BIOTECNOLOGIE pag 1 di 11 Redatto: U.Marchesi Verificato Responsabile Struttura Semplice: I.M.Ciabatti Verificato RQ: M.Guarducci Approvato Responsabile di Struttura Complessa: D.amaddeo
BIOTECNOLOGIE pag 2 di 11 1. Scopo Lo scopo della presente procedura è quello di descrivere le responsabilità e le modalità operative per la rilevazione del terminatore NOS del gene nopalina sintasi di Agrobacterium tumefaciens mediante metodica PCR real time specifica, in matrici agro-alimentari. 2. Campo di applicazione La presente procedura viene applicata a DNA estratto da matrici agro-alimentari contenenti, costituite o derivate da mais. Nel caso in cui il DNA venga rimosso o altamente degradato durante il processo produttivo della matrice agro-alimentare, il metodo non fornisce risultati affidabili. 3. Definizioni ed abbreviazioni bp (base pairs): coppie di basi Controllo LOD: DNA estratto da un materiale di riferimento a base di mais utilizzato ad un quantitativo corrispondente al LOD (limite di rilevazione) Ct o ciclo soglia: ciclo al di sopra del quale la fluorescenza misurata supera un valore soglia e si distingue dal rumore di fondo Ct LOD : Ct ottenuto dall amplificazione del controllo LOD DNA bersaglio: tratto di DNA caratteristico dell elemento ricercato mediante PCR e quindi riconosciuto in maniera specifica dai primer e dalla sonda utilizzati nella miscela di reazione LOD (limit of detection): limite di rivelazione NTC (no template control): controllo negativo di PCR OGM (Organismi Geneticamente Modificati): organismi il cui materiale genetico è stato modificato in modo diverso da quanto si verifica in natura con l accoppiamento e/o la ricombinazione genetica naturale PCR (Polymerase Chain Reaction): reazione enzimatica in vitro, catalizzata da DNA polimerasi DNA dipendenti, che determina l amplificazione del DNA bersaglio Primer: oligonucleotide, che riconosce una sequenza specifica del DNA bersaglio, utilizzato per innescare la reazione di PCR Probe o sonda: oligonucleotide marcato che riconosce una sequenza specifica del DNA bersaglio rivelandone la presenza Terminatore: elemento di regolazione dell espressione genica Real Time PCR: tipologia di PCR in cui il sistema di rilevazione, avvalendosi di sonde marcate con fluorocromi specifiche per il prodotto di amplificazione, consente di seguire ciclo dopo ciclo l andamento della reazione 4. Riferimenti ABI Prism 7900HT Sequence Detection System and SDS Enterprise Database User Guide
BIOTECNOLOGIE pag 3 di 11 Applied Biosystems 7900HT Fast Real-Time PCR System and SDS Enterprise Database User Guide Permingeat, H.R. et al. (2002). J. Agric. Food Chem. 50: 4431-4436 Definition of Minimum Performance Requirements for Analytical Methods of GMO Testing European Network of GMO Laboratories (Version 25/01/2005) DO VIR Documento Organizzativo IGR VIR 001 Istruzione gestione reagenti IL VIR 002 Creazione del file TEMPLATE.sdt ISO/FDIS 24276:2005 Foodstuffs Nucleic acid based methods of analysis for the detection of genetically modified organisms and derived products general requirements and definition PG QUA 011 Validazione dei metodi e stima dell incertezza di misura PG QUA 005 Gestione dei documenti PG VIR 001 Ricevimento, analisi, conservazione e smaltimento di campioni ufficiali prelevati per la ricerca di organismi geneticamente modificati (OGM) PG VIR 003 Gestione delle aree e delle attività per l esecuzione dei protocolli di PCR POS VIR 001 INT Organismi geneticamente modificati (OGM): monitor PCR HMG POS VIR 002 INT Organismi geneticamente modificati (OGM): promotore 35S POS VIR 015 SUP Estrazione di DNA con la metodica CTAB precipitante POS VIR 016 SUP Estrazione di DNA con DNeasy Plant Maxi Kit POS VIR 052 SUP Estrazione di DNA con la metodica CTAB POS VIR 053 SUP Estrazione di DNA con Dneasy Plant Mini Kit The fitness for purpose of analytical methods, EURACHEM Guide, 1998. 5. Principio Il DNA estratto e purificato dal campione da sottoporre a prova è amplificato enzimaticamente e rilevato mediante l impiego di una coppia di primer ed una sonda specifici per l elemento ricercato (terminatore NOS): Nome Tipo Sequenza 5-3 5F Fw 5'-GTAATGCATGACGTTATTTATGAGA-3' 4R Rv 5'-TAATTTATCCTAGTTTGCGCGC-3' P Pr 5'-FAM-TGCGGGACTCTAATCATAAAAACCCA-TAMRA-3' L amplificazione del DNA bersaglio genera un amplificato di 104 bp. In particolare la regione bersaglio dell amplificazione si colloca all interno della sequenza di DNA derivata dal terminatore NOS del gene nopalina sintasi di Agrobacterium tumefaciens, elemento a volte utilizzato per la realizzazione dei costrutti genici impiegati negli OGM attualmente in commercio. L eventuale comparsa di amplificati viene seguita attraverso un sistema di rivelazione in fluorescenza integrato allo stesso apparato di amplificazione. Vengono utilizzate sonde marcate con due fluorocromi, cosiddetti reporter (legato al 5 della sonda) e quencher (legato al 3 ); in assenza di amplificazione, il reporter irradiato trasferisce energia al quencher e viene osservata la fluorescenza solo di quest ultimo; a seguito di amplificazione, l attività 5 esonucleasica della polimerasi rimuove il reporter dalla sonda con conseguente
BIOTECNOLOGIE pag 4 di 11 emissione di fluorescenza specifica del reporter. Tale fluorescenza aumenta in modo direttamente proporzionale al numero di amplificati. La fluorescenza misurata viene normalizzata rispetto ad un fluorocromo di riferimento passivo (ROX) presente nella miscela di reazione. 6. Apparecchiature, materiali, reagenti, materiali di riferimento, campioni di riferimento, substrati biologici e dispositivi di protezione individuali 6.1 Apparecchiature ABI Prism 7900HT Sequence Detection System ABI Prism 7900HT Fast Real-Time PCR System Cappa a flusso laminare verticale sterile Congelatore -20 C ± 5 C Frigorifero +4 C ± 2 C Microcentrifuga Pipette monocanale volumi da 2 a 1000 µl Produttore di ghiaccio Vortex 6.2 Materiali Bicchieri di plastica Forbici Ghiaccio Griglia per microprovette Micropiastre ottiche di reazione da 96 pozzetti MicroAmp o microprovette ottiche MicroAmp Pinzette Provette tipo Eppendorf da 1,5 ml Provette tipo Eppendorf da 2,0 ml Puntali con filtro volumi da 2 a 1000 µl Secchielli per ghiaccio Soluzione decontaminante (IPR VIR 081) Soluzione disinfettante etanolo al 70% (IPR VIR 050) Strumento per l installazione dei tappi MicroAmp o pettine per il fissaggio della pellicola adesiva Supporto per micropiastra MicroAmp a 96 pozzetti o per microprovette Supporti speciali per provette da 1,5 ml Tappi ottici MicroAmp o pellicola ottica adesiva 6.3 Reagenti Master mix PCR real time terminatore NOS (IPR VIR 147) H2O grado reagente sterile (IPR VIR 096) TE: Tris-HCl ph 8,00 1mM / EDTA ph 8,00 0,01 mm (IPR VIR 127)
BIOTECNOLOGIE pag 5 di 11 6.4 Materiali di riferimento Farine standard (CRM) di soia Soia Roundup Ready 0.1%, 0.5%, 1%, 2%, 5% GM Farine standard (CRM) di mais Mais BT11 0.1%, 0.5%, 1%, 2%, 5% GM Mais NK603 0.1%, 0.5%, 1%, 2%, 5% GM Mais GA21 0.1%, 0.5%, 1%, 2%, 5% GM Altro mais geneticamente modificato contenente il terminatore NOS 6.5 Dispositivi di protezione individuale Guanti in lattice o vinile senza polvere Camice 7. Responsabilità Il Responsabile di Struttura ed il Responsabile della Prova hanno la responsabilità di garantire e verificare la corretta applicazione della presente procedura. Le responsabilità relative alla preparazione dei reagenti, all esecuzione del metodo di prova, alla lettura ed alla verifica dei risultati sono riportate sui moduli PG QUA 005/12: Tabella responsabilità personale a tempo indeterminato (TRPI) e Modulo PG QUA 005/13: Tabella responsabilità personale a tempo determinato, collaboratori e consulenti (TRPD). 8. Modalità operative Da eseguire nell area di prova 220 o 221A sotto cappa a flusso laminare verticale sterile. Nell eseguire la procedura l operatore deve osservare scrupolosamente la PG VIR 003 (Gestione delle aree e delle attività per l esecuzione dei protocolli di PCR ). Nell eseguire la procedura, compilare il modulo POS VIR 002 INT/1 consistente in tre pagine: la stampa dei due fogli di lavoro campioni e risultati contenuti nel file excel SCREENING OGM.xls costituiscono rispettivamente pag.1 e pag.3, mentre la stampa della piastra di amplificazione definita nel file SDS SCREENING OGM.sds costituisce pag.2. 8.1 Norme di igiene e sicurezza Per l esecuzione della presente procedura si rimanda a quanto disposto dalla PG VIR 003 specificando che tali disposizioni, vista l innocuità della prova per l operatore, sono esclusivamente a tutela dell esito della prova stessa. 8.2 Preparazione dei campioni e dei controlli Come controlli utilizzare: il controllo negativo estrazione e/o il controllo negativo PCR (H2O a grado reagente sterile) come controllo negativo
BIOTECNOLOGIE pag 6 di 11 DNA estratto da una qualsiasi delle seguenti farine standard (CRM): o Soia Roundup Ready 0.1%, 0.5%, 1%, 2%, 5% GM o Mais BT11 0.1%, 0.5%, 1%, 2%, 5% GM o Mais GA21 0.1%, 0.5%, 1%, 2%, 5% GM o Mais NK603 0.1%, 0.5%, 1%, 2%, 5% GM o Altro mais geneticamente modificato contenente il terminatore NOS previa verifica dell amplificabilità con il sistema descritto nella presente POS come controllo positivo Dai campioni e dai controlli, estrarre e purificare il DNA secondo una delle seguenti procedure di supporto: POS VIR 052 SUP, POS VIR 053 SUP, POS VIR 015 SUP oppure POS VIR 016 SUP. Se possibile, quantificare il DNA ottenuto mediante lettura spettrofotometrica. La prova viene effettuata su un replicato per ciascun replicato di estrazione. I campioni vengono sottoposti a prova alla concentrazione determinata in base ai risultati della monitor PCR hmg (POS VIR 001 INT). I controlli negativi vengono analizzati in singolo replicato senza sottoporli a diluizione. Il controllo positivo viene sottoposto a prova in singolo replicato su una quantità corrispondente al limite di rilevabilità (controllo LOD). 8.3 Allestimento della prova Prima fase Accensione ed impostazione dell amplificatore 1. Accendere l ABI Prism 7900HT Sequence Detection System o l ABI Prism 7900HT Fast Real-Time PCR System almeno 30 prima della prova per far scaldare il laser all interno dello strumento. 2. Aprire il file TEMPLATE SCREENING OGM.sdt, predisposto con il seguente profilo di amplificazione: T Tempo Step Stage Acquisizione n. cicli ( C) (sec.) 1 UNG 50 C 120 NO 1X 2 Denaturazione iniz. 95 C 600 NO 1X 50X 3a Denaturazione 95 C 15 NO 3b Annealing e sintesi 60 C 60 SI Per l impostazione del file vedi l istruzione IL VIR 002 3. Definire quindi la collocazione dei controlli e dei campioni nella piastra di reazione da 96 pozzetti in cui avverranno le reazioni riportandola a pag.2 del modulo POS VIR 002 INT/1. 4. Salvare il file come GG-MM-AA screening ogm.sds, indicando il giorno-mese-anno nel nome del file. Nel caso vengano effettuate più corse nella stessa giornata, attribuire
BIOTECNOLOGIE pag 7 di 11 ai file una numerazione sequenziale (es. GG-MM-AA screening ogm1.sds, GG-MM- AA screening ogm2.sds, ecc.) Seconda fase Preparazione della miscela di reazione Aprire il file excel SCREENING OGM.xls e compilare il foglio di lavoro campioni (pagina 1 dell allegato POS VIR 002 INT/1) inserendo nella cella corrispondente il numero dei campioni/controlli da sottoporre a prova. Salvare il file con il nome GG-MM-AA screening OGM.xls, indicando il giorno-mese-anno nel nome del file. Nel caso vengano effettuate più corse nella stessa giornata, attribuire ai file una numerazione sequenziale (es. GG-MM-AA screening ogm1.xls, GG-MM-AA screening ogm2.xls, ecc.) Nell area di prova 205 sotto cappa a flusso laminare verticale sterile prelevare il volume di master mix calcolato (MASTER MIX PCR REAL TIME, IPR VIR 147). Prelevare una aliquota di acqua grado reagente sterile di almeno 10 µl da utilizzare come NTC. Trasferire le provette contenenti la master mix e l NTC nell area di prova 220 o 221A. Terza fase Allestimento della prova Sotto cappa a flusso laminare verticale sterile nell area di prova 220 o 221A predisporre il seguente materiale: - Supporti speciali per provette da 1,5 ml. - Due bicchieri di plastica inseriti uno nell altro e contenenti qualche ml di soluzione decontaminante, dove sono eliminati i puntali dopo l uso. Durante l esecuzione della prova, mantenere i campioni di DNA in esame in ghiaccio o supporto refrigerato. 1. A seconda dello strumento utilizzato per l amplificazione e rivelazione, disporre sotto cappa: ABI 7900HT: - forbici - bustina contenente i tappi ottici - pinzette - micropiastre ottiche di reazione da 96 pozzetti MicroAmp o microprovette ottiche MicroAmp - strumento per l installazione dei tappi - supporto per micropiastra MicroAmp a 96 pozzetti o per microprovette ABI 7900Fast - supporto per micropiastra MicroAmp a 96 pozzetti - micropiastra ottica di reazione da 96 pozzetti MicroAmp per l ABI 7900HT Fast Real Time PCR - pellicola adesiva Optical adhesive film MicroAmp - pettine per il fissaggio della pellicola adesiva
BIOTECNOLOGIE pag 8 di 11 NB: Le piastre MicroAmp a 96 pozzetti sono diverse a seconda dello strumento utilizzato, assicurarsi di utilizzare il formato corretto. 2. Prelevare dal ghiaccio le provette contenenti le sospensioni di DNA dei campioni da analizzare e dei controlli e trasferirle su un supporto speciale. 3. Agitare su vortex per circa 10 secondi ciascuna provetta e centrifugare alla massima velocità per pochi secondi, al fine di raccogliere sul fondo della provetta la sospensione di DNA. 4. Disporre sotto cappa le provette contenenti la master mix e l acqua grado reagente da utilizzare nell NTC 5. Trasferire 20 µl di master mix nei pozzetti della micropiastra secondo lo schema precedentemente definito e riportato a pagina 2 del POS VIR 002 INT/1. 6. Trasferire 5 µl di sospensione di DNA di ciascun campione, nel corrispondente pozzetto della micropiastra secondo lo schema precedentemente definito e riportato a pagina 2 del POS VIR 002 INT/1 7. Sigillare i pozzetti della piastra con la pellicola ottica adesiva o con i tappi ottici. 8. Estrarre la micropiastra di reazione dal supporto di base e trasferirla nell area di prova 210 o 221. Quarta fase Amplificazione e analisi dei dati Da eseguire nell area di prova 210 o 221. Disporre la micropiastra di reazione nell apposito vano dell ABI Prism 7900HT o dell ABI Prism 7900HT Fast Real-Time PCR System e procedere all avviamento della reazione come descritto dal manuale d uso dello strumento. Al termine dell amplificazione procedere all analisi, dopo aver preventivamente salvato la corsa, come di seguito descritto: 1. Impostare la linea di soglia: Impostare la modalità logaritmica per la rappresentazione delle curve di amplificazione. Impostare la linea di soglia nella zona dove i diversi profili di amplificazione risultano paralleli, cioè nella fase esponenziale di PCR. Passare alla modalità lineare e verificare che la linea di soglia precedentemente impostata si trovi nella fase geometrica di amplificazione. 2. Impostare la linea di base: In modalità lineare, impostare la linea di base 3 cicli prima del ciclo in corrispondenza del quale la linea di soglia incrocia la prima curva di amplificazione (ad es. se il Ct più piccolo è 25, impostare la linea di base a 22). 3. Esportare i dati in un file testo (TXT) e poi copiarli sul foglio di lavoro incolla del file excel GG-MM-AA SCREENING OGM.xls. 4. Analizzare i risultati: sul foglio di lavoro risultati del file excel GG-MM-AA SCREENING OGM.xls vengono riportati automaticamente i valori di Ct corrispondenti a ciascun pozzetto. o Verificare che i controlli negativi presentino un Ct 40. In caso contrario la prova deve essere ripetuta, eventualmente dopo aver effettuato una nuova estrazione di DNA. o Verificare l amplificazione del controllo LOD (controllo positivo).
BIOTECNOLOGIE pag 9 di 11 8.4 Verifica fogli di calcolo Con cadenza semestrale l affidabilità dei fogli di calcolo contenuti nel file excel SCREENING OGM.xls utilizzato nella presente procedura viene verificata mediante l analisi di una corsa test standard ad esito noto denominata SCREENING OGM monitor test. Tutta la documentazione relativa a tali verifiche è conservata nell area di lavoro 200 in un apposito raccoglitore denominato OGM Verifica dei fogli di calcolo. 9. Espressione dei risultati Sono considerati positivi i campioni che presentano un valore di Ct Ct LOD. I campioni che presentano Ct > del Ct LOD sono considerati negativi per la presenza del terminatore NOS. Esito Espressione del risultato 1 Ct campione > Ct LOD non rilevato terminatore NOS 2 Ct campione Ct LOD rilevato terminatore NOS I risultati dei replicati di estrazione devono essere concordanti. In caso contrario la prova deve essere ripetuta e se i risultati sono ancora discordanti, l esito deve essere espresso con la modalità 1 (non rilevato terminatore NOS). Nel caso 1 deve essere indicato il LOD. 10. Validazione del metodo I calcoli relativi alle fasi descritte in questo paragrafo sono riportati nel modulo Foglio di lavoro per la validazione/verifica della capacità del laboratorio nell applicazione dei metodi di prova e di taratura e stima dell incertezza di misura (VMSI POS VIR 003 INT) 10.1 Determinazione del LOD (limite di rivelazione) Per la determinazione del LOD non è possibile utilizzare il metodo IUPAC basato sul segnale del bianco + 3σ (Codex Alimentarius Commission CX/MAS 01/4; Eurachem guide: The fitness for purpose of Analytical Methods), in quanto, relativamente alle prove per la determinazione di OGM, non risulta disponibile un bianco con uno scarto tipo diverso da zero. Secondo le linee guida della ISO 24276:2006, il LOD corrisponde al più basso livello di analita (DNA bersaglio della reazione di PCR real time) in corrispondenza del quale lo scarto tipo relativo di riproducibilità (RSDR) è 33%. Nel nostro caso, ai fini di una validazione intralaboratorio, vengono utilizzati dati di ripetibilità (Eurachem Guide, 1998). Si opera come segue:
BIOTECNOLOGIE pag 10 di 11 Il DNA bersaglio estratto da materiali di riferimento viene diluito in TE in modo da ottenere una serie di diluizioni fino al raggiungimento di un numero di copie di DNA bersaglio compreso tra 1 e 10. Ciascuna diluizione viene esaminata in PCR real time in un numero di replicati 5. Vengono selezionati i livelli di concentrazione per i quali si sono ottenuti dei valori di Ct utili nel 100% dei replicati. Si ricava il Ct medio per ciascun livello utile di concentrazione e si calcola la retta di calibrazione Ct contro log (n. copie genomiche): Ct = a Log( n. copie) + b dove a è la pendenza e b l intercetta della retta di calibrazione. Dalla retta di calibrazione viene calcolato, per ciascun replicato, il numero di copie di DNA geneticamente modificato corrispondente al valore del Ct. Dal numero di copie di DNA geneticamente modificato per ciascun replicato viene calcolato il valor medio per livello di concentrazione ed il corrispondente scarto tipo; quindi si calcola lo scarto tipo relativo di ripetibilità (RSD r ): x = i n x i σ = i ( x x) i n 1 2 σ RSD r = 100 x dove x = numero di copie genomiche medio x i = numero di copie genomiche per il replicato i n = numero di replicati σ = scarto tipo RSD r = scarto tipo relativo di ripetibilità o coefficiente di variazione Una prima stima del LOD viene determinata come corrispondente al più basso numero di copie di DNA geneticamente modificato al quale lo scarto tipo relativo di ripetibilità (RSD r ) è risultato 33%.
BIOTECNOLOGIE pag 11 di 11 La procedura viene ripetuta integralmente in condizioni di ripetibilità o ripetibilità intermedia. Il LOD assoluto viene definito come almeno uguale al valore più alto tra le stime del LOD ricavate nelle ripetizioni della procedura. Come riportato nel VMSI POS VIR 003 INT, il LOD risulta pari ad almeno 35 copie di DNA GM calcolate in termini di genoma aploide (1C). 10.2 Specificità e sensibilità La specificità e la sensibilità sperimentale vengono verificate allestendo prove con campioni/materiali di riferimento positivi e negativi per la presenza di DNA contenente la sequenza del terminatore NOS e vengono calcolate tramite le seguenti formule: n. risultati. negativi Specificità (%): 100 VN n. risultati. positivi Sensibilità (%): 100 VP dove: VN = Veri Negativi = n. campioni non contenenti l analita VP = Veri Positivi = n. campioni contenenti l analita e risultano pari a: Specificità = 100% Sensibilità = 100%