Modulo 4 Una proteina in azione
Mioglobina ed emoglobina: un esempio di funzionamento di una proteina La funzione della maggior parte della proteine globulari è mediata dall interazione reversibile con altre molecole dette ligandi: piccole molecole ma anche altre macromolecole. Il sito in cui avviene il contatto con il ligando: sito di legame: è complementare al ligando stesso per dimensione, forma, carica, e carattere idrofilico o idrofobico. Rende il legame specifico. La mioglobina (Mb) e l emoglobina (Hb): proteine cruciali nella conversione dalla vita anaerobica a quella aerobica. L ossigeno (O 2 ) ha una bassa solubilità in acqua (sangue = 3ml/L). E necessaria una via per legare l ossigeno e trasportarlo in sufficiente quantità ai tessuti. Proteine come la mioglobina e l emoglobina si sono evolute a questo fondamentale scopo.
La mioglobina è la proteina che lega l ossigeno nei muscoli. Proteina globulare, compatta, singola catena,153 amminoacidi Mw 16,700. Mb composta in gran parte da α-elica (8 eliche) indicate con le lettere A- H e da regioni non elicoidali. 2 forme: deossimioglobina e ossimioglobina: questa lega O 2 Legame all O 2 : presenza di un gruppo prostetico detto eme covalentemente legato alla proteina racchiuso in una profonda infossatura tra le eliche con accessibilità limitata al solvente. Presente nei muscoli dei vertebrati, abbondante nei mammiferi marini (foche, balene) che consente loro di immagazzinare ossigeno da usare durante le immersioni.
Il legame all O 2 avviene tramite l eme Legame dell O 2 a Mb avviene su Fe 2+ : provoca un cambiamento conformazionale dell eme e della proteina: Il Fe si sposta verso il piano dell eme. Eme: 1. parte organica, porfirine: composti macrociclici con 4 anelli pirrolici uniti da ponti CH. Hb e Mb hanno la protoporfirina IX. (protoporfirina IX + Fe = Eme) 2. atomo di Fe2+: legato al centro della porfirina 0,4 Å sopra il piano porfirinico. Legami del Fe: 4 legami di coordinazione con 4 N pirrolici, il quinto legame si forma col l istidina F8 (istidina prossimale) della Mb. Il sesto è libero o occupato dall ossigeno. L ossigeno si lega all eme solo La struttura che si forma è descritta dalla combinazione di due strutture di risonanza:
Ragione funzionale della parte globinica l Ossigeno rilasciato deve essere allo stato O 2 e non come anione superossido (tossico), Fe deve rimanere allo stato ferroso (Fe 2+ ) Mb che contiene Fe 3+ (metamioglobina) non è più in grado di legare l ossigeno. Funzione della parte proteica: Mb stabilizza il complesso con l ossigeno in modo da rilasciare O 2 ed evitando l ossidazione del Fe..His E7 (istidina distale) forma un legame H con la forma di superossido dell ossigeno. Svolge un ruolo protettivo fondamentale dall ossidazione. La CO si lega al ferro eminico in competizione con l O 2. Quando l eme è contenuto nella mioglobina, l affinità per CO diminuisce di 100 volte Il legame del CO non è ottimale per l ingombro sterico dovuto alla HisE7,, il legame dell O 2 che forma un angolo di 120 con il piano dell eme, non viene influenzato sfavorevolmente all interno della proteina.
Curva di saturazione (legame, ossigenazione) dell ossigeno alla mioglobina Il legame reversibile dell O 2 alla mioglobina, può essere descritto dall equilibrio: Y = MbO 2 Mb + O 2 Siti di legame occupati Totale dei siti di legame La K d di equilibrio (dissociazione) della ossi Mb: Definiamo come Y (saturazione frazionale) il rapporto: Y = [ MbO ] 2 [ ] + [ ] MbO 2 Mb Con 0<Y<1 K d = [ Mb ][ O ] 2 [ ] MbO 2 (1) Ricavando [MbO 2 ] dall equazione 1 si ottiene: Y = Y = [ O ] 2 [ ] + Kd O 2 po po + 2 2 K d [O 2 ] trattandosi di gas può essere espresso come po 2 (pressione parziale dell O) si ottiene: Equazione iperbole rettangolare Curva di legame dell O 2 alla mioglobina P50 = valore di po 2 al quale Y= 0,5 (50% di saturazione). 1 Torr = 1 mmhg
Le subunità dell emoglobina sono strutturalmente simili alla mioglobina Quasi tutto l ossigeno presente nei vertebrati è legato e trasportato dall emoglobina Hb negli eritrociti (gl rossi) costituisce > 30% del peso. Struttura 2 2 Hb: Mw 64500 4 catene a due a due uguali: 2 α e 2 β: coppia di dimeri identici (α1β1, α2β2) giustapposti. Catene α β sono simili tra loro. Con struttura tridimensionale simile Presenza di 4 eme. Interazioni molto forti coinvolgono i dimeri α1β1, α2β2. altre interazioni interessano i contatti α1β2 e α2β1. Non ci sono interazioni che coinvolgano le catene dello stesso tipo. I gruppi eme sono distanziati di 30-40 A
Il ripiegamento globinico è conservato Allineamento tra le catene α e β della Hb con sequenza della Mb: 25% di identità La struttura tridimensionale è simile: prende il nome di ripiegamento globinico (figura in basso) Le 2 catene α e 2 catene β sono correlate evolutivamente tra loro. I residui cruciali sono tutti conservati. L emoglobina è una molecola molto più complessa e sensibile della mioglobina
La curva di legame dell Hb è differente da quella della Mb La curva di legame dell Hb ha una forma sigmoide, quella della Mb è una iperbole. P50 = valore di po 2 alla quale Y= 0,5 (50% di saturazione). L emoglobina (Hb) è una molecola molto più complessa e sensibile a fattori esterni della mioglobina P50 di Mb è sempre << della P50 di HB HB lega l O 2 con minor affinità rispetto allamb. Curva sigmoide: a basse po2 bassa affinità, ad elevate po2 affinità aumenta. suggerisce che le reazioni dei legame ai 4 siti di legame non sono tra loro indipendenti: effetto cooperativo.
Significato fisiologico della cooperatività Livelli di saturazione: Hb: Polmoni 98% Tessuti 32% % siti di legame che contribuiscono al trasporto dell O 2 : 98-32=66% Hb senza cooperatività: 63-25= 38% Mb: 98-91= 7% La cooperatività tra i siti di legame rende più efficiente il trasporto dell ossigeno
Cambiamenti strutturali dell Hb in seguito alla ossigenazione L analisi strutturale evidenzia: due conformazioni alternative: stato R e stato T. In equilibrio tra loro. O 2 si lega ad entrambe ma con > affinità per R e stabilizza lo stato R. La transizione tra la forma T a R dipende dalle interazioni α1β2 e α2β1 tra le diverse subunità. Conformazione tesa (tense, T) favorita nella deossiemoglobina Conformazione rilassata (relaxed, R) favorita nella ossiemoglobina (forma totalmente ossigenata)
Effetto del legame dell O 2 all eme di una subunità Il movimento del Fe 2+ in seguito al legame di un 0 2 porta l His F8 verso il piano porfirinico. HisF8 parte dell elica F si muove di conseguenza. Il C-terminale dell elica giace all interfaccia di un dimero αβ. La transizione strutturale iniziata sullo ione ferroso si propaga alle altre subunità. Blue: deossihb, rosso ossihb. Il riarrangiamento dell interfaccia tra dimeri è un sistema in grado di far comunicare le diverse subunità rendendo cooperativo il legame dell ossigeno.
Variazioni conformazionali del legame dell ossigeno ad una subunità di emoglobina
Affinità (P 50 ) di differenti Hb per l ossigeno P 50 misura convenzionale dell affinità dell Hb per l ossigeno P 50 = po 2 tale che Y=1/2 (50% saturazione) Y O 2 P O 2 (mmhg) Curva di dissociazione dell Hb che mostra l affinità relativa per O 2 in differenti specie di vertebrati ed invertebrati. Le differenti P50 dipendono da variazioni della struttura. (1kPa = 7,5 mmhg)
Capacità di trasporto dell ossigeno Il contenuto di ossigeno nel sangue (quantità di pigmento) in funzione della pressione parziale di O 2 rivela differenze sia nella forma della curva (affinità) sia nella capacità complessiva di trasporto dell ossigeno tra gli animali 1kPa = 7,5 mmhg Gruppo animale Pigmento resp. ml O 2 100 ml -1 Acqua 0.6 Molluschi Hc 1-4 Crostacei Hb, Hc 1-4 Teleostei Hb 4-20 Uccelli Hb 10-22 Mammiferi Hb 14-32 Capacità massima di trasporto dell ossigeno nel sangue (100 ml) di diversi animali
L affinità per l ossigeno viene modulata da regolatori: il 2,3 BPG Il 2,3 bisfosfoglicerato (2,3BPG), contenuto nei globuli rossi ad una concentrazione pari alla Hb (2 mm) stabilizza la forma T dell emoglobina: determina > rilascio di O 2 a livello tissutale. Si lega al centro del tetramero tra due subunità β in una tasca presente solo nella forma T presso un sito distinto da quello dell O 2. È un regolatore allosterico dell emoglobina.
Regolazione allosterica Regolatore allosterico (effettore allosterico): molecola che si lega alla proteina (ligando) in un sito diverso dal sito attivo: sito allosterici Il regolatore allosterico può essere un attivatore o un inibitore
Gli ioni idrogeno e la CO 2 promuovono il rilascio di O 2 H + e CO 2 sono effettori allosterici che regolano affinità per O 2 si legano all emoglobina presso siti distinti da quello dell O 2. I tessuti a rapido metabolismo producono H + e CO 2. L affinità di Hb per O 2 diminuisce al diminuire del ph determinando nei tessuti un maggior rilascio di ossigeno (77%). Significato biologico: L Hb rilascia maggiori quantità di ossigeno dove c e ne più bisogno (Effetto Bohr).
Meccanismo molecolare dell effetto Bohr A livello molecolare i responsabili dell effetto Bohr sono principalmente: alcuni grippi amminici terminali delle catene α, alcuni residui di istidina con valori di pka ~ 7 il cui livello di dissociazione dipende dal ph. Caso in figura: nella deossiemoglobina His146 forma due legami ionici, di cui quello con Asp 94 avviene solo se His è protonato. Queste interazioni ioniche stabilizzano lo stato T. A ph maggiori His 146 si deprotona ed il legame non si forma favorendo la forma R. Coinvolgimento della His146 nell effetto Bohr
L emoglobina ha un ruolo nel trasporto della CO 2 La CO 2 prodotta nei tessuti viene trasportata: 1) Come ione HCO 3 - disciolto. Provoca una diminuzione del ph (effetto Bohr). 2. Una parte è legata covalentemente all emoglobina (circa 15%). La CO 2 reagisce con le catene amminoterminali: forma residui di carbammato. L anidrasi carbonica del globulo rosso accelera il processo di conversione della CO 2 a H 2 CO 3 e quindi HCO 3 + H + ph 7,4 no CO 2 ph 7,2 no CO 2 ph 7,2 CO 2 40 Torr
Emocianine, proteine respiratorie di molluschi e artropodi. Emocianine trasportano ossigeno nel sangue (non nelle cellule) di molti molluschi e diversi artropodi. Cu I Cu I O 2 Cu(I) Cu(I) Cu II O O Cu II Forma deossigenata(incolore ) Forma ossigenata (blu) Due atomi di rame (Cu+) sono legate come gruppo prostetico a tre residui di istidina. L ossigeno si lega come (O 2 2- ) a due differenti atomi di rame.
Emocianine dei molluschi Subunità da 300-450 con: Domini funzionali (FU) da 50 kda polipeptidi da 7 o 8 subunità unite a formare decameri. Ogni polipeptide lega 7-8 molecole di 0 2 La struttura delle emocianine dei molluschi è quella di un ciclindro costruito da decameri di subunità da 300-450 kda. Le emocianine presentano effetto cooperativo ma meno efficiente che in Hb L affinità per O2 è regolata da ph (effetto Bohr),
Concetti principali Le proteine sono strutture dinamiche soggette a cambiamenti conformazionali piu o meno accentuati. La variazioni di pochi residui può avere effetti importanti sulla funzionalità o sulla modulazione dell attività della proteina. Il legame di molecole regolatrici (effettori allosterici) ha un profondo effetto sull attività della proteina. Funzioni simili nei diversi organismi possono essere compiute da proteine diverse, non evolutivamente correlate (evoluzione convergente) che possiedono proprietà simili.