Quantitative cell mechanics: new insights from a novel functional imaging platform

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Evelina Sarti
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1 Diss. ETH No Quantitative cell mechanics: new insights from a novel functional imaging platform A dissertation submitted to the ETH Zürich for the degree of DOCTOR OF SCIENCES Presented by GUIDO BARTALENA Dott. Ing., Politecnico di Milano Born 7 th may 1983 Italian citizen Accepted on the recommendation of Prof. Dr. Jess G Snedeker examiner Prof. Dr. Alberto Redaelli, co-examiner Dr. Aldo Ferrari, co-examiner 2012

submitted to the ETH Zürich for the degree of DOCTOR OF SCIENCES Presented by GUIDO BARTALENA Dott. Ing.

2 SUMMARY Cell mechanical properties are tightly linked to cell function: cells exert forces to crawl and migrate; they constantly sense mechanical cues such as shear stress and transform them into biochemical signals; cells deform in order to navigate their matrix. Furthermore, there is a strong correlation between cell mechanical properties and diseases such as cancer and malaria, where mechanical phenotype may be used as a diagnostic marker. The aim of this doctoral work was to develop a novel functional imaging platform able to quantitatively characterize cell stiffness in tension and use it to shed some light on (i) the link between cell stiffness and cancer progression; (ii) time-dependency of cell mechanical properties. In this first part of the dissertation a substrate-based functional imaging platform was developed around a commercially available stretching device. A soft formulation of Polydymethilsiloxane (PDMS) was chosen and a functionalization protocol was optimized in order to attach ligands and fluorescent nano-beads. Based on cell resistance to an applied deformation, cell stiffness was characterized. An innovative tracking system was implemented in order to allow stretching while simultaneously imaging a cell at high magnification. This was achieved by tracking the motion of surface nano-reporters and moving the motorized microscope stage accordingly. Second, an inverse finite element model of the stretching experiment was implemented in order to analyze the experimental outcome and quantitatively characterize cell elasticity. This required a multi-scale mechanical characterization of PDMS because of the alteration of its mechanical properties due to surface functionalization. A very thin and very stiff layer was found to be formed on the PDMS surface after functionalization. Its repercussion on estimated cell elastic modulus was dramatic, with an order of magnitude difference in predicted modulus when properly accounted. In the third part of the dissertation, the functional imaging platform and the inverse finite element model of the experiment were used to investigate the relationship between tensile cell stiffness and metastatic potential in two models of osteosarcoma. Cells were also assessed in compression using conventional atomic force micro-indentation. Divergent findings linking cancer cell stiffness to metastatic potential were revealed depending upon whether the cell was loaded in tension (consistent softening of the metastatic form in both models) or compression (lack of consistency across models). These results suggested the 9

Furthermore, there is a strong correlation between cell mechanical properties and diseases such as cancer and malaria, where mechanical phenotype may be used as a diagnostic marker.

3 central role of the cytoskeleton, the primary structure responsible for cell mechanical response in tension, and possibly in cancer-related transformation of phenotype. In the last part of the dissertation, the system was notably improved with the introduction of a digital pressure controller and an extension of the tracking algorithm to 3-D, allowing fully automated, fast and precise experiments. By stretching cells at different strain rates, whole cell strain-rate dependent constitutive properties were investigated: cells showed a stiffer mechanical response a lower strain rates, but no morphological difference in F-actin cytoskeleton, suggesting the role of other time-dependent components such as myosin and focal adhesions. In conclusion, a novel system to quantitatively investigate single cell mechanics in tension has been developed. It brings together interesting features: (a) innovative 3-D tracking system enabling high magnification, single cell characterization of dynamic cytoskeletal response to mechanical substrate actuation; (b) tunable substrate stiffness allowing investigation of various cell types, but also the possibility to mimic different types of extracellular ligand; (c) quick quantitative characterization of cell stiffness in tension. Furthermore, the use of the platform has proven relevant in open biological questions such as the relationship between whole cell mechanics and metastatic potential, and strain rate sensitivity of cell mechanical properties. 10

automated, fast and precise experiments.

4 SOMMARIO Le proprietà meccaniche della cellula sono strettamente legate alla sua funzione: le cellule esercitano forze per muoversi e migrare; trasformano costantemente stimoli meccanici come lo sforzo di taglio in segnali biochimici; si deformano per navigare attraverso la matrice extra-cellulare. Inoltre, vi è una forte correlazione tra le proprietà meccaniche delle cellule e malattie come cancro e malaria, dove il fenotipo meccanico può essere utilizzato come marker diagnostico. Lo scopo di questo lavoro di dottorato è stato quello di sviluppare una nuova piattaforma di imaging funzionale in grado di caratterizzare quantitativamente l elasticità delle cellule in tensione e utilizzarla per fare luce su (i) il legame tra la rigidezza delle cellule e la progressione del cancro, (ii) la dipendenza dal tempo della proprietà meccaniche cellulari. Nella prima parte della tesi, è stato sviluppato un sistema per la deformazione biassiale delle cellule costruito intorno a un dispositivo disponibile in commercio. È stata scelta un substrato cellulare, il Polydymethilsiloxane (PDMS), e una sua formulazione in modo da ottenere un materiale di elasticità comparabile con quella delle cellule; inoltre è stato sviluppato e ottimizzato un protocollo di funzionalizzazione del materiale per permettere di fissare ligandi (proteine) e nano-reporter fluorescenti. Sulla base della resistenza applicata dalle cellule alla deformazione del substrato, è stato possibile caratterizzare l elasticità cellulare. Un innovativo sistema di tracking è stato implementato in modo da consentire la visualizzazione della cellula contemporaneamente alla sua deformazione. Questo è stato reso possibile seguendo il movimento della superficie di nano-reporter e spostando di conseguenza lo stage motorizzato del microscopio. Successivamente, è stato costruito un modello agli elementi finiti di questo esperimento usato in maniera inversa al fine di analizzare i risultati sperimentali e quantificare l elasticità cellulare. Ciò ha richiesto una caratterizzazione meccanica multi-scala del PDMS a causa della modifica delle sue proprietà meccaniche in seguito alla funzionalizzazione superficiale. È stato scoperto uno strato molto sottile e molto rigido formatosi sulla superficie del PDMS in seguito alla funzionalizzazione. Le sue ripercussioni sulla stima del modulo elastico cellulare si è dimostrata significativa, risultando in un ordine di grandezza di differenza nel modulo elastico stimato, in seguito alla corretta simulazione del proprietà del PDMS. 11

Inoltre, vi è una forte correlazione tra le proprietà meccaniche delle cellule e malattie come cancro e malaria, dove il fenotipo meccanico può essere utilizzato come marker diagnostico.

5 Nella terza parte della tesi, la piattaforma e il modello inverso agli elementi finiti di questo esperimento sono stati utilizzati per indagare il rapporto tra elasticità delle cellule in trazione e il potenziale metastatico in due modelli di osteosarcoma. Le cellule sono state valutate anche in compressione con un metodo convenzionale quale l AFM. Sono stati trovati risultati divergenti nella relazione fra elasticità cellulare e potenziale metastatico a seconda se la cella è stata caricata in trazione (costante diminuzione del modulo elastico con l aumento del potenziale metastatico) o compressione (mancanza di consistenza tra i modelli). Questi risultati suggeriscono il ruolo centrale del citoscheletro, struttura principale responsabile della risposta cellulare in trazione, e implicitamente nella trasformazione di fenotipo che avviene con la progressione del cancro. Nell'ultima parte della tesi, il sistema è stato notevolmente migliorato con l'introduzione di un controllore di pressione digitale e un'estensione dell'algoritmo di tracking in 3-D, consentendo esperimenti completamente automatizzati, rapidi e precisi. Questo ha permesso di eseguire in maniera affidabile esperimenti a diverse velocità di deformazione e analizzare il comportamento meccanico delle cellule: è stato trovato un significativo aumento del modulo elastico cellulare a velocità di deformazione più basse, seppure con nessuna differenza morfologica nella organizzazione dell actina fibrosa del citoscheletro, suggerendo il ruolo di altri componenti sensibili a variazioni dinamiche, come la miosina e le adesioni focali. In sintesi, all interno di questo lavoro di dottorato, è stato sviluppato un nuovo sistema per indagare quantitativamente le caratteristiche meccaniche della singola cellula in trazione. Esso raggruppa caratteristiche interessanti: (a) l innovativo sistema di tracking 3-D consente la deformazione della singola cella tramite azionamento meccanico del substrato, in contemporanea alla sua visualizzazione; (b) la rigidezza del substrato è modificabile e consente indagini di vari tipi cellulari, ma anche la possibilità di simulare diversi tipi di ligando extracellulare; (c) la caratterizzazione quantitativa dell elasticità della cellula in trazione. Inoltre, l'utilizzo della piattaforma si è dimostrato appropriato in rilevanti ambiti biologici quali il rapporto tra meccanica cellulare e potenziale metastatico e la sensibilità delle proprietà meccaniche delle cellule alla velocità di deformazione. 12

Sono stati trovati risultati divergenti nella relazione fra elasticità cellulare e potenziale metastatico a seconda se la cella è stata caricata in trazione (costante diminuzione del modulo elastico

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