di sopra di quelli attesi. Sebbene non abbia inficiato il buon esito della prova interlaboratorio, la sovrastima dei valori Ct tuttavia denota un problema di sensibilità latente che potrebbe determinare errori diagnostici nel caso in cui siano analizzati campioni contenenti basse concentrazioni virali. Dei laboratori che hanno sovrastimato i valori di Ct uno (8) ha utilizzato il trizol nella fase di estrazione. Il trizol è costituito da una soluzione monofasica di fenolo e guanidina isotiocianato in grado di inibire irreversibilmente le ribonucleasi e di lisare le cellule. E indubbiamente efficace in una RT-PCR convenzionale, ma non lo è in un metodo real time in quanto può dare problemi di inibizione o sovrastima. L impiego del Trizol potrebbe spiegare anche i valori più elevati di Ct e il mancato rilevamento dell RNA del BTV9 evidenziato dal laboratorio 68 che ha anch esso utilizzato il trizol nell estrazione dell acido nucleico. La fase di estrazione dell RNA del virus della Bluetongue, a causa del forte legame che il virus stabilisce con la membrana eritrocitaria, costituisce il punto più critico della metodica PCR. Come già ribadito nella precedente edizione del circuito interlaboratorio, l utilizzo di un controllo di processo costituito da RNA esogeno, da addizionare al campione durante la fase di estrazione dell acido nucleico, consente di verificare l efficienza del processo estrattivo e di tutte le altre fasi della PCR. Nella presente edizione a parte il laboratorio 65 tutti hanno utilizzato il controllo di processo. Dei sei laboratori che hanno analizzato il pannello di campioni di sangue con il Protocollo PCR convenzionale, tre (6, 78 e 9) hanno rilevato correttamente i campioni esaminati, mentre gli altri (68, 59 e 68) non sono stati in grado di rilevare RNA virale dei ceppi BTV8 (laboratorio 68, titolo virale. TCID5/ml), BTV9 (laboratorio 68, titolo virale. TCID5/ml e. TCID5/ml; laboratorio 59, titolo virale. TCID5/ml,. TCID5/ml e 5. TCID5/ml; laboratorio 68, titolo virale. TCID5/ml) e BTV6 (laboratorio 68, titolo virale. TCID5/ml). Per il sierotipo BTV9, già in passato, il Protocollo PCR convenzionale aveva evidenziato problemi di sensibilità. Nel caso in cui si voglia usare la metodica convenzionale, è bene tener presente questo limite. I risultati del laboratorio 68, oltre ai già citati problemi di sensibilità, evidenziano problemi più gravi visto che ha erroneamente considerato positivo un campione negativo. E richiesta pertanto una maggior attenzione e un miglior controllo delle fasi del processo.

ALLEGATO Tabella : Analisi per la valutazione dell omogeneità. Identificativo Variazione tra I media dev.st. min. max. CV T campione campioni g.d.l.,79,56,9,9,,, 7,7,8,55 5,8,,,5 7,,5 9,9,9,,5, 7,9,7, 5,57,,, 7 5 7,6,9 5,67 8,9,,,5 7 6,,76,,5,,, 7 7 5,7,8,7 7,9,,8, 7 8 9,57,86 7,9,76,,, 7 9 5,58,98 9,7 7,69,6,5, 7 9,6,8 7,6 6,76,8,, 7,9,8 6,76,,6,8,5 7 8,7, 6,9,8,7,6,7 7 8,6, 6,96,7,,, 7,96,9 9,8 7,69,,5,6 7 5 5 5 5 7 6 5 5 5 7 7 5 5 5 7 8 5 5 5 7 9 5 5 5 7 5 5 5 7 Tabella : Analisi di regressione per la valutazione della stabilità. Campione Max min Range (Max-min) Equazione retta regressione Valore di t coefficiente angolare Significatività,9,9,99,5+,7*t,7,9 5,8,55,6,6+,8*t,8,8,9 9,9,65 9,99+,6*t,6,69 5,57,,6,68+,*t, <, 5 8,9 5,67, 7,5+,7*t,7,5 6,5,,,97+,*t,,8 7 7,9,7,9 5,86+,*t,, 8,76 8,6,6 9,9-,5*t,5,7 9 7,69 5,7,6 5,85+,9*t,9,5,8 7,6,9 8,8+,6*t,6,59,8 6,76 7,6,+,*t,,978 9,7 6,9, 6,99+,*t,,,7 6,96, 8,6+,9*t,9,8,5 8,5 5,98,88+,7*t,7,68 5 5, 5,, 5,+,*t, - 6 5, 5,, 5,+,*t, - 7 5, 5,, 5,+,*t, - 8 5, 5,, 5,+,*t, - 9 5, 5,, 5,+,*t, - 5, 5,, 5,+,*t, -