[P] Velocità iniziale (V 0 ) CINETICA ENZIMATICA - velocità di reazione + + k 1 E + S ES ES E + P k 2 k 3 k 4 V = d[p]/dt = k 3 [ES] Velocità iniziale (V 0 ) quando [S] >> [P] V max t
CINETICA ENZIMATICA: Condizioni iniziali e stato stazionario CONDIZIONI INIZIALI: t 0 [P] 0, k 4 0 VELOCITÀ DI CATALISI: v = k 3 [ES] eq. 1 CONDIZIONI SATURANTI: [S] è alta, tutti i siti attivi sono occupati, [ES] [E] tot v V max = k 3 [E] tot {k 3 k cat } eq. 2 CONDIZIONI SUBSATURANTI: i siti attivi sono solo parzialmente occupati k 1 E + S ES E + P k 2 d[es]/dt = k 1 [E][S] - (k 2 + k 3) [ES] (velocità formazione velocità rimozione) k 3 k 4 STATO STAZIONARIO: all inizio della reazione d[es] = 0, k 1 [E][S] = (k 2 + k 3 ) [ES] [E][S] k 1 [E][S] k 1 [E][S] ES] = (k 2 + k 3 ) = (k 2 + k 3 ) /k 1 = K M eq. 3 M
CINETICA ENZIMATICA: L equazione di Michaelis-Menten La K M indica l affinità dell enzima per il substrato affinità K M Se k 1 (costante di velocità di associazione) >> k 2 e k 3 (costanti di velocità di dissociazione e reazione) K M = (k 2 + k 3 )/k 1 k 1 K M La K M indica la [S] alla quale l attività dell enzima diventa significativa in natura K M varia da 10-1 a 10-7 M Il V max è raggiunto quando [ES] [E] tot, (tutto l enzima è complessato), poiché la velocità di formazione di P è proporzionale a [ES] (eq.1) (questa è una situazione avvicinabile ma non raggiungibile). Derivazione di V max In condizioni fisiologiche: se [S] >> [E] ne deriva che [S] >> [ES] e quindi [S] [S] tot (nelle condizioni iniziali)
[E] tot = [E] + [ES] [E] = [E] tot - [ES] (eq. 3) [ES] = [E][S] = ([E] tot - [ES])[S] = [E] tot [S] [ES] [S] K M K M K M K M [ES] K M = [E] tot [S] [ES] [S] [ES] K M + [ES] [S] = [E] tot [S] [ES] (K M + [S]) = [E] tot [S] [ES] = [E] tot [S] eq. 4 (K M + [S]) (eq. 1) Sostituendo in v = k 3 [ES] si ha v = k 3 [E] tot [S] eq. 5 (K M + [S]) siccome k3 [E] tot = Vmax (eq. 2), si ottiene Questa è l equazione di Michaelis-Menten M eq. 6 v = velocità iniziale; V max = velocità massima; [S] = conc. substrat.; K M = costante di Michaelis
L equazione di Michaelis Menten è valida per enzimi non-allosterici È valida se: 1) [E] << [S] i ; 2) [P] i 0 ; 3) d[es]/dt 0 (stato stazionario); 4) T, ph, ecc. sono costanti V max non è raggiungibile, ma alla [S] che v = V max 2 ½V max quindi K M = [S] alla quale v = ½V max In altre parole, K M = [S] alla quale metà dei siti attivi dell enzima sono occupati
In condizioni saturanti [S] >> K M ; (K M + [S]) [S] v V max in modo asintotico e la velocità diventa indipendente da [S] In condizioni subsaturanti, se [S] << K M V max [S] v K M ed è proporzionale alla [S] V max v L equazione di Lineweaver-Burk se consideriamo il reciproco di v eq. 7 1 V max Questa equazione descrive una relazione lineare e ci permette di determinare V max e K M -1 K M
Possiamo ora considerare alcuni casi che corrispondono a diverse condizioni di reazione: Caso 1 : k 1, k 2 >> k 3 cioè, l associazione e la dissociazione sono i passi limitanti K M = (k 2 + k 3 )/k 1 k 2 / k 1 K D la costante di dissociazione Caso 2 : k 2 << k 3 e siamo in condizioni subsaturanti ([S] < K M ; [ES]<< [E] [E] tot ) (enzima efficiente) [E][S] [E][S] [E] tot [S] dalle eq. 1 v = k 3 [ES] e 3 [ES] = v = k 3 v = k 3 K M K M K M k 3 / K M = k 3 k 1 /(k 2 + k 3 ) k 3 k 1 /(k 3 ) = k 1 v = k 1 [E] tot [S] Per un enzima molto efficiente il prodotto si forma immediatamente dopo la formazione del compleso ES (avviene ad ogni incontro) e P la velocità di reazione è limitata solo dalla velocità di diffusione (10 8-10 9 M -1 s -1 in soluzioni acquose). L enzima ha raggiunto la perfezione cinetica. La velocità di diffusione può essere superata solo in complessi enzimatici multifunzionali S 3 S 2 S
ATTIVITÀ ENZIMATICA unità di attività L attività dell enzima (E) è una misura della sua capacità di promuovere la trasformazione del Substato a Prodotto DIVERSE UNITÀ DI ATTIVITÀ ENZIMATICA IU (International Unit): 1 IU = quantità di enzima che promuove la trasformazione di 1 mole di S in 1 min. a T ambiente. Attività specifica: Katal: = N di IU/mg di proteina (in condizioni definite) 1 katal = 1 mol/sec (normalmente espresso in nkatal) N di turnover: = moli di S trasformati per minuto per moli di enzima FATTORI CHE INFLUISCONO SULL ATTIVITÀ ENZIMATICA Temperatura ph [substrato] Inibitori/attivatori [enzima]
Saggi di attività Per determinare la velocità di reazione in presenza di un enzima, è necessario misurare la variazione di un determinato parametro correlato con [S] o [P] (es. assorbanza, intensità di fluorescenza, radioattività ecc ) con il tempo. v 0 [S] = 1 mm MM V MAX v 0 [S] = 0.5 mm v 0 [S] = 0.2 mm v 0 [S] 0.5 1 mm LB 1/v 0 1/V max -1/K M 1 2 1/[S] 5 mm -1
Esempio di un saggio enzimatico Determinazione del K M per l alcol deidrogenasi (AD) di lievito utilizzando il metodo di Lineweaver-Burk AD CH 3 CH 2 OH + NAD + CH 3 CHO + NADH + H + Si segue la produzione di NADH spettrofotometricamente ( A = c l ; A [P] ) A = [ NADH ] 1 da/dt d[ NADH ]/dt v [S] 1/[S] v 1/v (mm) (mm -1 ) (mm/s) (mm -1 s) 586 0.0017 0.06 16.8 58.6 0.017 0.054 18.5 11.7 0.086 0.035 28.2 5.86 0.17 0.029 39.0 3.84 0.26 0.024 47.5 NB: Scegliere gli assi correttamente Fare attenzione alle unità di misura Fare attenzione all ordine di grandezza 1/K M = -0.12 K M = 8.2 mm - 0.1 1/v 60 mm -1 s -1 Rendersi conto che i dati sperimentali normalmente non sono esatti 40 20 1/V max = 16.5 mm -1 s 1/[S] 0.1 mm -1 0.2
Cinetica enzimatica in presenza di inibitori Inibitori REVERSIBILI: - interazione non-covalente; gli inibitori COMPETITIVI diminuiscono k 1 gli inibitori NONCOMPETITIVI diminuiscono k 3 k 1 S ES P k 2 k 3 k 4 Inibitori IRREVERSIBILI: interazione covalente o non-covalente ma molto forte
Inibizione competitiva E ES E + P k 6 k 5 k 1 S k 2 k 3 k 4 EI Allo stato stazionario: k 5 [E][ I ] = k 6 [ EI ] K i = k 5 /k 6 eq. 3 [ES] = [E] [S] analogamente [EI] = [E] [I] eq. 8 K M K I [E] tot = [E] + [ES] + [EI] e quindi sostituendo in eq. 3 ed eq. 8 e riarrangiando [E] = K I K M [E] tot (K I K M + K I [S] + K M [I]) eq. 9
Inibizione competitiva (cont.) Dalle equazioni v = k 3 [ES] (eq.1) V max = k 3 [E] tot (eq.2) e [ES] = [E][S] (eq.3) K M troviamo che v = k 3 [E][S] e sostituendo per [E] usando eq. 9 K M v = k 3 K I K M [E] tot [S] = V max K I [S] K M (K I K M + K I [S] + K M [ I ]) (K I K M + K I [S] + K M [ I ]) riarrangiando v = V max [S] una variante dell eq. MM con [S] + K M ( 1 + [ I ]/K I ) K M modificata in base a [I] e K I Trovando l inverso di V si ottiene una variante dell equazione di LB : 1 1 K M 1 [ I ] = + 1 + v V max V max [S] K I
Inibizione noncompetitiva S E ES E + P I I EI S ESI In questo caso si può formare un complesso enzima/substrato/inibitore Più che diminuire l accesso del substrato al sito catalitico diminuisce l efficienza di catalisi stessa 1 1 K M [ I ] = + 1 + v V max V max [S] K I una variante dell eq. LB con tutta l ed. modificata in base a [I] e K I
INIBITORI COMPETITIVI INIBITORI NONCOMPETITIVI 1 1 K M [ I ] = + 1 + v V max V max [S] K I
prodotto saggi di inibizione enzimatica [S] costante v 0 v 0 v 0 [ I ] = 0 mm [ I ] = 0.01 mm [ I ] = 0.05 mm v 0 V 0 2 IC 50 = [ I ] che dimezza la velocità iniziale [ I ] = 0.1 mm tempo IC 50 0.05 [ I ] 0.1 mm per inibitori COMPETITIVI che legano strettamente all enzima, l IC 50 è correlato alla costante di inibizione K i dall equazione: [S] IC 50 = ½ [E] + K i 1 + K m K i è universale, IC 50 è relativo, dipende dalle condizioni e soprattutto da [E] Per calcolare Ki : Diversi tipi di inibitori e condizioni: http://botdb.abcc.ncifcrf.gov/toxin/kiconverter.jsp http://botdb.abcc.ncifcrf.gov/botdb/toxin/equations.html
PURIFICAZIONE DI ENZIMI PARAMETRI IMPORTANTI: Qualità, Quantità, Costo Si procede frazionando mediante opportuni metodi di purificazione. L'enzima dovrebbe concentrarsi in una sola frazione (dove la quantità di enzima aumenta rispetto ad altre proteine). Ogni successivo passaggio di purificazione dovrebbe tenere in considerazione i seguenti criteri: 1) Resa più alta possibile: resa = 2) Il grado di purificazione grado = 3) l'attività specifica attività = attività dell enzima nella frazione purificata attività dell enzima nella preparato originale attività specifica della frazione attività specifica della preparazione originale unità di enzima nella frazione quantità totale di proteina nella frazione Passaggio Proteina totale (mg) Attività totale (nmol/min) Attività specifica [(nmol/min)/mg] Grado di purificazine Resa (%) (come attività) prelievo siero 6420 7200 1.1 1 100 (NH 4 ) 2 SO 4 (ppt) 2750 6120 2.2 2 85 LC Scambio ionico 54 3483 64.5 54 48 LC Hydroph.Int. 8.5 2665 313.5 285 37 LC Gel permeazione 1.7 1524 896 814 21 LC Fase inversa 0.029 376 12965 11786 5.2