FITOPLANCTON: METODICHE DI ANALISI QUALI-QUANTITATIVA RACCOLTA DEI CAMPIONI In base all'obiettivo del campionamento IDENTIFICAZIONE E STIMA QUANTITATIVA ANALISI QUALITATIVA ISOLAMENTO ORGANISMI DA PORTARE IN COLTURA
RACCOLTA CON LE BOTTIGLIE Campionamento a profondità discrete lungo il profilo verticale ST-75 PAR (µe/cm 2 /s) _ 0 0 400 800 1200 1600 40 Profondità (m) 80 120 160 Clorofilla (µg/l) _ 0 0 0.2 0.4 0.6 0.8 40 Sub-campionamento in bottiglie di vetro scuro 250mL acque meso-trofiche 500mL acque oligo trofiche Profondità (m) 80 120 160
RACCOLTA CON I RETINI Informazioni di tipo semiquantitativo sull abbondanza di specie di dimensioni elevate (es. Ceratium, Protoperidinium) e in generale di specie poco abbondanti (es. dinoflagellati potenzialmente tossici Dinophysis, Prorocentrum, Alexandrium) Ceratium + Vuoto di maglia di 10-40 μm + bicchiere di raccolta da 200-500mL + flussometro per la stima del volume d'acqua filtrato Alexandrium
Formalina FISSAZIONE E CONSERVAZIONE + Fortemente tossico usare guanti e cappa + ph neutro o leggermente basico + 0.8-1.6% fino a 4% per campioni molto concentrati + Versare la formalina nel campione prima degli organismi Lugol + Poco tossico + Non indicato per periodi di conservazione lunghi + Lugol acido: piccoli flagellati e diatomee pocosilicizzate + Lugol basico: coccolitoforidi + 0.5-1% Alcool + Salita degli alcoli + Poco tossico Conservazione: a 4 C, al buio
ANALISI QUANTITATIVA: CONTEGGIO CON IL METODO DI UTERMÖL Metodo più usato prevede l osservazione e il conteggio delle cellule fitoplanctoniche al microscopio invertito in apposite camerette con fondo dello spessore di un coprioggetto 1- RIEMPIMENTO E SEDIMENTAZIONE 2- CONTEGGIO 3- CALCOLO DELL'ABBONDANZA CILINDRI DI SEDIMENTAZIONE MICROSCOPIO INVERTITO CAMERA DI SEDIMENTAZIONE
RIEMPIMENTO E SEDIMENTAZIONE L abbondanza del fitoplancton può variare da 10 2 cell. l -1 in ambienti oceanici estremamente oligotrofici, fino a picchi eccezionali anche di 10 8 cell. l -1 in acque costiere, durante eventi acuti di sviluppo fitoplanctonico. SCELTA DEL VOLUME DA SEDIMENTARE CONCENTRAZIONE CHL-a 1μgl -1 chl-a abbondanze moderate PRECONTEGGIO CONDIZIONI AMBIENTALI E STAGIONALI
PROCEDURA + Le camere di sedimentazione ed i cilindri devono essere lavati con un detergente risciacquati con acqua deionizzata; + capovolgere la bottiglia 100 volte per randomozzare il campione, + versare il campione nelle camere di sedimentazione lentamente evitando la formazione di bolle; + quando l abbondanza fitoplanctonica è particolarmente bassa occorre analizzare quantità di campione maggiori di 100 ml, preconcentrandole + se la quantità di campione da sedimentare è pari o inferiore a 3 ml, si può utilizzare la sola cameradi base, trasferendovi il campione con una pipetta tarata, possibilmente automatica; + per volumi inferiori ai 10 ml si consiglia di preparare almeno due diverse camere di sedimentazione e di effettuare il conteggio su entrambe; + il conteggio deve avvenire quando la sedimentazione di tutti gli organismi sia da ritenersi completata; + una volta completata la sedimentazione, il cilindro della camera combinata va fatto slittare lentamente e la camera viene coperta con un vetrino copricamera di spessore sottile
TEMPI E VOLUMI DI SEDIMENTAZIONE Vengono comunemente ritenuti sufficienti tempi pari a 3 5 ore per ogni centimetro di altezza del cilindro, il che può comportare, per camere combinate da 100 ml, un attesa di 3 4 giorni per la sedimentazione.
OSSERVAZIONE CAMPIONI E CONTEGGIO Il conteggio effettuato sull intera superficie del fondo della camera di sedimentazione richiederebbe tempi eccessivamente lunghi e difficilmente conciliabili con il numero generalmente elevato di campioni da analizzare per studi di distribuzione o di ecologia del fitoplancton. Pertanto nella fase di conteggio si opera spesso un ulterioresubcampionamento + CONTEGGIO PER TRANSETTI conteggio su transetti di lunghezza pari al diametro della camera di sedimentazione (26 mm) e di larghezza pari al diametro del campo visivo. In quest ultimo caso, tuttavia, le cellule situate agli estremi del campo rischiano di non essere viste. Allo scopo di ridurre l errore dovuto a distribuzioni disomogenee delle cellule sul fondo della camera, vanno esaminati almeno due transetti perpendicolari. + CONTEGGIO PER CAMPI conteggio delle cellule fitoplanctoniche su un certo numero di campi di dimensioni corrispondenti al campo visivo o all area del reticolo inserito nell oculare. Il numero di campi da esaminare può essere prefissato oppure vengono esaminati tanti campi fino a contare un numero significativo di cellule. La scelta dei campi da analizzare deve essere casuale. + CONTEGGIO SULL'INTERA CAMERA utilizzata in presenza di abbondanze fitoplanctoniche particolarmente esigue,in ambienti estremamente oligotrofici. Inoltre l esame dell intera camera viene utilizzato anche per la ricerca delle specie rare o di specie potenzialmente tossiche
CALCOLI II calcolo dell abbondanza delle cellule fitoplanctoniche presenti nel campione va effettuato applicando la seguente formula generale: C = N fattore 1000/v C = concentrazione fitoplanctonica espressa come cell. l 1 N = numero di cellule contate v = volume del campione sedimentato (ml) fattore = rapporto fra area totale della camera e area esplorata A seconda che il conteggio sia effettuato su transetti, campi casuali, o intera camera, il fattore vienecalcolato come segue: fattore n transetti: π r /2 n h fattore c campi: π r2 / c a fattore intera camera: 1 dove r = raggio della camera di sedimentazione (mm) h = lato del reticolo o diametro del campo visivo (mm) a = area del campo visivo (mm 2 ) n = numero di transetti osservati c = numero di campi osservati
LIMITE DI DETENZIONE Il limite di detenzione è la concentrazione minimale di un taxon o gruppo specifico che permette la sua individuazione con una probabilità specifica. Per un singolo taxon, il limite di detenzione può essere determinato attraverso il modello di Poisson secondo la formula: ndet= -ln (a) f totale / V f contato dove: ndet t = limite di detenzione a = livello di significatività (di solito 0,05 che corrisponde ad una probabilità del 95%) f totale= numero totale dei campi sull intero fondo della camera di sedimentazione f contato= numero di campi esaminati V= volume del subcampione esaminato (in litri)