Ogni globina ha una tasca in cui lega un gruppo EME, quindi l Hb può legare e trasportare 4 molecole di O 2

Emoglobina (Hb): tetramero (le globine si associano formando due copie di dimeri αβ (α 1 β 1 e α 2 β 2 ) che si associano a formare un tetramero attraverso interazioni idrofobiche, legami H e ponti salini che si formano nell interfaccia α 1 β 1 e α 2 β 2 e α 1 β 2 e α 2 β 1 2 catene globiniche α e 2 catene globiniche β Ogni globina α possiede 7 α-eliche Ogni globina β possiede 8 α-eliche Ogni globina ha una tasca in cui lega un gruppo EME, quindi l Hb può legare e trasportare 4 molecole di O 2

Graficamente la relazione esistente fra Y e po 2 è rappresentato da una CURVA DI OSSIGENAZIONE SIGMOIDALE, infatti il legame Hb/O 2 è di tipo COOPERATIVO. a) L AFFINITA DELL Hb PER L OSSIGENO AUMENTA MANO A MANO CHE LE MOLECOLE DI O 2 OCCUPANO I GRUPPI EME. Y 1,00 0.75 Hb semisatura, con minime variazioni di po 2 si deossigena e si ossigena quasi completamente Hb ad alta affinità, raggiunge la saturazione (STATO R) b) Esiste una cooperatività positiva fra i siti di legame dell ossigeno (fra i gruppi EME) c) Il legame di 1 molecola di O 2 ad un gruppo EME facilita il legame di altre molecole di O 2 agli altri gruppi EME 0.50 0.25 0.0 Hb a bassa affinità, poco ossigenata STATO T p50 ~ 26 mm Hg, valore di po 2 che satura il 50% dei siti di legame dell Hb 20,0 40,0 60,0 80,0 po 2 (mmhg)

Qual è il vantaggio per un organismo vivente nel possedere una proteina respiratoria che lega l O 2 in modo cooperativo? 1,00 po 2 presente nei capillari tissutali po 2 presente nei capillari polmonari 0.75 Mb Hb Y 0.50 Hb rilascia e lega efficientemente l ossigeno 0.25 0.0 20,0 40,0 60,0 80,0 100,0 po 2 (mmhg)

Il grado di ossigenazione della Hb dipende dalla po 2 e dalla K diss del complesso Hb(O 2 ) 4. Hb + 4[O 2 ] Hb[O 2 ] 4 Frazione di saturazione: Y = [Hb(O 2 ) 4 ] [Hb(O 2 ) 4 ] + [Hb] La Frazione di saturazione è legata alla po 2 e alla K diss secondo la seguente relazione: po 4 2 Y = K diss + po 4 2 n 4 po po 2 2 Y= Y = n 4 4 p50 + po 2 n K diss = p50 n Equazione di HILL

Le diverse emoproteine (per es. le diverse varianti di Hb prodotte a causa di mutazioni) possono avere un grado di cooperatività differente. Il termine n dà la misura della cooperatività In realtà in condizioni fisiologiche n H dell Hb è ~ 3 1< n H <n >> la proteina è Cooperativa e subisce una transizione fra stato a bassa affinità e stato ad alta affinità, per cui, nello stesso momento, avremmo una miscela di molecole di Hb completamente ossigenate, altre non ossigenate e altre parzialmente ossigenate. n H = 1 >> Non cooperativa (Mb) n H < 0 >> Cooperatività negativa po n 2 Y= n n p50 + po 2 La proteina è completamente cooperativa se il n dei siti di legame è uguale al coefficiente di Hill, cioè n = n H Se l Hb avesse n H = 4 vorrebbe dire che tutte le molecole di Hb sono o completamente legate o completamente dissociate e il legame con l O 2 è contemporaneo in tutti i siti.

STATO T Hb a bassa affinità α 1 β1 β2 α2 Transizione completa: quando sono occupati gli ultimi siti ormai tutte le molecole di Hb sono nella forma ad alta affinità STATO R ALTA AFFINITA + O 2 α 1 β1 α 1 β2 α2 β2 α 1 β1 β2 α2 β1 α2 α 1 β1 α 1 β1 β2 α2 β2 α2 α1 β1 α 1 β1 β2 α2 β2 α2 + O 2 α 1 β1 α 1 β1 β2 α2 β2 α2 + O 2 α 1 β1 + O 2 β2 α2 Legame con la molecola di O 2 >> cambia la struttura 3 aria della subunità legata CON LA PARZIALE OSSIGENAZIONE (almeno un sito occupato dall O 2 in ciascuno dei 2 dimeri αβ) L INTERA PROTEINA VA INCONTRO AD UNA MODIFICAZIONE DELLA SUA STRUTTURA 4 aria ASSUMENDO UNA STRUTTURA PIU DISPONIBILE AD ACCETTARE ALTRE MOLECOLE DI O 2.

La cooperatività di legame dell emoglobina è possibile perché lo stato di ossigenazione di un sito può essere comunicato agli altri siti attraverso un cambiamento della conformazione proteica dell Hb. L Hb passa da uno stato conformazionale a bassa affinità per l O 2 ad uno stato conformazionale ad alta affinità in funzione della concentrazione di O 2 (po 2 ). IL LEGAME CON L O 2 MODIFICA LA STRUTTURA DELLA PROTEINA DEOSSI-Hb >> stato T >> conformazione a bassa affinità OSSI-Hb >> stato R >> conformazione ad alta affinità PER PASSARE DALLO STATO A BASSA AFFINITÀ A QUELLO AD ALTA AFFINITÀ L HB SUBISCE UNA TRANSIZIONE ALLOSTERICA. L Hb è una proteina ALLOSTERICA.

L Hb è una proteina ALLOSTERICA. 1) Ha più siti di legame per il suo ligando 1) Il ligando è un effettore omoallosterico: occupando uno dei siti di legame della proteina influisce sull affinità degli altri siti liberi 2) Il legame proteina/ligando causa sempre una modificazione della struttura 3 aria e anche della struttura 4 aria della proteina che modifica la sua affinità nei confronti del ligando stesso. 3) Ha siti di legame per altri ligandi che agiscono come molecole regolatrici (effettori eteroallosterici) che influenzano l affinità della proteina verso il suo ligando 4) La modulazione e il legame proteina/effettori è sempre REVERSIBILE

Il legame fra l EME e l O 2 produce il cambiamento strutturale nella proteina. EME convesso EME appiattito His93 F8 His64, E7 Deossi-Hb: Il legame con l His prossimale trascina il Fe 2+ al di sopra del piano dell EME. Ossi-Hb: Il Fe 2+, è trascinato all interno dell EME per effetto del legame con l O 2, nel muoversi si tira dietro tutta l elica F e i segmenti adiacenti rompendo le interazioni che stabilizzavano lo stato T.

COSA SUCCEDE ALLA STRUTTURA DELLA EMOGLOBINA QUANDO AVVIENE LA TRANSIZIONE T R LA DEOSSI-HB (STATO T) È STABILIZZATA DA UNA RETE DI LEGAMI IDROGENO E INTERAZIONI IONICHE INTRA- E INTER- CATENA. Ponti salini molto importanti coinvolgono l His146 delle catene β che interagisce con l Asp94 e con la Lys40 delle catene α per mezzo del suo gruppo carbossi-terminale Lys C5 o 40 His HC3 o 146 Asp FG1 o 94 C-term.

Quando l Hb inizia a ossigenarsi, il legame EME/O 2 provoca un CAMBIAMENTO sia DELLA STRUTTURA TERZIARIA sia DELLA QUATERNARIA: un dimero α/β ruota e scivola rispetto all altro dimero α/β, questo movimento distorce e indebolisce la rete di legami H e ponti salini che stabilizza o stato T, le catene beta si avvicinano e si restringe la cavità centrale (146) (146) (146) Nello stato R l estremità C-terminale (His-146, HC3) delle catene β è ruotato verso la cavità centrale e non può più formare ponti salini

Effettori allosterici dell emoglobina O 2 H + (ph) CO 2 2,3-bisfosfoglicerato Regolano la transizione allosterica tra stato ad alta affinità e bassa affinità, aumentando l efficienza dell Hb nel rilasciare ossigeno ai tessuti. EFFETTO BOHR TESSUTI Hb 4O 2 + nh + Hb nh + + 4O 2 POLMONI La diminuzione di ph nei capillari abbassa l affinità dell Hb verso l O 2 rendendone più efficiente il rilascio. La p50 sale a ~ 40 mm Hg

COME SPIEGARE IL MECCANISMO DELL EFFETTO BOHR? La DEOSSI-Hb ha un pi più alto della OSSI-Hb, lega gli ioni H + con maggiore affinità. L Hb ha vari siti di legame per gli ioni H + come: 1) ammino-gruppi N-terminali delle catene alfa 2) His 146 (residuo C-terminale delle catene β). - + COO - terminale delle catene β + DEOSSI-Hb - (catene β) DEOSSI-Hb: His-146 (C-terminale delle catene β) ha un pka anormalmente elevato (> 7.2). Poiché nei capillari tissutali il ph scende a ~6.8: l His-146 si trova nella sua forma PROTONATA e forma un ponte salino intra-catena con l Asp 94, che stabilizza la forma T deossi.

OSSI-Hb: il pka dell His 146 scende a ~6.5 a causa della transizione dallo stato T a quello R Nel ph del sangue circolante (7.2) o dei capillari polmonari (7.6), l His sarà quasi del tutto DEPROTONATA e non formerà più il ponte salino. Questo contribuisce al cambiamento strutturale che favorisce l ossigenazione completa della Hb. H l94 C CH 2 l C=O l H l146 OOC C l CH 2 l H C N + CH C N H H l O -

ANIDRIDE CARBONICA (CO 2 ) La CO 2 viene liberata nel circolo sanguigno a livello periferico durante i processi metabolici cellulari. La CO 2 è trasportata nel sangue in tre forme: 1) disciolta: obbedisce alla Legge di Henry come l'o 2 ma è 20 volte più solubile di questo. In questa forma costituisce il 10% del gas liberato dal sangue venoso nel polmone. 2) Diffonde all interno degli eritrociti dove: CO 2 + H 2 O HCO 3 - + H + (ANIDRASI CARBONICA) il bicarbonato quando aumenta di concentrazione diffonde dal globulo rosso al plasma scambiandosi con ioni Cl - Gli ioni H + si legano alla DEOSSI- Hb (che è meno acida della forma ossigenata ed è quindi un accettore di protoni migliore) Contribuisce all effetto BOHR e quindi al rilascio di O 2 e aumenta la capacità del sangue di trasportare H + e CO 2 (effetto HALDANE)

3) La CO 2 in parte si lega all Hb alle estremità N-terminali libere delle catene globiniche β formando CARBAMMATI = gruppi carichi negativamente che stabiliscono interazioni elettrostatiche con i residui di Arg-141 delle catene α stabilizzando la forma T

CONCENTRAZIONE CO 2 Effettore allosterico negativo per l Hb Y 1,00 0.75 0.50 Se la pco 2 diminuisce l affinità aumenta (p50 + bassa) Se la pco 2 aumenta l affinità diminuisce (p50 + alta) 0.25 0.0 20,0 40,0 60,0 80,0 100,0 po 2 (mmhg)

2,3-bisfosfoglicerato È presente nel citoplasma degli eritrociti (ad una concentrazione ~ 5 mm), dove si forma a partire dall 1,3-bisfosfoglicerato (intermedio della glicolisi) È un effettore allosterico negativo, come gli ioni H + e la CO 2. Il 2,3-BPG si lega fortemente alla DEOSSI-Hb stabilizzando la forma T. Il 2,3-BPG si lega saldamente nella cavità centrale dell Hb fra le 4 catene globiniche nell Hb DEOSSIGENATA stabilizzandola e riducendo l affinità per l O 2

α 2 β 1 + + - - + + β 2 α 1 - + + + Il 2,3-BPG forma interazioni elettrostatiche con gruppi carichi positivamente che sporgono nella cavità centrale della DEOSSI-Hb: NH 3+ N-terminale ciò rafforza i ponti salini della forma T dell Hb. Lys-82 delle 2 catene β His-143 His-2 Quando l Hb lega la prima molecola di O 2 si innesca il cambiamento conformazionale che distrugge i ponti salini, la cavità centrale si restringe e il 2,3- BPG viene espulso.

Se negli eritrociti non ci fosse il 2,3-BPG la curva di ossigenazione dell Hb diventerebbe iperbolica, l Hb legherebbe l O 2 in modo non cooperativo Il 2,3-BPG modula l ossigenazione dell Hb in funzione delle condizioni ambientali in alta montagna >> basse po 2 adattamento alla carenza di ossigeno nei tessuti. Gli eritrociti aumentano la produzione di 2,3-BPG, >> diminuisce l affinità dell Hb per l O 2 (aumenta la p50) >> aumenta il rilascio di O 2 ai tessuti che altrimenti non sarebbero sufficientemente ossigenati

Emoglobina fetale: α 2 γ 2 Le catene γ hanno un residuo di Ser al posto dell His-143, manca una coppia di interazione ionica che stabilizza il complesso 2,3-BPG-deossiHb

Le mutazioni alterano la struttura e la funzione dell'emoglobina Sono state scoperte più di 1000 forme mutanti dell Hb, spesso con 1 unica sostituzione amminoacidica, non tutte le varianti emoglobiniche conducono a sintomi clinici. ca il 5% della popolazione mondiale possiede almeno una variante emoglobinica

Eritrociti umani normali Eritrociti umani falciformi Nell anemia falciforme viene prodotta Hb-S nella quale il residuo di Glu in posizione 6 delle catene β è sostituito da un residuo di Val. Nella Deossi-Hb-S questo residuo di Val costituisce un punto appiccicoso esposto sulla superficie del tetramero, infatti va ad inserirsi in una tasca idrofobica situata nelle subunità β di un altro tetramero: l Hb polimerizza, forma delle fibre insolubili

La deossiemoglobina S: la Val 6 mutante interagisce con la Phe 85

Struttura di una fibra di deossiemoglobina S