ELISA Human Mannose Binding Lectin ELISA kit REF M1990

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it I. Introduzione La lectina legante il mannosio (Mannose binding lectin - MBL), conosciuta anche come proteina legante il mannosio o proteina legante il mannano, è un fattore importante nell immunità ereditaria. La MBL appartiene alla classe delle collectine, superfamiglia della lectina di tipo C, la cui funzione è il riconoscimento nei meccanismi immediati di difesa nell ospite pre-immune. La MBL riconosce i diversi carboidrati presenti sulla superficie di numerosi microrganismi patogeni, tra cui batteri, virus, protozoi e funghi (1,2,3). Il legame MBL microrganismo induce l attivazione della via classica del complemento molto prima che si formino anticorpi specifici. La MBL ha una struttura oligomerica (400-700 kda), formata da subunità a loro volta costituite da tre catene peptidiche identiche, ognuna di 32 kda. Sebbene la MBL sia in grado di formare diversi oligomeri, è stato visto che i dimeri ed i trimeri non sono biologicamente attivi e, per l attivazione del complemento, è necessario almeno un tetrametro. Le catene peptidiche sono formate da una parte di lectina e da una parte simile al collagene. La parte di lectina si lega via sito di riconoscimento dei carboidrati a diversi zuccheri quali: mannosio, maltosio, N-acetilglucosammina, N-acetilgalattosamina, fucosio e glucosio. Il legame ha una bassa affinità (Kd 10-3 ) e, affinché sia funzionale, è fondamentale che più lectine di una molecola di MBL si leghino simultaneamente (4). In circolazione, la MBL forma un complesso funzionale con le serinaproteasi associata alla MBL (MBL-associated serine protease - MASPs ) 1, 2 e 3 che, dopo il legame con un microrganismo, diventa enzimaticamente attivo. La MASP-2 è identica all esterasi-c1 nella via classica del complemento ed è in grado di scindere C4 e C2, formando C4b2a. C4b2a agisce come una C3-convertasi scindendo C3, formando C3b ed inducendo in questo modo l opsonizzazione del microrganismo (2). Inoltre, si è visto che la MBL si lega direttamente ai recettori della collectina sulla superficie dei fagociti e si ipotizza che la stessa sia in grado di legarsi al recettore C1q presente su granulociti neutrofili, monociti e macrofagi. Il legame con cellule effettrici può stimolare la produzione di citochine infiammatorie. La MBL è una proteina della fase acuta ed è sintetizzata dagli epatociti. Subito dopo il parto, la concentrazione plasmatica della MBL passa da 1000 ng/ml ad un massimo di 2500 ng/ml entro poche settimane, dopo di che scende progressivamente fino ad arrivare a 1700 ng/ml negli adulti. Le concentrazioni individuali di MBL variano notevolmente e possono aumentare fino a 20 volte durante la reazione dell infiammazione acuta. In quanto parte del sistema immunitario innato, la MBL è importante nel periodo che segue il parto, quando la concentrazione degli anticorpi materni diminuisce e deve cominciare la produzione di IgG del neonato. In aggiunta, la MBL gioca un ruolo importante ad ogni età durante le prime fasi di contatto con il microrganismo, prima dell aumento della concentrazione di IgM. Rilevanza clinica della MBL L incidenza del deficit di MBL è relativamente elevata se confrontata con altre carenze del sistema del complemento e riguarda il 20 25% circa della popolazione totale. Il deficit di MBL è associato ad una maggiore suscettibilità ad infezioni quali otite media, polmonite, gastroenterite, meningite, osteomielite e sepsi. Nei bambini, una mutazione eterozigote del gene della MBL raddoppia il rischio di ospedalizzazione dovuto a malattie infettive rispetto a bambini con livelli di MBL normali. In caso di mutazione omozigote del gene, il rischio di infezioni è anche maggiore ed il decorso della malattia è peggiore rispetto a quanto si verifica in pazienti con livelli di MBL normali. I pazienti affetti da fibrosi cistica con una mutazione nel gene MBL sono più suscettibili alle infezioni da Pseudomonas aeruginosa o Burkholderia cepacia ed hanno una minore aspettativa di vita rispetto ai pazienti affetti da fibrosi cistica senza la suddetta mutazione (5). Pazienti oncologici sottoposti a chemioterapia e che, conseguentemente a ciò, sviluppano neutropenia, sono più suscettibili a lunghi periodi di febbre se hanno una bassa concentrazione di MBL. In bambini al di sotto di un anno affetti dalla malattia di Kawasaki, l eventuale carenza di MBL costituisce un fattore di rischio per aneurismi delle coronarie. In pazienti positivi all HIV la progressione dell AIDS è più veloce in caso di deficienza di MBL. Il deficit di MBL è associato al verificarsi di aborti spontanei ricorrenti dovuti, verosimilmente, ad infezioni intrauterine. La carenza di MBL è associata ad autoimmunopatie quali il Lupus eritematoso sistemico (LES) e l Artrite reumatoide (AR). La correlazione tra il deficit di MBL e l incidenza sia delle malattie infettive che delle autoimmunopatie non ha portato solo ad un aumento dei prodotti diagnostici per la MBL ma ha anche dimostrato la necessità di applicazioni terapeutiche di MBL purificate. II. Riferimenti tecnici Il saggio è un test ELISA effettuato in piastre con micropozzetti rivestiti di mannano. La MBL, contenuta in un volume noto di campione o nel calibratore, si legherà al mannano del rivestimento della micropiastra. Il reagente in eccesso è rimosso con il lavaggio. Successivamente, si aggiunge un anticorpo anti-mbl umana coniugato alla perossidasi di rafano (horseradish peroxidase - HRP) (anti MBL/1 umana HRP). Anche in questo caso il reagente in eccesso è eliminato con i lavaggi al termine dei quali viene aggiunta ai pozzetti la soluzione di substrato. Il colore che si sviluppa è proporzionale alla quantità di MBL presente nel campione o nel calibratore. La reazione enzimatica è arrestata chimicamente e l intensità del colore è letta a 450nm in un lettore ELISA. La concentrazione della MBL può essere determinata per interpolazione con i valori di assorbanza relativi ai campioni sulla curva di calibrazione. III. Conservazione e stabilità Conservare il kit ELISA per la determinazione della MBL a temperature comprese tra -18 C e -32 C. Il rendimento del kit è garantito fino alla data di scadenza riportata sull etichetta della confezione. Le condizioni di trasporto possono differire dalle condizioni di conservazione. Non congelare e scongelare più di tre volte. IV. Contenuto del kit Il kit ELISA per la determinazione della MBL contiene reagenti sufficienti per 288 test (tre piastre), compreso i calibratori, il controllo ed il bianco. Vedere la tabella alla fine del foglietto illustrativo. Il mannano utilizzato per rivestire i pozzetti è purificato dal lievito Saccharomyces cerevisiae. L anticorpo monoclonale è stato purificato da asciti o da terreni di coltura mediante tecnica cromatografica (cromatografia a scambio ionico e cromatografia di affinità). Il calibratore ed il controllo sono costituiti da siero umano. 2

V. Altro materiale richiesto Altro materiale: Acqua distillata per la diluizione dei tamponi di lavaggio, di diluizione e del substrato. Becher, beute e cilindri necessari per la preparazione dei reagenti. Pipette in grado di garantire una distribuzione accurata dei volumi. Un dispositivo standard per il lavaggio delle piastre ELISA o una bottiglia di plastica a spruzzo da 500 ml per il lavaggio automatico o manuale delle strisce. Un lettore ELISA standard per la misurazione dell'assorbanza a 450 nm. Foglio logaritmico lineare. Altri tamponi e soluzioni: Tampone del rivestimento: tampone carbonato/bicarbonato 0,1 M, ph 9,6 Tamponi e soluzioni per lo sviluppo enzimatico del colore: Tampone del substrato: tampone acetato 0,11 M, ph 5,5 Dissolvere 15,0 g di acetato di sodio (CH3COONa.3H2O ) in 800 ml di acqua distillata. Aggiustare il ph a 5,5 con acido acetico glaciale, portare il volume ad 1 litro con acqua distillata. Non aggiungere conservanti (ad esempio mertiolato, sodiazide) in quanto questi potrebbero compromettere lo sviluppo enzimatico del colore. Soluzione stock di 3,5,3',5'-tetrametilbenzidina (TMB): 6 mg/ml di TMB in DMSO. Dissolvere 30 mg di 3,5,3',5'-tetrametilbenzidina (TMB) in 5 ml di dimetilsulfossido (DMSO). Soluzione stock di perossido di idrogeno: soluzione di H2O2 al 3% in acqua distillata. Soluzione bloccante: soluzione di H2SO4 1,8 M in acqua distillata. Per una micropiastra preparare 12 ml di soluzione di substrato miscelando: 12 ml di tampone del substrato 200 μl di soluzione stock di TMB 12 μl di soluzione stock di H2O2 VI. Trattamento dei campioni da analizzare I campioni ematici devono essere raccolti asetticamente. I campioni di siero sono preferibili ma per il test possono essere utilizzati anche campioni di plasma con eparina o EDTA come anticoagulante. In caso di utilizzo di plasma, aggiungere al tampone di diluizione 10 U/mL di eparina. I campioni devono essere quanto più freschi possibile o devono essere conservati congelati. VII. Protocollo del saggio - Scongelare i reagenti lo stesso giorno in cui si desidera effettuare il saggio, portarli a temperatura ambiente (18-25 C) e miscelarli delicatamente. Evitare la formazione di bolle o di schiuma. Il tampone di diluizione concentrato 5 volte può essere posto in un bagno termostatato a 37 C e miscelato regolarmente. Il calibratore ed il controllo possono essere scongelati tenendoli tra le mani. Prima dell uso, centrifugare tutte le provette contenenti i reagenti (1 minuto a 3000g). Si consiglia di analizzare in doppio tutti i campioni, il controllo e le diluizioni del calibratore. Nella tabella 4 del foglietto illustrativo accluso è possibile trovare un possibile schema di caricamento della piastra. Micropiastre Il kit contiene tre micropiastre. Il numero di piastre da rivestire con mannano (il giorno prima di quello in cui si intende effettuare il test) dipende dal numero di campioni da analizzare. In questo kit il mannano è fornito concentrato 100 volte. Il tampone di rivestimento deve essere preparato fresco. Per ogni micropiastra, aggiungere 120 μl della soluzione di mannano a 12 ml di tampone di rivestimento. Dispensare 100 μl di questa soluzione in ogni pozzetto, coprire la/le micropiastra/e con il coperchio ed incubare tutta la notte a temperatura ambiente (18 25 C). Tamponi Calcolare la quantità di tampone di lavaggio necessaria e preparare una soluzione alla concentrazione di lavoro diluendo il tampone 20 volte in acqua distillata (per ogni piastra servono circa 300 ml di tampone). Il tampone di lavaggio diluito deve essere conservato a 2-8 C ed è stabile per 1 settimana. Tampone di diluizione: calcolare la quantità di tampone di diluizione necessaria e preparare una soluzione alla concentrazione di lavoro diluendo il tampone 5 volte in acqua distillata. Preparazione del calibratore e del controllo (in duplicato) Per le concentrazioni vedere le tabelle 2 e 3 riportate nel foglietto illustrativo accluso. Scongelare il calibratore ed il controllo tenendoli in mano e miscelarli delicatamente. Etichettare quattro provette, due per il controllo (in doppio) e due per il punto di calibrazione più elevato (350 ng/ml) (in doppio). Calibratore: per la preparazione del punto di calibrazione più elevato, consultare la tabella 1 riportata nel foglietto illustrativo accluso. Etichettare 8 provette, una per ogni diluizione della curva di calibrazione (in doppio): 140; 56; 22,4 e 9,0 ng/ml. Successivamente, pipettare nelle provette 150 μl di tampone di diluizione. Trasferire 100 μl di soluzione dalla provetta contenente il punto di calibrazione più elevato al secondo tubo, etichettato 140 ng/ml, e miscelare accuratamente. Ripetere la diluizione seriale altre tre volte aggiungendo 100 μl di soluzione della precedente provetta contenente il calibratore diluito ai 150 μl di diluente nei tubi etichettati. La curva di calibrazione conterrà 350; 140; 56; 22,4; 9,0 ng/ml (in doppio). Utilizzare il tampone diluito per determinare il valore del bianco (0 ng/ml). 3

Controllo: pipettare 380 μl di tampone di diluizione alla concentrazione di lavoro nelle provette per il controllo (in doppio), aggiungere 20 μl del controllo e miscelare con cura. Preparazione dei campioni Diluire i campioni da analizzare 1:20 nel tampone di diluizione, analogamente a quanto fatto per il siero di controllo. In caso di risultati che ricadono al di fuori degli intervalli stabiliti (vedere la tabella 1 contenuta nel foglietto illustrativo accluso) ripetere il test con una diversa diluizione del campione. 1. Primo lavaggio Aspirare la soluzione di mannano dai pozzetti della/delle micropiastra/e, riempire completamente i pozzetti ( 300 µl) con il tampone di lavaggio e successivamente eliminarlo; ripetere la procedura tre volte. Alla fine, i pozzetti devono essere completamente vuoti. Aggiungere immediatamente il reagente successivo evitando che i pozzetti restino asciutti per tempi prolungati. 2. Prima incubazione Aggiungere 100 µl dei calibratori diluiti, del controllo e dei campioni nei pozzetti appropriati. Coprire la piastra con il sigillante adesivo ed agitare con cautela picchiettando sul bordo della micropiastra per pochi secondi in modo da mischiare il contenuto di ogni pozzetto. Incubare per 1 ora a temperatura ambiente (18-25ºC). Subito prima dei lavaggi, preparare il reagente per la successiva incubazione così come descritto al punto 4. 3. Secondo lavaggio Aspirare il surnatante dai pozzetti e lavare la piastra come descritto al punto 1. 4. Incubare con anti MBL umana-hrp. Diluire l anticorpo coniugato 1:100. Per ogni micropiastra, aggiungere 120 μl di coniugato HRP a 12 ml di tampone di diluizione. Aggiungere 100 μl di questa soluzione ad ogni pozzetto. Coprire la piastra con il sigillante adesivo ed agitare con cautela picchiettando per pochi secondi in modo da mischiare il contenuto di ogni pozzetto. Incubare per 1 ora a temperatura ambiente (18-25ºC). Subito prima dei lavaggi, preparare il reagente per la successiva incubazione (substrato TMB) così come descritto al punto V (Altro materiale richiesto). 5. Terzo lavaggio Aspirare il surnatante dai pozzetti e lavare la piastra come descritto al punto 1. 6. Incubazione con substrato TMB Aggiungere 100 μl di soluzione del substrato TMB a tutti i pozzetti. Agitare con cautela picchiettando sul bordo della micropiastra per pochi secondi in modo da mischiare il contenuto di ogni pozzetto. Incubare per 30 minuti al massimo a temperatura ambiente (18-25ºC), al buio. Nota: la velocità di sviluppo della colorazione enzimatica è influenzata da molti fattori, tra cui la temperatura e la qualità del TMB utilizzato. 7. Arresto della reazione enzimatica Aggiungere 100 µl di soluzione bloccante a tutti i pozzetti. 8. Lettura della piastra Leggere entro 30 minuti a 450 nm in un lettore ELISA. VIII. Risultati ed interpretazione dei dati Registrare l'assorbanza a 450 nm per ogni pozzetto e fare la media delle letture in doppio. Per ogni campione, le due letture non devono differire più del 15% dal valore medio. Se almeno una delle due letture differisce di più il test deve essere ripetuto. Sul foglio logaritmico lineare, riportare i valori medi di assorbanza dei calibratori sull'asse delle y, la concentrazione della MLB (in ng/ml) sull'asse delle x e tracciare la curva più adatta. I livelli di MBL nel controllo devono ricadere all'interno dell'intervallo(i) illustrato nella tabella 3 contenuta nel foglietto illustrativo accluso. Interpolare i valori medi di assorbanza relativi ad ogni campione sulla curva di riferimento. I campioni con un valore medio di assorbenza che ricade all'esterno dell'intervallo delimitato dalla curva di riferimento devono essere diluiti in modo appropriato. IX. Intervalli dell'analisi Per gli intervalli di saggio specifici consultare la tabella 1 contenuta nel foglietto informativo accluso. X. Intervalli di riferimento Misurazioni effettuate in un gruppo di donatori sani normali in Olanda (n=244) hanno identificato i seguenti valori di MBL: percentile 10% percentile 25% percentile 50% percentile 75% percentile 90% <0,04 μg/ml 0,4 μg/ml 1,1 μg/ml 2,0 μg/ml 3,3 μg/ml Siccome gli intervalli di riferimento sono soggetti a molte variabili che possono differire da una popolazione analizzata all altra, si consiglia ad ogni laboratorio di determinare il proprio intervallo. XI. Caratteristiche specifiche di funzionamento Riproducibilità Variazione all interno del saggio: due diverse diluizioni di un campione di siero sono state analizzate undici volte ognuna in un unico saggio. Variazione inter-saggio: la concentrazione di MBL di tre diversi campioni di siero è stata determinata in 6 10 saggi diversi. 4

Intra-saggio Media Variazione Diluzione 1 (1:10) Diluzione 2 (1:50) 1,46 μg/ml 1,53 μg/ml 6,0% 6,1% Inter-saggio Media Variazione Campione 1 Campione 2 Campione 3 1,52 μg/ml 1,49 μg/ml 1,60 μg/ml Nota I valori riportati per le caratteristiche specifiche di funzionamento del test rappresentano risultati tipici e non devono essere considerati specifici per questo kit. 7,9% 4,8% 11,2% Sensibilità La concentrazione minima di rilevazione del kit è di 9,0 ng/ml mentre l intervallo di concentrazione misurabile è da 9,0 a 350 ng/ml. Nota: i valori riportati per la sensibilità del test rappresentano risultati tipici e non devono essere considerati specifici per questo kit. Specificità L assenza di reazione incrociata con altre componenti del plasma o del siero è confermata dal fatto che, per alcuni donatori deficienti di MBL ma normali per tutti gli altri aspetti, è possibile ottenere letture praticamente pari a zero. Valori attesi Vedere il punto X (Intervalli di riferimento). XII. Limitazioni 1. L'utente deve essere istruito e deve familiarizzare con la tecnica ELISA e con la procedura dell'analisi. 2. Non utilizzare campioni molto emolizzati o lipemici. Campioni contenenti fattori reumatoidi, livelli alti di bilirubina o altri immunocomplessi circolanti possono dare risultati inattesi. Analizzare questi campioni con metodi diversi. 3. I campioni che ricadono all esterno dell intervallo devono essere analizzati nuovamente utilizzando diluizioni diverse. 4. Un risultato che evidenzia un livello ridotto di MBL non può mai considerarsi una diagnosi definitiva. Al contrario, esso deve essere considerato l'indicazione di un disturbo a carico del sistema immunitario che richiede ulteriori ricerche diagnostiche. 5. Utilizzare sempre il siero di controllo per verificare la validità della curva di calibrazione. Quando il controllo ricade al di fuori dell'intervallo, i risultati del test non sono attendibili. Il test deve essere ripetuto. 6. I reagenti di lotti differenti non sono interscambiabili. 7. Non miscelare residui di reagenti (p.e. volume morto) con il contenuto di flaconcini appena aperti. 8. I tappi ed i flaconcini non sono interscambiabili. Rimettere il tappo sul flaconcino corrispondente. 9. Sebbene il calibratore umano ed i sieri di controllo siano stati testati per i marcatori di agenti specifici di trasmissione di patologie, secondo le linee guida UE per le GMP, e siano stati trovati non reattivi, tutti i componenti di origine umana devono essere considerati potenzialmente infettivi. 10. Conservante: mertiolato 0,001%. 11. Nel corso dell'esperimento ELISA, utilizzare un nuovo sigillante per ogni fase di incubazione/fissazione per evitare contaminazioni incrociate. Non utilizzare fogli di alluminio. 12. Utilizzare puntali per pipette monouso per ogni trasferimento per evitare contaminazioni incrociate. 13. Preparare diluizioni fresche dei calibratori, del coniugato e dei tamponi ogni volta che si utilizza il kit. 14. Non utilizzare reagenti o micropiastre diversi da quelli forniti con il kit. 15. La sodiazide inattiva l'hrp; non utilizzare soluzioni contenenti sodiazide; non aggiungere sodiazide ai tamponi forniti. Non utilizzare mertiolato in quanto questo potrebbe compromettere la qualità dello sviluppo enzimatico del colore. 16. Eseguire lo smaltimento dei rifiuti nel rispetto delle normative interne di laboratorio. 17. Nel corso delle fasi di incubazione non lasciare i pozzetti scoperti ed evitare che restino asciutti per periodi prolungati. XIII. Bibliografia 1. Turner, M.W. (1996) Immunol Today 17:532-540 2. Gadjeva, M. Thiel, S. Jensenius, J.C. (2001) Curr Opin Immunol 13:74-78 3. Klabunde, J. et al (2002) Parasitol Res 88(2):113-117 4. Thielens, N.M. et al (2001) J Immunol 166:5068-5077 5. Garred, P. (1999) J Clin Invest 104:431-437 ELISA Human Mannose Binding Lectin ELISA kit 1 375 μl COAT MANNAN STOCK 1:100 1 500 μl CAL 1 200 μl CONTROL 1 375 μl HRP MOU Ab HUM MBL CONJ 1:100 1 50 ml BUF DIL STOCK 1:5 1 60 ml BUF WASH STOCK 1:20 3 12x8 WELL 10 SEALS 5