Centro di Procreazione Medicalmente Assistita Diagnostica e Terapia in Laboratorio Dr. Giovanni Bracchitta
Ruolo del laboratorio di Fisiopatologia della Riproduzione nella diagnosi e terapia dell infertilit infertilità di coppia Diagnostica Specialistica P.M.A. di I livello (slow tech) I.V.F. II e III livello (High Tech)
Diagnostica Specialistica Spermiogramma di I livello L esame seminale non è un analisi con una lista di variabili, ma un insieme di variabili che vanno lette in maniera assolutamente integrata. esame chimico fisico concentrazione nemaspermica motilità nemaspermica vitalità nemaspermica morfologia nemaspermica longevità nemaspermica
Diagnostica Specialistica Liquido seminale (fluido biologico) Frazione liquida: plasma seminale Frazione corpuscolata componente nemaspermica componente non nemaspermica
Plasma seminale Secreto prostatico: Diagnostica Specialistica 15% - 30% dell eiaculato, biancastro, ph acido Ac. citrico, Zn, γ glutamiltranspeptidasi, fosfatasi acida. Secreto vescicolare: 50-80% dell eiaculato, giallastro, ph basico, vischioso Fruttosio, prostaglandine Secreto epididimario: Funzione di trasporto L - Carnitina, glicerosforil colina, alfa glucosidasi neutra
Macroscopiche: Diagnostica Specialistica Valutazioni caratteristiche reologiche dell eiaculato. Microscopiche: caratteristiche degli spermatozoi, caratteristiche delle cellule germinali immature caratteristiche delle cellule non nemaspermiche
Caratteristiche reologiche Aspetto: - normale (grigio opalescente) - acquoso (trasparente) - ematico (rossastro) - lattescente (biancastro) - pioide (giallastro pazienti con ittero assunzione di vitamine) Coagulazione: fisiologica, avviene ad opera di enzimi provenienti Liquefazione: dalle vescicole seminali (vesciculasi). - regolare: se completa dopo 10-60, ad opera di enzimi prostatici. - irregolare: se presenta zone di mancata fluidificazione. Viscosità: Diagnostica Specialistica - normale: il liquido si stacca goccia dopo goccia. - aumentata: si crea continuità tra le gocce > 2 cm = filanza. - diminuita: il liquido appare diluito, correla con l aspetto acquoso.
Diagnostica Specialistica Volume: normale > 2 ml ph: normale > 7.2 < 7 = si associa a patologia ostruttiva o a ipotrofie congenite o acquisite delle vescicole seminali. > 8 = si associa a flogosi.
Valutazione componente cellulare nemaspermica Concentrazione: normale > 20 milioni/ml Numero totale: normale > 40 milioni Motilità: sommatoria di un movimento oscillatorio lungo l asse ideale che passa per il centro della testa e uno rotatorio attorno a questo asse. A = rapida progressiva ( > 40 µm/sec ) B = lenta progressiva C = discinetica D = immobili Diagnostica Specialistica Normale: A + B > 50% A > 25%
Diagnostica Specialistica Morfologia: il maschio umano, insieme a qualche primato è l unico tra i mammiferi ad avere un grado così elevato di eterogeneità e pleiomorfismo dei suoi gameti. Normalità: > 30% di forme normali
Diagnostica Specialistica Anomalie della testa: Acefalia Macrocefalia Microcefalia Amorfa A punta
Diagnostica Specialistica Anomalie della testa: Piriforme Vacuolata A palla Doppia Nucleo decondensato Acrosoma ridotto
Diagnostica Specialistica Anomalie del collo: Angolato Spesso Inserzione asimmetrica Residuo citoplasmatico
Diagnostica Specialistica Anomalie della coda: Angolata Mozza Rigonfia Doppia Assente Arrotolata
Diagnostica Specialistica Cellule germinali immature: Spermatogoni (rari) Spermatociti I Spermatociti II (rari) Spermatidi Normali: < 10% popolazione nemaspermica
Diagnostica Specialistica Componente non nemaspermica: Leucociti < 1 milione/ml Emazie Cellule epiteliali Elemento tetranucleato (linea germinale)
Vitalità: : > 50% vivi Diagnostica Specialistica Agglutinazioni non specifiche ed aggregati
Valori normali? Riferimento Unità WHO 1987 WHO 1992 WHO 1999 Volume ml 2.0 2.0 2.0 2.0 ph 1-14 7.2 8 7.2 8 7.2 8 > 7.2 Concentrazione mil/ml 20 20 20 20 40 Spz Totali mil/eiac 40 40 40 Motilità % classe a 25 25 25 25 Motilità % classe a+b 50 50 50 50 WHO 2001 Morfologia % normali 50 30 30 (?) 15 Vitalità % dei vivi 75 75 50 50 < 1.0 Leucociti mil/ml < 1.0 < 1.0 < 1.0 Immunobead % spz - sfere < 10 0.0 < 50 < 50 Mar test % spz - emz < 10 < 10 < 50 < 50
Anamnesi: Professione: Astinenza: Volume: ph: Fluidificazione: Viscosità: Filanza: Odore: Agglomerati: Agglutinazioni: Cellule epiteliali: Batteri: Tricomonas: Eritrociti: Valutazione post liquefazione a 60 Numero di spermatozoi totali: Numero di spermatozoi totali per eiaculato: Numero spermatozoi mobili progressivi: Numero spermatozoi mobili progressivi per eiaculato: Cellule germinali immature: Leucociti: Valutazione motilità a 35 C % Spermatozoi Immobili Mobili totali Mobili progressivi Motilità tipo: D A +B + C A + B 1^ ora 2^ ora 4^ ora Vitalità: eosina test - swelling test Morfologia: % normali %anormali - Anomalie testa % - collo % - coda % Conclusioni:
Terminologia delle principali alterazioni seminali Normozoospermia: Oligozoospermia: Astenozoospermia: Teratozoospermia: Oligoastenoterato Azoospermia: Aspermia: eiaculato normale concentr. Spz inferiore ai parametri di rif. motilità inferiore ai valori di riferimento morfologia inferiore ai valori di riferimento alterazione di tutte le tre variabili assenza di spermatozoi nell eiaculato assenza di eiaculato
Immunologia Diagnostica Specialistica Gli spz. sono altamente antigenici e normalmente isolati tramite la barriera ematotesticolare. L interruzione di questa barriera anatomica e funzionale nei tubuli seminiferi può portare alla formazione di anticorpi. Mar test (IgG) Spermar test screening ( IgG ) IBT diretto ( IgA IgG)
Diagnostica Specialistica Biochimica del plasma seminale ( presenza, assenza, disfunzione e infezione delle ghiandole accessorie) Markers prostatici Fosfatasi acida Acido citrico Zinco Markers epididimari alfa glucosidasi neutra carnitina Markers vescicolari Fruttosio
Diagnostica Specialistica Volume ph Aspetto Spz Marker Vescicolare (Fruttosio) Marker Prostatici (Acido Citrico) Marker Epididimari (Carnitina) Azoospermia secretoria Normale Normale Trasparente Assenti Normale Normale Normale Ostruzione bilaterale dei dotti deferenti Normale Normale Trasparente Assenti Normale Normale Ridotti (di origine prostatica) Ostruzione o agenesia bilaterale dei dotti eiaculatori Ridotto Acido Lattescente Assenti Ridotti o Assenti Aumentati Ridotti Ostruzione bilaterale epididimaria Normale Normale Trasparente Assente Normale Normale Normale (testa) Ridotti (coda) Ostruzione dei dotti prostatici (rara) Ridotto Alcalino Giallastro Presenti Normale Assente o Ridotto Normale
Interazione muco - seme Diagnostica Specialistica Studio del muco cervicale Quantità, viscosità, cellularità, filanza, cristallizzazione, ph indicazioni circa la capacità di favorire la penetrazione degli spz Post coital test (test di Sims-Huhnner) (in vivo) - n di spz attivi nel muco, motilità, sopravvivenza Slide test (test di Kurzrok e Miller) (in vitro)
Diagnostica Specialistica Studio di funzione nemaspermica Test di decondensazione cromatinica Test di condensazione nucleare (blu di anilina) Test di eterogeneita cromatinica (arancio di acridina) Test di capacitazione e R.A. Studio dell integrità di membrana LPO-p Status metabolico (dosaggio dell ATP) correlano con la fertilizzazione
Spermiogrammi I Livello Pazienti esaminati: n n 380 2000-2002 Normali 21% Anormali 79%
Normalità in Seminologia 100% 50% - 2DS N +2DS I parametri WHO sono stati ottenuti mediante ampia rilevazione epidemiologica, essi indicano, non una normalità,, ma il limite inferiore probabilistico, al di sopra del quale un u individuo cade nella popolazione dei fertili. Le caratteristiche seminali, definibili come normali in senso gaussiano,, si discostano di molto dal minimo necessario per fecondare.
50 54 60 47 45 43 41 12,00 10,00 8,00 6,00 4,00 2,00 0,00 Età pazienti 2000-2002 33 35 37 39 Età 31 29 27 25 22 %
Età pazienti 2000-2002 % 12,00 10,00 8,00 6,00 4,00 2,00 0,00 50% 22 35 37 25 27 29 31 33 39 41 43 45 47 50 54 60 Età
Spermiogrammi I Livello range età 32-38 24% 76% Normali Anormali
Pazienti che non hanno eseguito mai un esame seminale range 32 38 anni 33% Si No 67%
Alta incidenza del fattore maschile Si deduce: Innalzamento dell età in cui si decide di volere il primo figlio Ritardo nell acquisizione di informazioni circa la propria condizione di capacità riproduttiva Si conclude: Un corretto iter diagnostico riduce alle coppie i tempi di attesa per una risposta concreta
Metodiche slow tech Inseminazione intrauterina (IUI) (selezione nemaspermica e pre-capacitazione) Valutazione Basale del seme: Almeno 10 milioni Spz totali 50% dotati di motilità rapida progressiva 30% dotati di morfologia normale Valutazione Post-Trattamento Volume: 0,1 0,5 ml 2-5 milioni di Spz con motilità rapida progressiva.
I.V.F. classica Metodiche High Tech Riproduce in vitro le condizioni fisiologiche della fecondazione e dello sviluppo embrionale Parametri Seminali Minimi richiesti per I.V.F. (dopo trattamento) > 1,5 milioni di spermatozoi mobili > 30 % normoconformati
Metodiche High Tech I.C.S.I. (intra cytoplasmatic sperm injection) Questa tecnica permette di iniettare un solo spz all interno dell ovocita. % di fertilizzazione ovocitaria 50 70% Il rischio di danneggiare irrimediabilmente l ovocità è del 5%
INDICAZIONI ALLE DIFFERENTI TECNICHE DI PMA IN FUNZIONE DELLA QUALITA SEMINALE IUI NORMOZOOSPERMIA MODERATA DISPERMIA GIFT IVF ICSI SEVERA OAT < 500.000 ASSENZA FERTIL. FIVET AZOOSPERMIE VARIE ACINESIA STERILITA IMMUN. SPZ CRIOCONSERVATI ANOMAL. ULTRASTRUTTURALI
Stadi I.V.F. Day 0 Recupero ovocitario Produzione seme Preincubazione Preincubazione Valutazione Trattamento Insemination medium No Glucosio Fosfati AA non essenziali Glutammina Inseminazione (FIVET ICSI)
Stadi I.V.F. Day 1 Osservazione avvenuta fecondazione 16-18 ore dall inseminazione Transfer Crioconservazione Sviluppo embrionale
Stadi I.V.F. Day 2 EMBRIONE A 4 CELLULE
Stadi I.V.F. Day 3 EMBRIONE A 8 CELLULE Cleavage medium Glucosio AA essenziali AA non essenziali Piruvato vitamine EDTA Stadi I.V.F. Day 5-65 BLASTOCISTI
Metodiche High Tech Microchirurgia embrionale Biopsia per diagnosi preimpianto
Pitting Metodiche High Tech Microchirurgia embrionale
Assisted Hatching Metodiche High Tech Eccessivo spessore della zona pellucida (> 15 micron) Mancato impianto a seguito di transfer ripetuti Alto grado di frammentazione degli embrioni Lento timing di segmentazione Età della paziente > 38 anni Transfer da scongelamento
Metodiche High Tech M.E.S.A. (Microsurgical Epididymal Sperm Aspiration) Azoospermia ostruttiva Te.S.E. (Testicolar Sperm Extration) Ridotta produzione di spz da parte del testicolo Te.S.A. (Testicolar Sperm Aspiration) Crioconservazione
Nostra casistica Anno 2002 Cicli PMA completati Gravidanze cliniche Gravidanze on - going N 19 5 4 % 100 26 21
Nostra casistica Anno 2002 Timing N % Ovociti prelevati Day 0 120 100 Zigoti 2 pn Day +1 87 72,5 Embryo (6-8 cell) Day + 3 81 93
Grazie per l attenzionel