DIAGNOSTICA MOLECOLARE & TRACCIABILITA DEGLI ALIMENTI

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1 CONVEGNO AITA Aggiornamenti su metodi, strumenti, tecniche e presenza di contaminanti 3 Ottobre 2013 Novotel Mecenate MILANO Valentina Gualdi Piattaforma Genomica PARCO TECNOLOGICO PADANO DIAGNOSTICA MOLECOLARE & TRACCIABILITA DEGLI ALIMENTI valentina.gualdi@tecnoparco.org

2 Il patrimonio agroalimentare italiano Sistema produttivo italiano ha un ampia gamma di prodotti e varietà agroalimentari Prodotti tipici tradizionali sono un importante sottoinsieme Elenco Nazionale DM350/1999: Prodotti tradizionali: prodotti agroalimentari le cui metodiche di lavorazione, stagionatura e conservazione sono consolidate nel tempo quasi 3000 prodotti di cui 1424 prodotti tradizionali di origine animale (58% del totale) 689 derivati da carni 585 da latte e 98 ittici

3 Il patrimonio agroalimentare italiano La necessità è quella di tutelare il nostro patrimonio agroalimentare e la nostra tradizione Tutela a garanzia della qualità del prodotto Analisi chimico/fisico classiche Tutela a garanzia della salubrità del prodotto Analisi chimiche e microbiologiche classiche L avvento delle tecnologie del DNA ha permesso di studiare e caratterizzare più a fondo i prodotti agro alimentari e quindi ci ha fornito strumenti in più a tutela di tutta la filiera produttiva

4 DNA e ALIMENTI Tutti gli organismi viventi (piante, animali, microrganismi) contengono DNA I prodotti freschi essendo parti di animali o piante contengono DNA I prodotti processati essendo derivati da animali o piante contengono DNA

5 DNA e ALIMENTI Il DNA presente all interno dell alimento è riconducibile alle materie prime presenti nell alimento ma anche ai microrganismi patogeni e non eventualmente presenti Il DNA di ciascun individuo (sia un vegetale che un animale) contiene sequenze conservate caratteristiche del genere/specie di appartenenza ma anche sequenze uniche che lo rendono differenziabile da qualsiasi altro

6 LE ANALISI del DNA negli ALIMENTI TUTELA del CONSUMATORE SALUBRITA degli ALIMENTI: Posso utilizzare le tecniche di biologia molecolare per ricercare eventuali microrgansimi patogeni presenti nell alimento (es. assenza Salmonella spp., Listeria Monocytogenes) Posso ricercare eventuali allergeni Posso ricercare la presenza di Organismi Geneticamente Modificati Es. Soia e Mais OGM TRACCIABILITA IDENTIFICAZIONE di SPECIE/VARIETA : Posso utilizzare le tecniche di biologia molecolare per dimostrare che un prodotto è 100% a base di farina di Kamut Posso utilizzare le tecniche di biologia molecolare per dimostrare che un prodotto contiene 100% Pistacchi di Bronte Posso utilizzare le tecniche di biologia molecolare per dimostrare che un prodotto non contiene tracce di orgine animale (es. ID specie suino/id specie bovino) TRACCIABILITA IDENTIFICAZIONE di ORIGINE DOP/NON DOP Posso utilizzare le tecniche di biologia molecolare per distinguere un prodotto DOP da un prodotto non DOP

7 Tracciabilità di filiera La Tracciabilità consente di: Risalire alle caratteristiche del prodotto (parti costitutive, lotto di appartenenza, processi produttivi adottati) Ricostruire la sua storia tecnicocommerciale (passaggi di proprietà, cambi di destinazione) Richiamare un prodotto se si riscontra un rischio per la salute umana e l ambiente Contribuire al controllo delle informazioni sull etichetta

8 Tracciabilità molecolare I metodi basati sulla tracciabilità del DNA nelle matrici alimentari hanno un campo di applicazione più ampio rispetto a quelli basati sulle proteine; infatti i trattamenti industriali usati nella produzione di alimenti portano alla degradazione di proteine e DNA. Tuttavia, il DNA può ancora essere rintracciato mediante l uso di tecniche di biologia molecolare basate sulla PCR (reazione a catena della polimerasi).

9 Marcatori molecolari Cosa sono? sequenze DNA facilmente identificabili e la cui ereditabilità sia monitorabile Caratteristiche necessarie: altamente polimorfici riproducibili veloci ed economici

10 Marcatori molecolari: cenni storici Tecniche basate sul procedimento di ibridazione tipo Southern blot (Southern, 1975) RFLP (Botstein et al., 1980) VNTR (Jeffreys et al., 1985) Tecniche basate sulla reazione a catena della polimersi (PCR) (Mullis, 1986) SSR (Tautz, 1988) RAPD (Williams et al., 1990) CAPS (Akopyanz et al., 1992) I SSR (Zietkiewicz et al., 1994) AFLP (Vos et al., 1995) SAMPL (Morgante e Vogel, 1996) S SAP (Waugh et al., 1997) M AFLP (van Eijk et al., 2001) TRAP (Hu e Vick, 2003) ISBP (Paux et al., 2006)

11 Marcatori molecolari basati sulla PCR COS E la PCR?? È l amplificazione esponenziale in vitro di una specifica regione di DNA a doppia elica, di cui sono note le sequenze ai confini della regione di interesse Microsatelliti Polimorfismi di singolo nucleotide (SNP) AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism)

12 I marcatori molecolari SNP Individuo Eterozigote C/T Il DNA è costituito da una sequenza di nucleotidi (A/T/C/G) All interno di ciascun genere/specie/individuo esistono tratti di DNA conservati e tratti di DNA caratteristici In uno specifico tratto di DNA i marcatori SNP sono mutazioni (differenze) a livello di un singolo nucleotide Gli SNPs sono milioni e distribuiti lungo l intero genoma Individuo mutato A>G

13 I marcatori molecolari microsatelliti Trovano ampio impiego negli studi di tracciabilità a diversi livelli: Vitello 1 Vitello 2 Tracciabilità di razza/varietà; Test di omogeneità/purezza Tracciabilità a livello individuale Test di parentela: Pannelli validati in tutte le specie di interesse zootecnico Rapidi da eseguire (3 gg. lavorativi)

14 Piattaforma Genomica E una Piattaforma di servizio gestita dal Parco Tecnologico Team multidisciplinare (Biologi, Veterinari, Biotecnologi, Tecnologi alimentari) Svolge analisi di biologica molecolare DNA/RNA Certificata ISO9001 ISO17025 MIPAF Mission: sviluppo metodi innovativi a supporto delle divisioni Assicurazione Qualità e Ricerca Sviluppo delle aziende del settore agro alimentare

15 Progetti Tracciabilità varietale Frumento Riso Riso basmati Verifica di conformità di prodotti alimentari Prodotti kamut Identificazione specie ittiche Tracciabilità di specie/razza animali Identificazione di specie equino

16 ANALISI del DNA per STUDI di TRACCIABILITA VARIETALE Presso il PTP/PGP sono stati condotti numerosi studi di fingerprinting per caratterizzazione di varietà vegetali Riso Orzo Miglio Pomodoro Frutta specie differenti Sono stati creati database unici di riferimento Studi di tracciabilità Studi di purezza/omogeneità su sementi Studi di comparazione varietale

17 Identificazione varietale frumento Il progetto TRITICUM TRACE: analisi di fingerprinting molecolare su un pannello di 29 varietà di frumento duro (Triticum turgidum spp. durum) I. Estrazione del DNA presente II. III. IV. Studio di 73 diversi SSRs (Single Sequence Repeats) mappanti nel genoma di frumento duro per ottenere il fingerprinting varietale delle accessioni di frumento duro in esame. Selezione di un pannello di 21 SSRs per il fingeprinting di tutte le 29 accessioni di frumento duro in esame Applicazione del pannello su materia prima, materia prima lavorata (farina), prodotto finito (pasta) Tracciabilità varietale lungo la filiera di produzione

18 RISULTATI 1 Clustering delle 32 accessioni di frumento duro ottenuto sulla base di 21 loci SSRs. L albero filogenetico è stato costruito usando il metodo neighborjoining e la distanza genetica euclidea.

19 RISULTATI 1 Clustering delle 32 accessioni di frumento duro ottenuto sulla base di 21 loci SSRs. L albero filogenetico è stato costruito usando il metodo neighborjoining e la distanza genetica euclidea.

20 RISULTATI 2 Profili di fingerprinting del marcatore Cfd48 della varietà di frumento duro Svevo di riferimento e del campione Svevo acquistato dal cliente Allele aggiuntivo indice della presenza di due o più varietà e non della varietà Svevo in purezza

21 Identificazione delle varietà di riso L ITALIA èil principale paese produttore ed esportatore di riso nella UE Il mercato del riso italiano include varietà tradizionali e moderne caratteristiche agronomiche, proprietà chimico fisiche, valore commerciale La legislazione italiana stabilisce la suddivisione delle varietà commerciali di riso in quattro categorie e una corrispondente denominazione commerciale per i prodotti derivati Comune, Semifino, Fino e Superfino Divieto di miscelare risi di varietà diverse anche se appartenenti allo stesso gruppo. Obbligo di indicazione della varietà in caso riso importato Comune o Originario Fino Superfino AGATA ALICE ALERAMO AMBRA ANTARES ARBORIO ARPA ARIETE VOLANO BALILLA ASSO VULCANO BRIO AUGUSTO BACCO CENTAURO BRAVO BALDO CERERE CARMEN BIANCA CL 12 CRESO ELBA DUCATO DARDO FEDRA ELIO DELFINO GALILEO ERIDANO DENEB ROMA MARTE DRAGO CARNAROLI PERLA ERCOLE CARNISE SELENIO EUROPA CARNISE PRECOCE SFERA EUROSIS KARNAK SOLE CL LINCE POSEIDONE SP 55 LOTO ALBATROS VIRGO LUNA CL ARSENAL CRIPTO LUXOR ARTIGLIO MECO CENTRO Semifino NEMBO CL 26 ALPE ONICE CL 46 ARCO OPALE CL 71 CRONO PRESTO CL 80 FLIPPER PUMA CLXL745 LIDO RIBE (EURIBE) CRLB1 MUSA RODEO ELLEBI ROSA MARCHETTI ROMBO EOLO SARA RONALDO FAST SAVIO SCIROCCO GEMINI TEA SISR215 GLADIO ARGO TEJO LIBERO NUOVO MARATELLI AIACE MARE CL ORIONE FALCO MERCURIO PADANO (BAHIA) GLORIA NINFA VIALONE NANO S.ANDREA OCEANO VENERE SAMBA SAGITTARIO ULISSE SATURNO NERONE DECRETO 14 dicembre Denominazione delle varietà di risone e delle corrispondenti varietà di riso per l annata agraria 2012/2013 SCUDO SIRIO CL SPRINT TESEO THAIBONNET URANO APOLLO ASIA ELETTRA FEBO FRAGRANCE GANGE GIANO GIGLIO TIGRE ARTEMIDE

22 Collezione Germoplasma di Riso Collezione di germoplasma di riso Comprendente oltre 400 genotipi : Più di 200 varietà storiche o attuali Italiane Circa 200 varietà straniere (miglioramento genetico, commercio) Sono stati raccolti dati fenotipici e di genealogia per tutte le varietà prese in considerazione

23 Bio Repository DNA estratto con strumentazione automatizzata e univocamente registrato con codice a barre, disponibile per le analisi di genotipizzazione SSRs Varietà di riso BIO REPOSITORY: Foglie liofilizzate, granella, DNA/RNA SNPs Genotipizzazione Piastre con codice a barre Estrazione automatica di DNA/RNA LIMS Laboratory Information Management System

24 Identificazione Varietale Marcatori molecolari microsatelliti (SSR) Utilizzo di 24 marcatori microsatelliti Di facile analisi Quantità di informazioni Alta automazione Ripetibilità delle analisi Identificazione univoca di ognuna delle varietà presenti nella collezione e quindi nei gruppi commerciali.

25 Ripetibilità e Specificità Comparazione di profili allelici DNA estratto da: foglia, seme, parboiled, sfarinato, prodotti da forno Foglia Sfarinato

26 Identificazione di Miscele Test Varietà mescolate Rapporto Classe N di SSR per l identificazione 1 Thaibonnet Gladio 2 Arborio Volano Baldo 3 Perla Selenio 1:5 Superfino 4 1:1:1 Superfino 3 1:1 Comune 3 Thaibonnet Gladio Individuare una miscela di farine di riso Identificare le varietà presenti in una miscela Gladio Thaibonnet Accreditato in conformità alla norma ISO17025

27 Basmati, analisi quantitativa Varietà di riso Basmati approvate dalla Comunità Europea Basmati 217 Basmati 370 Basmati 386 Kernel (Basmati) Pusa Basmati Ranbir Basmati Super Basmati Taraori Basmati (HBC 19) Type 3 (Dehradun) SSR per identificazione delle varietà Pusa + Taraori Sherbati sem Pusa flour Taraori Sherbati Tipiche varietà di riso adulteranti Sherbati Pak 386 Superfine Pusa Sherbati è ammessa la presenza fino ad un massimo del 5% di riso non appartenente a nessuna delle varietà approvate Rapporto in miscela (aree dei picchi) Il metodo quantitativo del PTP è accreditato in conformità alla norma ISO17025

28 ANALISI del DNA e FRODI ALIMENTARI/COMMERCIALI Presso il PTP/PGP sono stati condotti numerosi studi su matrici alimentari diverse per svelare frodi alimentari Identificazione di specie ittiche (tonno/cernia, sgombridae) Identificazione di specie animali (equino, suino, bovino) Utilizzo di ingredienti non dichiarati in etichetta (Ketchup) Sono stati creati pannelli di marcatori molecolari per la tutela dei prodotti DOP Provolone dolce valpadana vs formaggi pasta filata Sono stati sviluppati metodi anche in settori differenti ed emergenti Erbe officinali Controllo delle Materie prime utilizzate Sviluppo di metodi quantitativi (es. Panax ginseng/panax quinquefolius)

29 ANALISI del DNA in PRODOTTI da FORNO Messa a punto di un metodo di biologia molecolare per verificare la composizione di due prodotti da forno (crostini e sfoglie) di cui i crostini dichiarati 100% a base di farina di Kamut I. Estrazione del DNA presente II. III. Amplificazione di un pannello di 11 microsatelliti (SSRs) per confrontare il profilo genomico del DNA estratto dai tronchetti con il profilo genomico di semole di frumento KAMUT e altri frumenti duri. Verifica della presenza di DNA riferibile a frumento tenero o altre piante diverse da frumento (genere Triticum).

30 ANALISI del DNA in PRODOTTI da FORNO N Ka 1 2 : DNA estratto dai tronchetti 3 4 : DNA estratto dalle sfoglie (non 100% Kamut) N: controllo negativo Ka: DNA estratto da semola 100% Kamut Analisi elettroforetica di DNA amplificati dal locus tnrl ITS tnrf: Evidenza di un unica banda nei campioni di tronchetto Dimostra l assenza di DNA estraneo a piante appartenenti al genere Triticum nei tronchetti.

31 ANALISI del DNA in PRODOTTI da FORNO Cfa2163 Cfa2028 Cfa2058 Cfa2170 Cfa2019 Cfa2049 Cfa2201 Cfd48 Cfa2155 Cfa2219 Cfa2123 Tronchetto (A) / / /161/ / / / /262/ /269/279 Tronchetto (B) / / /161/ / / / /262/ /269/279 Semola_KAMUT_A Semola_KAMUT_B L analisi comparativa dei profili di DNA isolati dai tronchetti e dalle semole ha rivelato che : Ad esclusione dei loci Cfa2163, Cfa2058 e Cfa2170, i tronchetti e le semole hanno un profilo allelico diverso Ad esclusione dei loci Cfa2163, Cfa2058 e Cfa2170 i tronchetti hanno più di un allele per ogni locus Per tutti i loci analizzati, gli alleli individuati nelle semole KAMUT sono stati rilevati anche nei tronchetti Un ulteriore analisi sui DNA estratti dai tronchetti è stata realizzata amplificando un SSR specifico (SSR Cfa2040) mappante nei genomi A, B e D dei frumenti: l analisi dei frammenti ha rilevato la presenza del frammento specifico del genoma D, dimostrando la presenza di DNA di frumento tenero nel materiale genetico estratto dai tronchetti. I tronchetti sono stati realizzati esclusivamente con una miscela di frumenti, una delle quali è sicuramente frumento tenero e l altra mostra un profilo compatibile con farina di frumento KAMUT.

32 ANALISI del DNA per IDENTIFICAZIONE di SPECIE ITTICHE Secondo il regolamento (CE) 1536/92 le conserve ittiche possono essere vendute con la scritta tonno o conserva di tonno solo se contengono le specie classiche del genere Thunnus quali: Obesus o tonno obeso, Thynnus o tonno rosso, Alalunga, simile a quello rosso ma di dimensioni inferiori, Albacares o tonno a pinne gialle, ma anche del genere Katsuwonus pelamis. Non èperò possibile miscelare più specie tra quelle ammesse Alcune specie non sono ammesse alla vendita (normativa che tutela il Tonno rosso ) Il metodo del PTP basato sull analisi di un gene target (cyt b) consente la distinzione delle seguenti specie: Thunnus tynnus (Tonno rosso), Thunnus alalunga (Tonno alalunga), Thunnus albacares (Tonno a pinne gialle), Thunnus tonggol (Tonno indopacifico), Thunnus atlanticus (Tonno atlantico), Thunnus orientalis (Tonno orientale), Thunnus obesus (Tonno obeso), Thunnus maccoyii (Tonno australe), Euthynnus alletteratus (Tonnetto o Alletterato), Katsuwonus pelamis (Tonnetto striato), Sarda sarda (Palamita), Auxis rochei rochei (Biso o Tambarello), Auxis thazard thazard (Biso tropicale), Scomber scombrus (Sgombro), Scomber japonicus (Lanzardo o sgombro occhione), Scomber colias (Lanzardo o sgombro occhione), Scomber australasicus (Sgombro australe)

33 ANALISI del DNA per IDENTIFICAZIONE di SPECIE ITTICHE L amplificazione di un piccolo tratto di DNA (120 bp) consente di lavorare anche su matrici altamente degradate

34 ANALISI del DNA per IDENTIFICAZIONE di SPECIE ITTICHE SNP 1 SNP 2 SNP 3 SNP 4 T. alalunga G T A G T. albacares G T C G T. obesus T T A A K. pelamis G G A A T. thynnus T T A G La combinazione di 4 SNPs consente di avere un profilo unico di fingerprinting per le 5 specie in esame

35 ANALISI del DNA per IDENTIFICAZIONE di SPECIE ANIMALI Gene endogeno controllo positivo di amplificazione Gene target specie/specifico per equino A_controllo negativo B_controllo positivo 1 5 campioni di campo per ricerca di carne Equina Metodi di PCR qualitativa altamente sensibili Sviluppati anche metodi quantitativi PCR Real Time Metodi applicabili a prodotti carnei, preparati e derivati Primer specie specifici per 16 diverse specie Richiesta di mercati emergenti es. ID specie suino per mercato Halal Prove di sensibilità miscela di 0.05% carne equina in mix di carne suina/bovina 10 estratti/in doppio

36 IL MARCHIO DNA CONTROLLATO Marchio Registrato dal PTP dato in licenza d uso gratuito ai clienti che applicano un piano di controllo di un determinato prodotto basato sull analisi del DNA

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