Relazione Finale. Titolo Ricerca: Analisi genetica di popolazioni ibridogene di noce (Juglans regia x Juglans nigra)

Ri.Selv.Italia Sottoprogetto 1.1 BIODIVERSITÀ E PRODUZIONE DI MATERIALE FORESTALE DI PROPAGAZIONE Responsabile scientifico Fulvio Ducci (Istituto Sperimentale Selvicoltura, Arezzo) Scheda n. 1.1.17 Relazione Finale Titolo Ricerca: Analisi genetica di popolazioni ibridogene di noce (Juglans regia x Juglans nigra) Responsabile scientifico: Maria Emilia Malvolti; mimi@ibaf.cnr.it Istituzione: CNR-Istituto di Biologia Agroambientale e Forestale Indirizzo: V.le Marconi,2 05010 Porano (TR) Telefono: 0763 374913; Fax: 0763 374980 UO: Pollegioni Paola, Bartoli Susanna, Schrett-Major A.* (*Roland Eotvos University Fac. Of Science Ist. of Biology Department of Genetics, Budapest, Ungheria) 1) Obiettivi della scheda di ricerca Juglans regia L. (noce comune) e Juglans nigra (noce americano) sono due specie a molteplici attitudini, di notevole importanza dal punto di vista economico. J. regia, originaria del Sud Est Asiatico, è largamente diffusa nelle zone temperate sia per la produzione di legno pregiato, di colore variabile dal bruno al biondo chiaro, compatto, fine, omogeneo e relativamente facile da lavorare, sia di frutti. J. nigra, nativa dell America del Nord, è una specie a rapida crescita il cui legno è utilizzato principalmente in campo manifatturiero. J.regia è particolarmente sensibile all asfissia radicale e ad alcuni stress biotici. La rapidità di crescita e la qualità del fusto dipendono molto dalle condizioni ambientali e del terreno. J. nigra, se da un lato possiede un legno di minor valore e di colore quasi sempre bruno, dall altro si dimostra più resistente all asfissia radicale e con una maggiore capacità di crescita rispetto a J.regia. Le due specie, venute in contatto fin dal XVII secolo in seguito alla introduzione in Europa del noce americano per scopi ornamentali, hanno in alcuni casi dato ibridi naturali interspecifici. Ciò è possibile grazie alla contemporanea fioritura di J.regia e di alcuni individui di J.nigra (normalmente la fioritura tra le due specie non è sovrapponibile nel tempo). Gli studi condotti da Malvolti et al. (Prog. AIR III Walnut CT92 0142) hanno dimostrato come gli ibridi siano individui con spiccate caratteristiche intermedie tra le due specie parentali. Essi presentano vigore (eterosi dell ibrido) fusto dritto, foglia composta imparipennata, rapida crescita, legno qualitativamente apprezzabile ottenibile in un tempo relativamente breve (20-30 anni), maggiore adattabilità a diverse condizioni ambientali e suoli, minore sensibilità alle malattie. Tuttavia tali studi sono stati condotti solo su materiale francese. Anche in Italia, sebbene fino ad ora non siano stati debitamente considerati, esistono specialmente nel Nord Italia ibridi naturali che potrebbero presentare tutte le caratteristiche suddette e che perciò meriterebbero di essere analizzati e valorizzati nel campo dell arboricoltura da legno. Questo studio ha avuto come obiettivo quello di selezionare, valutare e riprodurre ibridi interspecifici di noce (J.nigra x J.regia) di origine italiana che riuniscano in se le caratteristiche positive delle due specie parentali. In passato il riconoscimento e la classificazione degli ibridi è risultata spesso difficile perché basata su caratteri morfologici, fenologici e fisiologici altamente influenzati dai fattori ambientali; pertanto nel presente studio le indagini sono state svolte a livello genetico impiegando tre tipi di marcatori molecolari: RAPD, ISSR, dominanti e SSR codominanti. I marcatori RAPD (Random Amplified Polimorphic DNA) sono il risultato dell amplificazione casuale di frammenti di DNA genomico mediante deca-primers a sequenza casuale (Williams et al. 1990). Nell ultimo decennio hanno trovato vasta applicazione gli ISSR (inter simple sequence repeat) (Zietkiewicz et al. 1994) che prevedono l amplificazione casuale di frammenti 1

di DNA genomico mediante primers contenenti ognuno un differente motivo microsatellitare ripetuto (SSR). Tuttavia è da tempo nota l utilità e l elevata informatività dei marcatori codominanti SSR (simple sequence repeat o microsatelliti) nello studio della struttura genetica di popolazioni (Balloux F. et al. 2002), nella costruzione di mappe genetiche, nell identificazione di ibridi e nell analisi del pedegree delle piante. La metodica consiste nell amplificazione specifica di un solo frammento di DNA contenente motivi microsatellitari ripetuti (es. AG), mediante primers complementari alle sequenze fiancheggianti il sito bersaglio. Gli obiettivi della ricerca nell ambito del progetto sono stati divisi per anni: 1. I ANNO Caratterizzazione genetica di una popolazione mista di piante J.regia, J.nigra; identificazione di eventuali ibridi interspecifici mediante marcatori molecolari dominanti (RAPD, ISSR). 2. II ANNO Identificazione e messa a punto nel noce di marcatori microsatellitari nucleari (SSR) utili per la caratterizzazione degli ibridi e confronto con i suddetti marcatori dominanti. 3. III ANNO Analisi di famiglie half-sib ottenute per libera impollinazione di 7 piante madri J. nigra identificate nel primo anno nella popolazione: (a) fingerprinting dei genotipi tramite marcatori molecolari codominanti (microsatelliti nucleari); (b) analisi della maternità nelle famiglie half-sib per stabilire l esatta attribuzione delle progenie alle piante madri. (c) analisi della paternità degli ibridi interspecifici individuati per stimare il successo riproduttivo dei putativi parentali maschili J. regia; (d) studio della fertilità della pianta risultata essere ibrida triploide mediante analisi molecolare (SSR nucleari) della sua progenie. 2) Materiali, metodi e organizzazione del lavoro Materiale Nell anno 2003, sono stati campionati tutte le piante presenti nel parco di Villa Mezzalira, località Bressano- Sandrigo (VI) (classificate come gruppi N, R, V, B, NC) e quelle nate da semi collezionati nel parco ma conservate nel vivaio della regione Veneto Centro vivaistico e per le attività fuori forestale Montecchio Precalcino, Vicenza (classificate come gruppi NC, IMP, VR)). In totale sono state campionati 138 individui di cui 69 J. nigra (N3, N4, N17, N18, N21-N24, NC4, NC6-NC11, NC13, NC15, NC16, NC19, NC21- NC24, VR1-VR46), 48 J. regia (R6-R16, AnEd, B2-B20, V1-V17) e 21 potenziali ibridi interspecifici (H1,H2, H19, H20, IMP1, IMP3-IMP7, IMP9-IMP15, IMP17-IMP20). Questa iniziale classificazione è stata effettuata in base a caratteri morfo-fenologici. Nella stagione 2004 sono state collezionate le progenie da libera impollinazione di 7 piante J. nigra (N3, N4, N17, N18, N22, N23, N24) e della pianta N21che dalla analisi molecolare era risultata ibrida itriploide.. Dalla germinazione dei semi sono nati in totale 461 individui suddivisi in 8 famiglie come segue: famiglia- N3 118 figli, famiglia-n4 26 figli, famiglia-n17 88 figli, famiglia-n18 24 figli, famiglia-n22 15 figli, famiglia-n23 59 figli, famiglia-n24 114 figli, famiglia-n21 17 figli. Nella prima metà del settembre 2005 su ciascuna pianta, sono state collezionate circa 5 foglie fresche. Le foglie, immediatamente immerse in azoto liquido sono conservate a -80 C. In totale, sommando gli individui della popolazione e le famiglie sopra elencate, per questo studio presso il CNR-IBAFdi Porano sono stati analizzati 600 campioni il cui DNA è stato amplificato, per l analisi con i diversi marcatori RAPD, ISSR e SSR, con oltre 112 PCR (96 campioni/pcr). Estrazione DNA Il metodo d estrazione è stato parziamente automatizzato mediante il Mixer Mill 300 (QIAGEN) per la macinazione di tessuto vegetale congelato, e il DNeasy 96 Plant Kit (QIAGEN) per la purificazione di elevata qualità del DNA genomico. Marcatori molecolari RAPD: Ogni amplificazione PCR è stata effettuata usando un volume totale di 12.5 l contenente 50 ng di DNA genomico, 10mM di Tris-HCL (ph 8) 50mM KCL, 1.5mM MgCl2, 150 M di ogni dntp, 0.4 M del primer scelto, 1U di Taq Polymerase (Boehringer Mannheim). Per l amplificazione è stata utilizzata una GENEAmp PCR System 9700. Il ciclo di amplificazione: iniziale denaturazione del DNA per 2 min. a 94 C; 40 cicli di 1 min. a 94 C ciascuno,1 min. di annealing a 38 C, 2 minuti a 72 C; estensione finale di 7 min. a 94 C. I prodotti amplificati sono stati separati mediante elettroforesi su gel di agarosio 1.5% e visualizzati mediante colorazione con bromuro d etidio. ISSR: Ogni amplificazione PCR è stata effettuata usando un volume totale di 12.5 l contenente 20 ng di DNA genomico, 10mM di Tris-HCl ph 8, 50mM KCl, 1.5mM MgCl 2, 200 M di ogni dntp, 0.4 M del 2

primer scelto, 100 g/ml di BSA, 0.4 U di Taq Polymerasi (Boehringer Mannheim) e 2.5% di formammide solo per i primers UBC-891 e UBC-890. Per l amplificazione è stata utilizzata una GENEAmp PCR System 9700. Il ciclo di amplificazione: iniziale denaturazione del DNA per 7 min. a 94 C; 45 cicli di 30 sec. a 94 C, 45 secondi di annealing (50-52 C), 2 minuti a 72 C.; estensione finale di 7 min. a 94 C. I prodotti amplificati sono stati separati mediante elettroforesi su gel di agarosio 2% e visualizzati mediante colorazione con bromuro d etidio. SSR: Ogni amplificazione PCR è stata effettuata usando un volume totale di 20l contenente 20 ng di DNA genomico, 10mM di Tris-HCl ph 8, 50mM KCl, 1.5mM MgCl 2, 200 M di ogni dntp, 0.2 M di ogni primer, 0. 008 g di BSA, 0.4 U di Taq Polymerasi (Boehringer Mannheim). Per l amplificazione è stata utilizzata una GENEAmp PCR System 9700. Il ciclo di amplificazione: iniziale denaturazione del DNA per 5 min. a 94 C; 35 cicli di 45 sec. a 94 C, 45 sec. di annealing (53-63 C), 1 min. a 72 C; estensione finale di 7 minuti a 72 C. Per controllare la validità del processo e determinare la misura del frammento ottenuto, sono stati analizzati 5 l del prodotto amplificato mediante elettroforesi su gel d agarosio 1.8% e colorazione con bromuro d etidio. I frammenti amplificati sono stati visualizzati, dopo oppurtuna ottimizzazione della metodica, in un sequenziatore automatico a 16 capillari (ABI Prism 3100). Analisi Citologica Per lo studio dell appaiamento dei cromosomi durante la divisione meiotica, sono stati collezionati fiori maschili in via di sviluppo ad un stadio sufficientemente precoce da permettere l analisi citologica. Le gemme sono state poste in una soluzione fissativa (acido acetico glaciale e etanolo assoluto = 1:3) subito dopo aver effettuato il campionamento. La soluzione è stata più volte rinnovata nel corso di 24 ore a temperatura ambiente. Successivamente si è sostituita la soluzione fissativa con etanolo al 70% e il materiale conservato a -20 C. Le cellule polliniche in via di sviluppo sono state analizzate mediante osservazione al microscopio dopo aver effettuato la classica colorazione con carminio acetato. Analisi statistica: Sulla base dei tre tipi di marcatori molecolari il confronto tra i genotipi collezionati é stato effettuato calcolando, per ogni coppia di campioni, il Simple Match Coefficient (SM). Sulle corrispondenti matrici è stata condotta l'analisi delle Coordinate Principali. Tale analisi, consente di ricostruire le posizioni relative dei campioni partendo dalla loro matrice di similarità genetica e di ordinarli in un spazio a due e/o tre dimensioni. Lo studio della correlazione tra le matrici di similarità ottenute dai tre set di marcatori indipendenti, ISSR, RAPD e SSR, è stato effettuato tramite Mantel Test. Il test di assegnazione di tipo frequentistico (Paetkau 2004) e quello Bayesiano parziale (Rannala B. & Mountain J. L., 1997) unito al Exclusion Simulation Significance Test (Cornuet J.M., 1999) è stato usato per confermare mediate un modello genetico i risultati dedotti dall osservazione dei cluster. L analisi di maternità e di paternità delle famiglie half-sib è stata eseguita mediante l approccio Most likely (software CERVUS ver. 2.0), possibile solo con marcatori codominanti polimorfici come gli SSR. 3) Risultati raggiunti RAPD Sulla base della bandmap costruita da Malvolti et al. nell ambito del progetto AIR III Walnut CT92 0142, sono stati selezionati 17 RAPD primers discriminanti tra le due specie J.nigra e J.regia, per un analisi preliminare di un subset di 60 piante presenti nel parco di Villa Mezzalira (48 genotipi J.regia: R6-R16; B2- B20; V1-V17, A.Ed; 8 piante J.nigra : N3-N5, N17, N18, N21-N23 e 4 ibridi putativi: H1, H2, H19, H20). Si sono ottenute 188 bande RAPD totali di dimensioni comprese tra 215.3 bp e 2952 bp. L Analisi delle Coordinate Principali ha raggruppato le piante in tre distinti clusters: gruppo delle piante J.regia, gruppo J.nigr, più e tre ibridi (H1, H2, H19) che si collocavano in posizione intermedia tra le due specie parentali. Tuttavia due campioni presentavano un profilo molecolare non coincidente alla classificazione basata su parametri morfo-fenologici: la pianta N21,originariamente attribuita alla specie J.nigra, si collocava tra gli ibridi, mentre l ibrido putativo H20 risultava geneticamente simile agli individui appartenenti alla specie J.regia. Consequentemente il campione N21 è statoin tale fase riclassificato come ibrido atipico, mentre l individuo H20 come genotipo potenzialmente appartenente alla specie J.regia. ISSR Dopo un iniziale screening di 100 ISSR sono stati selezionati 13 primers ISSR in base al numero, all intensità dei frammmenti amplificati ed alla loro percentuale di polimorfismo. Con tali primers sono stati analizzati i 138 genotipi totali, comprendenti i gruppi del parco di Villa Mezzalira (N, R, V, B, NC) e i gruppi NC, IMP, VR conservate nel vivaio di Montecchio Precalcino. I 13 ISSR primers hanno amplificato 162 frammenti tutti polimorfi. Il numero di bande amplificate era compreso tra un minimo di 4 (UBC-835) 3

ad un massimo di 16 (UBC-836), con un valore medio di 12.5 per primer. L Analisi delle Coordinate Principali ha suddiviso gli individui in 4 gruppi distinti: il primo gruppo costituito dalle piante J.nigra NC ed il secondo comprendente sia le piante J.nigra VR, N sia 13 dei 17 ibridi putativi IMP. Il terzo gruppo racchiudeva tutte le piante J.regia mentre il quarto gruppo, non troppo compatto, riuniva in se i restanti genotipi H1, H2, H19, IMP3, IMP4, IMP9, IMP18, H20 e N21. I campioni H1, H2, H19 e N21 apparivano ben separati come nella analisi RAPD. Il test di Mantel ha rivelato infatti una correlazione statistica tra i valori di similarità genetica (SM) calcolati sulla base dei due marcatori ISSR e RAPD, pari a r = 0.98 (P = 0.001). Nella prima annualità è stato perciò possibile identificare 7 ibridi interspecifici e di ipotizzare la presenza nel parco di Villa Mezzalira di madri putative J. nigra ibridogene cioè capaci di produrre ibridi per libera impollinazione di piante J. regia. SSR (Microsatelliti nucleari) Nel corso del secondo anno sono stati testati, per la prima volta, sulle piante a nostra disposizione (168 genotipi), 14 coppie di primers microsatellitari la cui sequenza é stata cortesemente forniti dalla Dr. Woeste K. della Pardue University, Dept Forestry e Nat Resources, Hardwood Tree Improvement e Regenerat Ctr. USDA Forest Serv. USA (comunicazione personale). Dopo aver individuato le condizioni ottimali di amplificazione e di visualizzazione di tali marcatori (Sequenziatore ABI Prism 3100), sono state selezionate 10 coppie di SSR primers per le analisi di fingerprinting. Il numero di alleli per locus variava da un massimo di 20 per il locus WGA276 ad un minimo di 8 per il locus WGA69 per un valore medio di 11.3 e un totale di 113. L analisi Pcoorda sulla matrice binaria di presenza/assenza di ogni allele per singolo locus microsatellitare ha confermato la distribuzione spaziale dei 138 campioni precedentemente ottenuta mediante i marcatori dominanti ISSR e RAPD. Gli individui J.regia di diversa origine ( R, V, B, A.Ed) formavano un cluster ben distinto che comprendeva anche il campione H20, erroneamente considerato ibrido interspecifico. Il secondo gruppo conteneva le piante J.nigra (N, VR) e 13 dei potenziali ibridi IMP. Le piante J.nigra NC formano il terzo cluster, rivelandosi geneticamente distinti dagli altri alberi di noce americano. I restanti genotipi, H1, H2, H19, IMP3, IMP4, IMP9, IMP18 e N21 si ponevano in una posizione intermedia tra i due gruppi di piante J.regia e J.nigra. Il Mantel test ha fornito un product moment correlation coefficient tra i marcatori RAPD e SSR del 0.857, tra i marcatori ISSR e SSR del 0.864, con un livello di significatività del 0. 1% e 1000 permutazioni totali. Sulla base della nuova classificazione i 113 alleli amplicati sono stati sudditi in alleli comuni (9 = 8.1%) alleli privati - J.nigra (68 = 76 %)e alleli privati - J.regia (38 = 43 %) L analisi del pedegree ha permesso di caratterizzare esattamente gli ibridi: N21 è risultato un ibrido triploide mentre H1, H2, H19, IMP3, IMP4, IMP9, IMP18 si sono rivelati ibridi diploidi interspecifici. Effettuando l analisi del pedegree la pianta N21 mostrava infatti 1 allele J.regia-specifico e 2 alleli J.nigra-specifici in 7 loci ((WGA1, WGA202, WGA89, WGA4, WGA118, WGA276, WGA331), 1 allele comune e 2 alleli J.nigra-specifici per il locus WGA89, 2 alleli comuni ed 1 allele J.regia-specifico per il locus WGA9 e solo 1alleli J.nigra-specifici per il restante locus WGA69 (assenza dell allele J. regia specifico per effetto di una mutazione nel sito di annealing). Il suddetto campione presentava perciò due terzi del corredo cromosomico di J.nigra ed un terzo di J.regia. L analisi citologica ha confermato i risultati ottenuti mediante i marcatori SSR: la pianta N21 mostrava un numero di cromosomi pari a 2n = 48 (corredo triploide) mentre gli ibridi H1, H2, H19, IMP3, IMP4, IMP9, IMP18, 2n = 32 (corredo diploide). La preliminare analisi di maternità ad esclusione dei sette ibridi diploidi identificati mediante SSR ha consentito di individuare la potenziale pianta madre J. nigra ibridogena: N17. Nella terza annualità si sono analizzate le otto famiglie half-sib mediante SSR per confermare la presenza di una o più piante ibridogene (N21) e studiare la eventuale fertilità della pianta ibrida triploide N21. sono stati amplificati 129 alleli (in media 12.9 alleli per primer), di cui 39 J. regia - specifici, 80 J. nigra specifici e 10 comuni tra le due specie parentali. L analisi delle Coordinate Principali condotta sul coefficiente SM ha rivelato una netta suddivisione del germoplasma totale (600 campioni) in quattro gruppi distinti; il primo è costituito dalle piante appartenenti alla specie J. regia (49 genotipi), il secondo (328 genotipi) ed il terzo (15 piante NC) dalle piante della specie J. nigra, il quarto, in posizione intermedia tra il cluster delle piante J. nigra e quello delle piante J. regia, riunisce gli ibridi. Sia Il test di assegnazione di tipo frequentistico (Paetkau 2004) sia quello Bayesiano parziale (Rannala B. & Mountain J. L., 1997) unito al Exclusion Simulation Significance Test (Cornuet J.M., 1999) ha conferma l identificazione di 205 ibridi interspecifici J. regia x J. nigra diploidi. Inoltre sono stati individuati due ibridi, N21-14 ed N21-15, appartenenti alla progenie della pianta ibrida triploide N21, con un particolare profilo genetico. Il genotipo N21-14 presentava tre alleli, due J. regia specifici e un allele J. nigra specifico al locus WGA276 mentre la pianta N21-15 4

mostrava tre alleli, due J. regia specifici e un allele J. nigra specifico al locus WGA1 ed un solo allele J. regia specifico al locus WGA321. Ipotizziamo che tali genotipi siano il risultato di aberrazioni cromosomiche avvenute durante la divisione meiotica nella pianta ibrida triploide. La successiva analisi della maternità in ogni famiglia half-sib ha evidenziato una serie di errori avvenuti durante il campionamento e ha determinato una nuova classificazione: famiglia-n3 41 figli, famiglia-n4 29 figli, famiglia-n17 97 figli, famiglia-n18 15 figli, famiglia-n22 73 figli, famiglia-n23 75 figli, famiglia- N24 114 figli, famiglia-n21 18 figli. Tale analisi ha inoltre dimostrato che la pianta ibrida triploide N21 non è sterile; infatti N21 ha generato, 13 ibridi diploidi interspecifici, 2 piante J. nigra e 2 ibridi triploidi per un solo locus dovuti forse ad una aberrazione cromosomica (es. trisomia di un cromosoma). L analisi di fingerprinting ha dimostrato inoltre che le piante N3, N4, N18, N22, non producono ibridi ma solo individui J. nigra, mentre le piante N17 (come ipotizzato), N23 ed N24 hanno fornito rispettivamente 68, 17 e 100 ibridi interspecifici, per una percentuale rispetto alla progenie del 70%, 22.7%, 87.8%. L analisi della paternità sui 205 ibridi ha rivelato un differente successo riproduttivo tra le piante J. regia presenti nella popolazione (V15, B6, B7) e una elevata percentuale di impollinazione esterna ( ~50 %). 4) Conclusioni e prospettive di prosecuzione Conclusioni L uso dei tre marcatori molecolari SSR, ISSR, e RAPD, si è rivelato adatto alla discriminazione delle due specie parentali ed all identificazione di ben 205 ibridi interspecifici diploidi La validità dei dati è stata confermata dallo studio della correlazione statistica tra marcatori mediante Mantel Test (product moment coefficient > 0,85). Completando i risultati precedentemente pubblicati sui marcatori ITS e cloroplastici (Stanford et al., 2000; Manos and Stone, 2001; Potter et al., 2002b) possiamo affermare che i marcatori dominanti nucleari impiegati in questo studio rappresentano una valida alternativa, oltre che un metodo precoce, per la caratterizzazione genetica delle due specie J.nigra, J.regia e dei loro ibridi senza la preventiva conoscenza della sequenza dei singoli loci. I marcatori molecolari utilizzati sono un potente strumento per l esatta classificazione di germoplasma per uso vivaistico Tuttavia vista la loro natura (codominati) e l elevata variabilità, i marcatori microsatellitari (SSR) si sono rivelati strumenti ideali e potenti per l analisi del pedigree. I risultati ottenuti con tali marcatori, confermati dall analisi citologica, hanno infatti permesso sia l individuazione della pianta ibrida triploide N21, caratterizzata da due terzi del corredo cromosomico proprio della specie J.nigra ed un terzo della specie J.regia, in grado di dare progenie, sia l individuazione di tre madri ibridogene (N17, N24, N23) capaci di produrre ibridi in percentuale elevata (soprattutto N17 ed N24). Prospettive Le ricerche fin qui condotte costituiscono un punto focale per l uso sostenibile e la valorizzazione della popolazione ibridogena italiana. Visto il particolare interesse scientifico ed anche pratico di questa popolazione, dopo le analisi molecolari appositamente messe a punto e svolte per tale materiale, nonchè gli altri studi preliminari svolti nell ambito di RiSELVITALIA, è necessario adesso proseguire le conoscenze a livello genetico, fisiologico, patologico, ambientale, qualitativo delle piante identificate. Tutto ciò va svolto sia tramite analisi di laboratorio in ambiente controllato, sia mediante sperimentazioni che consentano di comprendere i meccanismi di funzionali dei caratteri oggetto di studio e attraverso la stima del valore colturale dei materiali di base porre così le basi per l impiego nella filiera vivaistica dell arboricoltura da legno. Gli aspetti genetici, caratteri molecolari (micro-satelliti, AFLP), biochimici (isoenzimi), fenotipici/fenologici e patologici; devono essere considerati insieme alla qualità del legno, ottenibile in tempi brevi, e le tecniche colturali più appropriate per raggiungere il miglior risultato nel minor tempo e con spesa limitata.. E necessario inoltre risolvere, se possibile, l ostacolo posto dalla difficoltosa riproduzione vegetativa sia in vivo che in vitro che è un nodo strategico di importanza scientifica e applicativa per valorizzare gli ibridi naturali individuati a Bressanvido (VI) e la pianta ibrida triploide N21, e per salvaguardare e conservare il materiale di base del progetto. Le suddette ricerche potranno consentire l arricchimento delle risorse genetiche forestali italiane, oltre che la 5

possibilità di un impiego futuro di tale materiale vegetale nella filiera vivaistica al servizio dell arboricoltura da legno di pregio. Alla luce di quanto esposto, considerando le importanti prospettive scientifiche e pratiche derivanti da tali ricerche, si auspica di poter proseguire gli studi con finanziamenti mirati necessari tra l altro ad evitare la vanificazione del lavoro svolto e dei risultati raggiunti. Partecipanti al Progetto appartenenti all UO Responsabile scientifico: Maria Emilia Malvolti; UO: Pollegioni Paola, Bartoli Susanna, Schrett- Major A. (*Roland Eotvos University Fac. Of Science Ist. of Biology Department of Genetics, Budapest, Ungheria) Finanziamenti ricevuti complessivamente (nel triennio) EURO 59.000 Elenco pubblicazioni edite - M.E. Malvolti, D. Avanzato, 2006 - "V International Walnut Symposium" Ed. By M.E. Malvolti, D. Avanzato, ISHS Acta Horticulturae 705, ISBN 9066054263, ISSN 0567-7572 -Pollegioni, P., Major, A., Bartoli, S., Ducci, F., Proietti, R. and Malvolti, M.E. 2006. APPLICATION OF MICROSATELLITE AND DOMINANT MOLECULAR MARKERS FOR THE DISCRIMINATION OF SPECIES AND INTERSPECIFIC HYBRIDS IN GENUS JUGLANS. Acta Hort. (ISHS) 705:191-197 -D. Avanzato, F. Ducci, F. Gorian, L. Gui, A. Major, E.M. Malvolti, G. Mezzalira, P. Pollegioni, R. Proietti, 2006." PROPAGATION ABILITY OF SELECTED WALNUT HYBRIDS (JUGLANS REGIA L. J. NIGRA L.)" Acta Hort. (ISHS) 705:191-197.. -Maria Emilia Malvolti, Paola Pollegioni, Susanna Bartoli, Ágnes Major, 2004: Analisi genetica di popolazioni ibridogene di noce (Juglans regia X Juglans nigra) Relazione Unità Operativa 1.1.17; Convegno Progetto RI.SELV.ITALIA, Sottoprogetto 1.1.Biodiversità e produzione del materiale forestale di propagazione, Arezzo - Pollegioni P., Bartoli S., Major A., Ducci F., Proietti R., Avanzato D., Mezzalira G., Malvolti M.Emilia, 2004 PRODUZIONE DI NOCE IBRIDO ITALIANO:II APPLICAZIONE DI MICROSATELLITI E DI MARCATORI DOMINANTI PER LA DISCRIMINAZIONE DI SPECIE E DI IBRIDI INTERSPECIFICI NEL GENERE JUGLANS, Convegno Generale Progetto RI.SELV.ITALIA, Milano Attività correlate al progetto -Paola Pollegioni, Dottorato di ricerca in ECOLOGIA FORESTALE - XXI ciclo, Università degli Studi della Tuscia/CNR tutori: Prof. Dr. Giuseppe Scarascia Mugnozza (UniTus) Dott.ssa Maria Emilia Malvolti (CNR IBAF), Titolo della Ricerca: BIODIVERSITÀ GENETICA NELLE SPECIE JUGLANS REGIA L., JUGLANS NIGRA L. E NEI RELATIVI IBRIDI INTERSPECIFICI (alla data attuale al 2 anno di dottorato) Elenco delle pubblicazioni in corso di stampa - Paola Pollegioni, Keith Woeste, Agnes Major, Giuseppe Scarascia Mugnozza, and Maria Emilia Malvolti. Microsatellite markers for characterization of Juglans nigra (L.), Juglans regia (L.) and Juglans x intermedia (Carr). Forestry 2007(submitted). 6