La struttura di una proteina e ruolo biologico da essa svolto sono strettamente connessi. Alcune funzioni biologiche delle proteine: Catalizzatori = Enzimi Accumulo e trasporto di ossigeno = mioglobina e emoglobina. Sostegno e mantenimento della forma cellulare = collagene, actina Lavoro meccanico = contrazione muscolare, separazione cromosomi nella mitosi, movimento flagelli. Decodificazione dell informazione genetica della cellula, traduzione, regolazione dell espressione genica. Regolazione attività biologiche in cellule e tessuti bersaglio = ormoni, recettori Funzioni di difesa dell organismo = anticorpi, tossine
PROTEINE RESPIRATORIE DEI VERTEBRATI EMOGLOBINA E MIOGLOBINA Legano reversibilmente l OSSIGENO. La mioglobina (monomerica) è responsabile del rifornimento di ossigeno nel tessuto muscolare L emoglobina (tetramerica) trasporta ossigeno nel sangue Aumenta la solubilità dell ossigeno nel plasma, da 3ml/L a 220 ml/l. Essenziale per la loro funzione è il legame con un gruppo prostetico: Il gruppo EME in cui è presente lo ione ferroso Fe 2+ che funziona da sito di legame per l O 2 La mioglobina e l emoglobina sono proteine coniugate
GRUPPO EME 4 anelli pirrolici uniti da ponti metilenici (protoporfirina IX), struttura coniugata e planare che coordina il FERRO nello stato ferroso - Fe(II) (Fe 2+ )- Esso è coordinato dai 4 atomi di azoto dell anello tetrapirrolico
Il gruppo EME è alloggiato in una «tasca», formata dal ripiegamento della catena globinica, in cui si affacciano diversi residui amminoacidici idrofobici (Val, Leu, Iso, Phe, Met) che interagiscono con l anello tetrapirrolico dell EME e lo mantengono in sede. interazioni idrofobiche, contatti di van der Waals e legami H Nella tasca idrofobica è impedito l ingresso all H 2 O e il Fe 2+ è protetto dall ossidazione irreversibile. Nelson Cox, I PRINCIPI DI BIOCHIMICA DI LEHNINGER, Zanichelli editore S.p.A. Copyright 2014 5 4
Lo ione Fe 2+ è coordinato dai 4 atomi di azoto dell anello tetrapirrolico, e forma altri 2 legami di coordinazione: con l ossigeno molecolare (O 2 ) e con l istidina prossimale (His93; His F8) Piano dell anello porfirinico
L interazione tra Ferro e Ossigeno è descritta dalla combinazione di 2 strutture di risonanza La formazione e il rilascio dell anione superossido è impedito da un LEGAME H fra l O 2 e l Istidina DISTALE (His64, E7). Questo legame impedisce anche l ossidazione dello ione Fe 2+ a Fe 3+ Val His distale J. M. Berg et al. BIOCHIMICA 7/E Zanichelli editore S.p.a Copyright 2012 Val-68 e Phe-43 aiutano a mantenere l EME in posizione Phe Lo ione ferrico Fe 3+ non può legare O 2 e la Mb o l Hb si ossidano (Meta-Mb o Meta-Hb) His prossimale
Il legame H fra O 2 e His-64 assicura che l interazione O 2 /Fe 2+ sia reversibile, abbassa l affinità dell eme per il suo ligando La tasca dell EME può accogliere anche altre piccole molecole: CΞO (monossido di carbonio) il CΞO lega il Fe 2+ dell EME con un affinità molto maggiore rispetto all O 2 (CO e Fe 2+ sono perfettamente allineati). O III C Il monossido di carbonio blocca i siti di legame per l ossigeno nell Hb e nella Mb, rendendola nonfunzionale. Si blocca la respirazione per intossicazione da CO. Il legame è molto forte ma reversibile, il CΞO può essere rilasciato in condizioni di alte pressioni di O 2 (camera iperbarica)
Mioglobina: 1 catena globinica composta da 8 α-eliche (indicate con le lettere da A a H) unite da segmenti di interconnessione (anse e curve) His-93 (F8) His-64 (E7) La Mb ha un solo gruppo EME, può legare 1 molecola di O 2. Si forma un complesso MbO 2 secondo un rapporto di 1:1. Il legame fra Mb e O 2 è reversibile ed è regolato secondo un equilibrio da una costante di dissociazione: Mb + O 2 MbO 2 Mb + O 2 MbO 2 K diss
[Mb] [O 2 ] K K diss = diss [MbO 2 ] Mb + O 2 MbO 2 Se la Kdiss è piccola l affinità proteina/ligando è elevata La concentrazione di proteina ossigenata (legata all ossigeno, MbO 2 ) rispetto alla concentrazione totale di Mb (Mb + MbO 2 ), varia al variare della concentrazione di ossigeno (ligando) fornito alla proteina. Questo rapporto è chiamato FRAZIONE DI SATURAZIONE DELLA Mb (si esprime in % o in frazione) Y = [MbO 2 ] [MbO 2 ] + [Mb] LA FRAZIONE DI SATURAZIONE DIPENDE DA: 1) dalla concentrazione del ligando [O 2 ] che si esprime come po 2 2) dall affinità che la proteina ha per il suo ligando, cioè dalla costante di dissociazione (K diss ) del complesso MbO 2
La frazione di saturazione Y, la concentrazione di O 2, e la K diss sono legate da una relazione matematica: [O 2 ] = po 2 (pressione parziale di ossigeno) [O 2 ] Y = K diss + [O 2 ] po 2 Y = K diss + po 2 Il valore della K diss corrisponde al valore di po 2 che consente di saturare la Mb al 50% (Y = 0.5). Questo valore di po 2 è detto p50 1 po Y = = 2 K diss + po 2 = 2pO 2 K 2 K diss + po diss = 2pO 2 - po 2 = po 2 2 Eq. di HILL Y = po 2 K diss = p50 p50 + po 2 La p50 è il parametro che misura l AFFINITA di una emoproteina per il suo ligando (l OSSIGENO). Più è grande il valore della p50 più è grande la K diss e quindi minore l affinità dell emoproteina per l O 2
Il valore della p50 e quindi della K diss si ricava sperimentalmente utilizzando il grafico di ossigenazione della Mb. QUANDO SI MISURA la FRAZIONE di SATURAZIONE (Y) della Mb a DIVERSI VALORI di po 2 si OTTIENE UNA CURVA di LEGAME o OSSIGENAZIONE IPERBOLICA Tutti i siti di legame della Mb sono OCCUPATI O 2 Y = [MbO 2 ] [MbO 2 ] + [Mb] Y O 2 O 2 Tutti i siti di legame della Mb sono LIBERI 4 Pressione parziale di O 2 O 2
p50 della mioglobina è ~ 4 mmhg, la sua affinità per l O 2 è molto elevata È una caratteristica necessaria affinchè Mb sia funzionale: DEVE ESTRARRE O 2 DAL SANGUE E ACCUMULARLO NEL TESSUTO MUSCOLARE Nelle cellule muscolari metabolicamente attive: si consuma O 2 : la po 2 cellulare diminuisce Y po 2 nei capillari ~ 30 mmhg Nelle cellule muscolari a riposo: minore consumo di O 2 : la po 2 intracellulare è in equilibrio con quella del sangue capillare la Mb rilascia l ossigeno che aveva legato. Fase di deossigenazione Mb è quasi satura: accumula O 2 Fase di ossigenazione
Emoglobina (Hb): tetramero (le globine si associano formando due copie di dimeri αβ (α 1 β 1 e α 2 β 2 ) che si associano a formare un tetramero attraverso interazioni idrofobiche, legami H e ponti salini. Le interazioni si formano nell interfaccia α 1 β 1 e α 2 β 2 e α 1 β 2 e α 2 β 1 2 catene globiniche α (7 α-eliche) e 2 catene globiniche β (8 α-eliche) Ogni globina ha una tasca in cui lega un gruppo EME, quindi l Hb può legare e trasportare 4 molecole di O 2
Il grado di ossigenazione della Hb dipende dalla po 2 e dalla K diss del complesso Hb(O 2 ) 4. Hb + 4[O 2 ] Hb[O 2 ] 4 Frazione di saturazione: % di Hb ossigenata (di siti EME occupati dall O 2 ) rispetto all Hb totale Y = [Hb(O 2 ) 4 ] [Hb(O 2 ) 4 ] + [Hb] n po 2 Y= n p50 + po 2 n K diss = K diss = p50 n [Hb] [O 2 ] [Hb(O 2 ) 4 ] La Frazione di saturazione è legata alla po 2 e alla K diss secondo la seguente relazione: po 2 Y = 4n K 4 diss + po 2 n po 4 2 Equazione di HILL
Graficamente la relazione esistente fra Y e po 2 è rappresentato da una CURVA DI OSSIGENAZIONE SIGMOIDALE, infatti il legame Hb/O 2 è di tipo COOPERATIVO. a) L AFFINITA DELL Hb PER L OSSIGENO AUMENTA MANO A MANO CHE LE MOLECOLE DI O 2 OCCUPANO I GRUPPI EME. b) Esiste una cooperatività positiva fra i siti di legame dell ossigeno (fra i gruppi EME) Y 1,00 0.75 0.50 STATO R Hb ad alta affinità, raggiunge la saturazione Hb semisatura, con minime variazioni di po 2 si deossigena e si ossigena quasi completamente c) Il legame di 1 molecola di O 2 ad un gruppo EME facilita il legame di altre molecole di O 2 agli altri gruppi EME 0.25 0.0 p50 ~ 26 mm Hg, valore di po 2 che satura il 50% dei siti di legame dell Hb 20,0 40,0 60,0 80,0 po 2 (mmhg) Hb a bassa affinità, poco ossigenata STATO T
Qual è il vantaggio per un organismo vivente nel possedere una proteina respiratoria che lega l O 2 in modo cooperativo? 1,00 po 2 presente nei capillari tissutali po 2 presente nei capillari polmonari 0.75 Mb Hb Y 0.50 Hb rilascia e lega efficientemente l ossigeno 0.25 0.0 20,0 40,0 60,0 80,0 100,0 po 2 (mmhg)