Cellule staminali e cellule staminali tumorali. Da quali cellule origina il tumore?

Cellule staminali e cellule staminali tumorali Da quali cellule origina il tumore?

Cellule staminali Sono cellule che hanno la capacitá di perpetuarsi indefinitamente ( self-renewal ) Attraverso il differenziamento, esse danno vita alle cellule mature Tutte le cellule differenziate originano presumibilmente dalle cellule staminali del medesimo compartimento Plasticitá delle cellule staminali: apparentemente, le cellule staminali di un tessuto possono dare origine anche a cellule mature di altri tessuti

Cellule staminali e cellule tumorali Il tumore è costituito da cellule con una capacità di self-renewal indefinita La comprensione dei meccanismi di self-renewal delle cellule staminali puó aiutarci a comprendere il tumore

Pathway coinvolti nel selfrenewal e nell oncogenesi Ipotesi: le cellule tumorali -capaci di selfrenewal- utilizzano la machinery presente nelle cellule staminali Dimostrazione indiretta di tale ipotesi é il fatto che diversi pathway associati all oncogenesi sono stati coinvolti nel selfrenewal delle cellule staminali

I pathway di Notch, Shh, Wnt Notch: l attivazione di questo pathway é associata ad un aumento del pool delle cellule staminali Shh: popolazioni arricchite di cellule staminali umane rispondono in vitro a Shh con un aumentato self-renewal Wnt: la sua attivazione espande il pool di cellule staminali, mentre la sua soppressione inibisce la proliferazione delle cellule staminali

Rules of Normal Tissue Growth Symmetric cell division Asymmetric cell division Stem cells divide asymmetrically Non-stem cells divide symmetrically Note: this is a general statement, we will be more accurate later

Rules of Normal Tissue Growth 2 1 3 Stem cells self renew--?immortal non-stem cells have finite life span

Traditional View of Tumor Growth 2 1 3 Rules: 1.) Tumors are clonal starts in a single cell 2.) All tumor cells have infinite lifespan 3.) All tumor cells divide symmetrically 30 cell divisions = 1 billion cells = 1 cm tumor

Predictions of clonal tumor heterogeneity model

Non-stem tumor model: every cell in a tumor should initiate a new tumor

Experiments showed that very rare cells in a tumor can transplant a new tumor: Tumor Stem Cells

Origin of the Theory of Cancer Stem Cells Only a small subset of cancer cells is capable of extensive proliferation Liquid Tumors In vitro colony forming assays: - 1 in 10,000 to 1 in 100 mouse myeloma cells obtained from ascites could form colonies In vivo transplantation assays: - Only 1-4% of transplanted leukaemic cells could form spleen colonies Solid Tumors - A large number of cells are required to grow tumors in xenograft models - 1 in 1,000 to 1 in 5,000 lung cancer, neuroblastoma cells, ovarian cancer cells, or breast cancer cell from cell lines can form colonies in soft agar or in vivo (fewer with 1 0 tumor cells)

Tumor growth is similar to normal tissue growth Normal Tissues Tumor Adult stem cell = undifferentiated Transit amplifying cell Tumor stem cell = tumorigenic Non-tumorigenic cell Normal differentiated cell

Cellule staminali tumorali: organogenesi aberrante Il tumore puó essere immaginato come un organo aberrante originato da una cellula trasformata che ha acquisito la capacitá di proliferare indefinitamente attraverso varie mutazioni La popolazione tumorale é eterogenea, e spesso contiene cellule a diversi stadi di differenziamento (seppure anomali): data la clonalitá dei tumori, questo dato implica che la progenie delle cellule tumorali si diversifica ( differenzia )

Evidenze per la presenza di cellule staminali tumorali

Hematopoietic Stem Cells Stem Cells Multipotent Progenitors Oligolineage Progenitors Mature Cells CD34- CD38+ CD20+ CD8+ CD8+ CD34+ CD38- CD34- CD38- CD4+ CD4+ CD36+ CD35+ Reya et al. 2001 Nature 414:105-111

Cellule staminali ematopoietiche Le cellule caratterizzate con maggiore precisione, grazie ad esperimenti di ripopolamento di topi letalmente irradiati e ricostituiti con popolazioni cellulari altamente purificate a partire dal midollo osseo Le cellule staminali (0.05% delle cellule totali del midollo) danno origine ai progenitori ematopoietici che perdono il loro potenziale di self-renewal

Self-renewal Assay in NOD/SCID Mice (Non-obese diabetic/severe combined immunodeficiency) Cancer Cells ex: Leukaemia cells FACS Cell Sorter CD34 Expression CD38 Expression Sublethally irradiated NOD/SCID Mice

Leukaemia stem cells exist in human acute myeloid leukaemia (AML) CD34+/ CD38- LEUKAEMIA Leukaemic blasts from AML patients CD34+/ CD38+ NO LEUKAEMIA John Dick and Dominique Bonnett

Leukaemia is arranged as a hierarchy similar to normal haematopoiesis LEUKAEMIA CD34+/ CD38- NORMAL HSC Leukaemogenic events Bulk leukaemia cells (CD34+/CD38- and other cells) lymphoid progenitor myeloid progenitor Block terminal differentiation John Dick and Dominique Bonnett B-cell T-cell Erythrocyte Platelet Monocyte Granulocyte

Le cellule staminali tumorali come meccanismo di mantenimento del tumore 1. Isolamento di sub-popolazioni cellulari con marcatori di superficie caratteristici delle SC normali (CD34+CD38-), o di cellule piú differenziate, da blasti leucemici di pazienti affetti da varie forme di leucemia mieloide acuta 2. Reinoculo di queste cellule in topi NOD/SCID ed analisi della loro capacitá leuchemogenica 3. Mentre le cellule CD34+38- sono leuchemogeniche, quelle CD34+CD38+ non possono trasferire la leucemia nell animale immunocompromesso 4. Le cellule tumorali non sono tutte uguali, e le CSC sono responsabili del mantenimento della massa tumorale

Evidenze da altri tumori tumori solidi: tumori CNS (CD133+) tumori mammari

Self-renewal Assay in NOD/SCID Mice For solid tumors: surgical orthotopic implantation (SOI) Solid Tumor Single Cell Suspension FACS Cell Sorter CD44 Expression CD24 Expression Mince (small pieces) Surgical Implantation

CD 44 staining of breast cancer model T. A. Ince 2001

Breast Cancer Stem Cells: CD44 + CD24 low Lin - B38.1 + ESA + CD44 and CD24 adhesion molecules B38.1 breast/ovarian cancer-specific marker ESA epithelial specific antigen Al-Hajj (2003) PNAS 100, 3983

Biological characterization of WT and ErbB2 Mammospheres 1. Are Clonal in origin 2. Grow serially (self-renewal) 3. Contain SCs Transplantation into the cleared fat pad of syngenic mice: WT mammospheres form a normal breast tissue ErbB2 mammospheres form tumors cell n. wt (FVB) ErbB2 100000 5/5 4/4 10000 11/11 2/2 1000 6/6 6/6

18 Analysis of the replicative potential of Normal and Tumor mammospheres: (serial growth) WT 18 sphere number 12 6 0 1 2 3 4 5 6 passages 12 decrease in number during passages (limited lifespan) 6 0 cumulative sphere number

sphere number 18 12 6 0 Analysis of the replicative potential of Normal and Tumor mammospheres: (serial growth) WT 1 2 3 4 5 6 passages 18 12 decrease in number during passages (limited lifespan) 6 0 cumulative sphere number sphere number 240 160 80 0 ErbB2 1 2 3 4 5 6 passages 45000 30000 15000 increase in number during passages (near-immortal) 0 cumulative sphere number

sphere number 18 12 6 0 Analysis of the replicative potential of Normal and Tumor mammospheres: (serial growth) WT 1 2 3 4 5 6 passages 18 12 decrease in number during passages (limited lifespan) 6 0 cumulative sphere number sphere number 240 160 80 0 ErbB2 1 2 3 4 5 6 passages 45000 30000 15000 increase in number during passages (near-immortal) 0 cumulative sphere number 1,E+05 10 5 cumulative sphere number 1,E+04 1,E+03 10 3 1,E+02 1,E+01 10 1 1,E+00 1,E-01 10-1 WT 1,E-02 1 3 5 passages ErbB2 R 2: 0,98 502% decrease R 2: 0,99 64% decrease ErbB2 : fixed increase at every passage (502%) (exponential curves) WT : fixed decrease at every passage (64%)

Stem Cell divisions permit generation of more SCs ( self-renewal ) and production of cells that differentiate 1.Asymmetric cell division Mechanisms: SC Pr. 1. Asymmetric localizzation of cell polarity (PINS and apkc) and cell fate determinants (Numb and Prospero) SC Each SC divides to generate one daughter with SC fate and one that differentiates (progenitror) 2. Asymmetric placement of daughter cells relative to the stem cell niche This strategy leaves stem cells unable to expand in number

2. Symmetric cell division Pr. Each SC divides to generate daughter cells that are destined to acquire the same fate SC SC SC SC Limited data available on the modes of division of mammalian SCs: 1. Some mammalian SCs use conserved mechanism to divide asymmetrically; 2. Mammalian SCs can expand in number during development (HSCs, Neural and Epidermal SCs) or after injury (neural SCs after stroke or HSCs after chemotherapy).

TIME LAPSE IMAGING OF PKH+ CELLS Type I: 1, 2, 3, 4/5 cells with clear identification of ONE nonreplicating cell * * * Asymmetric Division Type II: 1, 2, 4, 6/8 cells with ALL cells that replicate * * * * * * Symmetric Division

Increased frequency of Symmetric Divisions in erbb2 PKH+ cells WT ErbB2 Uncertain 33,3% Symmetric 7,2% Asymmetric 59,5% Uncertain Asymmetric 11,5% 10,3% Symmetric 78,2%

In sostanza Le cellule staminali normali sono in larga parte quiescenti, dopo aver originato le prime cellule progenitrici Le cellule staminali tumorali tendono ad avere un numero maggiore di divisioni simmetriche, portando ad una loro progressiva espansione

Therapeutic predictions of tumor stem cell model Tumor stem cells Non-tumorigenic cells

Therapeutic predictions of tumor stem cell model rapid growing cells killed tumor grows back kill stem cells tumor degenerates

Therapeutic implications of Cancer Stem Cells Hypothesis: -Most therapies (chemotherapy and radiation) target rapidly proliferating, non-tumorigenic cells and spare the relatively quiescent cancer stem cells -Cell surface pumps -Cancer stem cells have greater invasive and migratory properties and can home to specific tissue niches

Domanda fondamentale È sufficiente attaccare esclusivamente le CSC? Nessuno ha finora dimostrato che l'incapacità di self-renewal delle CSC sia sufficiente ad impedire lo sviluppo di un tumore

Nuovi risultati e incertezze I dati di maggiore rilevanza a supporto della teoria delle CSC derivano da xenotrapianti di cellule tumorali umane in topi immunocompromessi Molto recentemente è apparso un lavoro molto importante sulla caratterizzazione delle CSC nel melanoma, dove emerge che: almeno in questo tumore, il numero di cellule con caratteristiche di CSC è altissimo (se si accettano alcune assunzioni, si arriva quasi al 100% delle cellule): se tutte le cellule sono CSC, le CSC non esistono i protocolli sperimentali per gli xenotrapianti possono influenzare l attecchimento di determinate sottopopolazioni

Importanza del topo ricevente e delle condizioni sperimentali

I melanomi possono iniziare a partire da una singola cellula

Ulteriori considerazioni Secondo alcuni autori, il tumore che si sviluppa nei topi NSG non fenocopia (cioè non ha le stesse caratteristiche molecolari) il tumore del paziente, per cui I risultati ottenuti nei topi NSG non sono rappresentativi del reale potenziale staminale del tumore Nei topi NOD-SCID, invece, il tumore (che si origina solo da sottopopolazioni specifiche che definiamo cancer stem cell) fenocopia correttamente

Ci sono modelli complementari/ alternativi? Plasticità fenotipica: non c è una vera e propria gerarchia (staminale->non-staminale), ma diversi stati cellulari determinati dalle condizioni ambientali (microambiente e segnali) La stessa cellula può assumere reversibilmente morfologia diversa, espressione di diversi pattern trascrizionali e non di mutazioni irreversibili, manifestando nei suoi diversi fenotipi una maggiore o minore propensione alla staminalità

Acute Promyelocytic Leukemia (APL) A1 A3 A2 Stem Lineage B Promyelocytes 1 2 3 4 PML Chr 15 RAR Chr 17 PML RAR t(15;17) LEUKEMIC CELL

Mouse Model systems Hematopoietic precursors E x p r e s s i o n o f A M L - a s s o c i a t e d f u s i o n p r o t e i n s ( I n f e c t i o n w i t h r e t r o v i r u s e s e x p r e s s i n g G F P - f u s i o n p r o t e i n s o r f u s i o n p r o t e i n s a n d G F P ) Treatment Leukemia The image cannot be displayed. Your computer may not have enough memory to open the image, or the GFP-Sorting of infected cells 900R R e c o n s t i t u t i o n ( r e c i p i e n t m i c e ) + G-CSF, GM-CSF L e t h a l i r r a d i a t i o n (recipient( r e c i p i e n t m mice)" i c e ) D i f f e r e n t a t i o n a s s a y ( l i q u i d c u l t u r e o r s e m i s o l i d m e d i u m ) S u r v i v a l a s s a y (X-rays, oxidative stress, etc.)"

PML-RAR is responsible for the pathogenesis of the disease and the response to RA Hematopoietic precursors (Lin-) Hematopoietic precursors homogenously expressing PML-RAR (retroviral gene transfer) In vitro In vivo Survival assays (X-rays, oxidative stress, etc.) Differentiation assays (liquid culture or semisolid medium) Increased survival Differentiation block RA-sensitive leukemias

Leukemogenesis is a mul.- stage process 100 Leukemia-free survival (%) 80 60 40 20 100 200 300 Time (days)

Myeloid differentiation" Which is the target cell in APL?

More than one target cell

Survival, long term reconstitution Survival, no long term reconstitution Death

PML- RAR bestows radioprotec.on

PML-RAR leads to re-programming of its target cells to HSCs