ION FORCE DNA EXTRACTOR FAST Cat. # EXD001

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1 ION FORCE DNA EXTRACTOR FAST Cat. # EXD001 Manuale d uso Via San Geminiano, San Prospero (MO) Italy : : : techsupport@generon.it : [1] Manuale d uso ION FORCE DNA EXTRACTOR FAST Rev /06/2018

2 1 - Introduzione ION Force DNA Extractor FAST è un kit di estrazione del DNA sviluppato per soddisfare le esigenze del biologo molecolare che opera nel settore alimentare e dei mangimi. ION Force è particolarmente indicato per matrici complesse, dove l'estrazione del DNA può essere difficoltosa a causa di svariate sostanze che possono causare inibizione. Questo prodotto è stato sviluppato da Generon con reagenti di prima qualità per la biologia molecolare per fornire al cliente un protocollo flessibile che permetta il recupero del DNA da una vasta gamma di matrici. Tutti i reagenti sono conformi alla norma ISO 21571: 2005 / Amd 1: ION Force unisce la preparazione del campione in CTAB con una colonna di purificazione a base di silice, permettendo l'estrazione di DNA sia da matrici semplici che complesse ottimizzando la resa e la purezza del DNA. ION Force DNA Extractor FAST permette di processare fino a 20 grammi di materiale di partenza al fine di massimizzare la rappresentatività del lotto di campione. Questo kit è destinato a essere utilizzato per l'estrazione di DNA (acido deossiribonucleico) da campioni alimentari e mangimi ben omogenati. Se i campioni non sono in forma granulare, devono essere trattati (macinati) prima dell estrazione del DNA al fine di migliorare l omogeneità del campione e la resa estrattiva. Ion Force fornisce inoltre un metodo rapido e affidabile di purificazione del DNA genomico (gdna) da brodi batterici (dopo il passaggio di arricchimento), filtri e tamponi, muffe/funghi e protozoi con un semplice protocollo che può essere completato in meno di 15 minuti dopo la preparazione dei lisati. In questo manuale sono anche riportati specifici protocolli di estrazione del DNA da matrici particolari. Il DNA estratto può essere immediatamente utilizzato per applicazioni molecolari come digestione con endonucleasi di restrizione, Real-Time PCR, Southern Blots o Droplet Digital PCR. Per ulteriori informazioni si prega di contattare il proprio distributore o inviare una all'indirizzo techsupport@generon.it. [2] Manuale d uso ION FORCE DNA EXTRACTOR FAST Rev /06/2018

3 2 ION Force DNA Extractor FAST 2.1 Componenti del kit ION Force DNA Extractor FAST contiene reagenti per 100 estrazioni. Prodotto Solution A Buffer E Columns Collection Tubes Buffer T Buffer P concentrato Solution D Quantità 4 x 500 ml 1 x 100 ml 100 units 100 units 3 x 250 ml 1 x 50 ml 1 x 20 ml Buffer P concentrato deve essere ricostituito aggiungendo 200 ml di etanolo (purezza> 98%) per ottenere 250 ml di soluzione pronta all'uso. Siglare il riquadro posto sulll etichetta dopo l'aggiunta. Altri prodotti disponibili: Cat. # Descrizione Formato EXD003 ION Force DNA Extractor SOLUTION A 2000 ml EXD004 ION Force DNA Extractor SOLUTION D 60 ml EXD005 ION Force DNA Extractor BUFFER T 750 ml EXD006 ION Force DNA Extractor BUFFER P 50 ml EXD007 ION Force DNA Extractor COLUMNS 100 units EXD013E ION Force DNA Extractor Buffer E (Purification step) 100 ml EXD013 * ION Force DNA Extractor Purification solution 100 ml * Purification solution è ancora disponibile a parte nel caso in cui i clienti preferiscano continuare a utilizzare una soluzione a base di cloroformio. 2.2 Conservazione e periodo di validità Una volta ricevuto, il kit deve essere conservato a temperatura ambiente. Non congelare i reagenti o refrigerare a temperature inferiori a 8 C. I reagenti conservati a questa temperatura possono essere utilizzati fino alla data di scadenza indicata sulla confezione. 2.3 Avvertenze Generon S.p.A. garantisce l'acquirente esclusivamente riguardo la qualità dei reagenti e dei componenti utilizzati per la fabbricazione del prodotto. Generon S.p.A. non è responsabile e non può in ogni caso essere considerata responsabile o congiuntamente responsabile per eventuali danni derivanti dall'utilizzo del prodotto dell'utente e dei dati ottenuti. [3] Manuale d uso ION FORCE DNA EXTRACTOR FAST Rev /06/2018

4 3 Materiale richiesto ma non fornito Esano (opzionale, richiesto solo per lecitina fluida). Etanolo (purezza > 98%). Tubi da 15 e 50 ml. Moulinex o omogeneizzatore equivalente. Cucchiai di plastica. Bilancia tecnica, sensibilità: 0.01 g. Bagnomaria o Termoblocco fino a 85 C ± 2 C. Centrifuga con rotore per microtubi da ml e per tubi da 50 ml (intervallo tra rpm). Microtubi da 1.5 e 2.0 ml. Siringhe da 10 ml senza ago e filtri di acetato di cellulosa con diametro dei pori da 0.45 μm. Camera da vuoto per l estrazione del DNA (Cat. # EXD010-P) + pompa da vuoto (Cat. # ACC2908). Adattatori per camera da vuoto (Cat. # EXD010-A, 6 unità). Cilindro graduato da 50 ml. Set di micropipette. Puntali con filtro per micropipette. Ogni fase della preparazione dei campioni (macinatura, trasferimento, pesata, etc.) deve essere eseguita secondo le GLP (Good Laboratory Practice) con l'obiettivo di minimizzare la possibilità di crosscontaminazioni. Si raccomanda di utilizzare, quando possibile, plasticheria monouso. Una volta che il campione è stato omogenato, può essere pesato e la giusta quantità estratta secondo il protocollo selezionato. Fare riferimento a questo manuale d uso per i dettagli della procedura di estrazione; è indicata la lettura dell'intero manuale prima di iniziare l'estrazione. [4] Manuale d uso ION FORCE DNA EXTRACTOR FAST Rev /06/2018

5 4 Estrazione del DNA da alimenti e mangimi Matrice Pesata (± 0.2 g) Aliquota di sottonatante Filtrazione Mangime, fieno e tabacco 2.5 g 0.5 ml Sì Alimenti per l infanzia 5.0 g 2.5 ml Sì Formaggi 2.5 g 1.0 ml Sì Patatine, snack e biscotti 5.0 g 2.5 ml Sì Creme al cioccolato, caffè 5.0 g 1.0 ml Sì Carne, pesce e derivati 5.0 g 0.5 ml No Corn flakes e miele 5.0 g 0.5 ml No Crackers, "grissini, crusca, polenta 5.0 g 0.5 ml No Creme 5.0 g 2.5 ml No Aromi 5.0 g 2.5 ml Sì Farina e semi di mais 5.0 g 0.5 ml No Farina e semi di soia 0.5 g 1.0 ml Sì Mangimi e formulate per mangimi 5.0 g 0.5 ml Sì Gelati 5.0 g 1.0 ml Sì Generon SpyX 5.0 g 0.5 ml No Sciroppo di glucosio e succhi di frutta 5.0 g 2.5 ml No Glutine e mais dolce 2.5 g 1.0 ml No Marmellata 5.0 g 1.0 ml Sì Lecitina granulare e fluida * 10.0 g 2.5 ml No Olio di lino 1.0 g 0.5 ml Sì Sfarinati, Prodotti liofilizzati e cacao in polvere 2.5 g 1.0 ml Sì Margarine e burro 5.0 g 2.5 ml Sì Latte in polvere 5.0 g 0.5 ml Sì Amido modificato 2.5 g 2.5 ml No Praline e frutta secca 5.0 g 1.0 ml Sì Pasta 2.0 g 0.5 ml No Alimenti per animali domestici, lievito e fermenti 5.0 g 0.5 ml No Pizza 5.0 g 1.0 ml Sì Prodotti a base di soia 5.0 g 1.0 ml Sì Budini, senape, gelatine 5.0 g 2.5 ml Sì Oli grezzi e raffinati 20.0 g 2.5 ml No Preparati pronti per dolci 5.0 g 2.5 ml Sì Riso e derivati 5.0 g 1.0 ml Sì Sughi e salse 5.0 g 2.5 ml Sì Proteine di soia, sangue, farine di carne 2.5 g 1.0 ml Sì Spezie e vegetali secchi 2.5 g 2.5 ml Sì Amido e zucchero 5.0 g 2.5 ml No Edulcoranti (o dolcificanti) 5.0 g 2.5 ml No Caramelle e frutta candita 5.0 g 2.5 ml Sì Concentrati di pomodoro 5.0 g 2.5 ml Sì Semi vari (colza, grano saraceno, orzo ) 2.5 g 0.5 ml Sì Matrici vegetali 2.5 g 0.5 ml No Vitamine e integratori alimentari 5.0 g 0.5 ml Sì Farina di grano 2.0 g 0.5 ml Sì Additivi Alimentari (*):Coloranti, conservanti, antiossidanti e correttori di acidità, esaltatori di sapidità, emulsionanti, Additivi Alimentari (*):Addensanti (Agar-agar, Pectine, Gelatina, Carragenina, gomma di Guar, Xanthano, gomma di Acacia, ) g (*) 2.5 ml No < 1.0 g (*) 2.5 ml Yes Tabella 1: pesate suggerite per l'estrazione del campione, aliquote di sottonatante da trasferire (vedere capitolo 4.7) e di filtrazione per la successiva fase di purificazione. Le pesate riportate sono indicative; per matrici a basso contenuto di DNA è possibile aumentare la quantità di partenza per ottenere una resa estrattiva maggiore. (*) A causa della vasta gamma e natura di prodotti classificati come Additivi Alimentari, si consiglia una attenta valutazione della pesata più idonea del campione al fine di facilitarne la manipolazione durante la fase di estrazione del DNA. [5] Manuale d uso ION FORCE DNA EXTRACTOR FAST Rev /06/2018

6 1. Macinare e/o omogenare il campione. Trasferire in un tubo da 50 ml il quantitativo richiesto come indicato nella Tabella Aggiungere 20 ml di Solution A al campione*. *Per lecitina fluida e granulare: aggiungere al campione 20 ml di Esano. Agitare e quindi aggiungere 10 ml di Solution A. Agitare nuovamente fino al completo scioglimento della lecitina e procedere seguendo il capitolo 4.3 del manuale. Il campione deve essere processato a temperatura ambiente invece che a 85 C. 3. Mescolare bene e incubare 1 ora a 85 C ± 2 C. Agitare 2-3 volte durante il periodo d incubazione. 4. Centrifugare il campione a una velocità compresa tra 6000 e rpm per 10 minuti. Nota: se non si dispone di una centrifuga con il rotore per tubi da 50 ml, trasferire 2 ml del campione processato in un microtubo da 2.0 ml e centrifugare a rpm per 10 minuti. 5. Trasferire 1 ml della fase acquosa in un microtubo da 2.0 ml. Per le matrici riportate in ROSSO in Tabella 1, si suggerisce di dividere 3 ml della fase acquosa in 3 singoli microtubi da 2.0 ml. Nota: la fase superiore è acquosa; se i campioni contengono grassi e/o oli la fase acquosa si trova nella fase intermedia. 6. Aggiungere 0.8 ml di Buffer E e agitare bene per 1 minuto; quindi centrifugare il campione a rpm per 5 minuti. Nota: il sottonatante deve esse limpido. In caso contrario, ripetere il passaggio in centrifuga. 7. Trasferire la quantità di sottonatante (fase acquosa sottostante) indicata in Tabella 1 in un tubo di polipropilene contenente 5 ml di Buffer T (evitare di prelevare l eventuale strato corpuscolare che si trovano nella fase intermedia). Si consiglia di eliminare prima il sopranatante e quindi trasferire il subnatante evitando la fase intermedia. Per le matrici riportate in ROSSO in Tabella 1, raccogliere le aliquote di subnatante divise in precedenza e trasferirle in una provetta contenente 7,5 ml di Buffer T. 8. Agitare delicatamente per inversione per evitare stress al DNA. Nota: il Buffer T contiene un indicatore di ph che vira dal giallo al rosso quando ph> 7.5. Nel caso in cui il colore diventa rosso, acidificare l'estratto aggiungendo una goccia di acido acetico glaciale (CH3COOH) per correggere il valore del ph fino a quando il buffer torna di colore giallo. 9. Se richiesto dal campione (vedere Tabella 1), filtrare la soluzione attraverso un filtro membrana di acetato di cellulosa (0.45 micron dimensione dei pori) inserito in una siringa da 10 ml; altrimenti procedere direttamente alla fase successiva. 10. Collegare le colonne di purificazione del DNA alla camera da vuoto come indicato in Figura 1. Figura 1: Schema di assemblaggio delle colonne di purificazione alla camera da vuoto: A. Colonna di purificazione fornita con il kit ION Force. B. Adattatori per la camera da vuoto (EXD010-A). C. Siringhe per ION Force (ACC907). D. Camera da vuoto (EXD010-P). E. Rubinetti d arresto (EXD010-R). [6] Manuale d uso ION FORCE DNA EXTRACTOR FAST Rev /06/2018

7 11. Impostare la pompa per il vuoto a una pressione tra -0.5 e -0.9 atm (in alternativa, verificare che la portata non sia più veloce di 1 goccia / secondo). 12. Trasferire il contenuto di ogni tubo nella rispettiva colonna e quindi procedere con il lavaggio delle colonne aggiungendo 3 volte 0.75 ml di Buffer P (in precedenza ricostituito con etanolo). 13. Rimuovere le colonne dalla camera da vuoto; disporre ciascuna colonna in un tubo di raccolta e centrifugare a 7000 rpm per 5 minuti per rimuovere completamente il Buffer P (questo passaggio rimuove tutte le tracce di etanolo che potrebbero inibire la successiva reazione di PCR). Nota: per evitare contaminazione crociata tra i campioni, dopo ogni utilizzo è importante pulire gli adattatori e i rubinetti (Figura 1) lasciando 1 ora in candeggina al 5% (ipoclorito di sodio) e in seguito risciacquare con acqua distillata. 14. Eliminare il tubo di raccolta e trasferire ogni colonna in un microtubo da 1.5 ml pulito. Aggiungere 150 µl di soluzione D (100 µl per le matrici a basso contenuto di DNA e i prodotti Generon SpyX ). 15. Attendere 2 minuti e quindi eluire il DNA dalla colonna centrifugando 30 secondi a 500 rpm e continuando a rpm per 5 minuti. 16. Questa soluzione di DNA è stabile una settimana a +4 C o 12 mesi a -20 C. [7] Manuale d uso ION FORCE DNA EXTRACTOR FAST Rev /06/2018

8 5 Specifica estrazione del DNA da matrici particolari 1. Trasferire in un tubo da 15 o 50 ml la quantità indicata in Tabella 2. Matrice Pesata Tempo di Fase acquosa da Aliquota di Solution A Buffer E (± 0.2 g o ml) incubazione trasferire sottonatante Latte animale 50 ml 5 ml 60 min 4 ml 4 ml 3.5 ml Brodi batterici 1 ml 9 ml 15 min 1 ml 0.8 ml 0.9 ml Filtri, tamponi 1 unità 1.5 ml 15 min Non necessario Non necessario 1 ml Vino e bevande 8 ml 2 ml 30 min 4.5 ml 1.5 ml 3 ml Penne/piume 2 unità 1 ml 60 min 1 ml 0.8 ml 0.5 ml Carne cruda 5 g 20 ml 30 min 1 ml 0.8 ml 0.5 ml Sangue 1 ml 9 ml 15 min 1 ml 0.8 ml 0.9 ml Tabella 2: per queste matrici la filtrazione attraverso un filtro membrana di acetato di cellulosa non è necessaria. Latte animale: centrifugare tra 6000 e rpm per 20 minuti e rimuovere il surnatante contenente siero e grassi; lasciare il pellet. Filtri: utilizzando una pompa da vuoto filtrare con tecniche asettiche l'intero campione liquido attraverso una membrana. Tamponi: utilizzando un tampone di cotone sterile, tamponare intensamente la superficie di prova (massimo 100 cm 2 ). Penne/piume: tagliare due penne/piume in 2-3 parti (1.5 cm dal bulbo). 2. Aggiungere la quantità di Solution A indicata in Tabella 2 e mescolare bene per omogeneizzare il contenuto. 3. Incubare a 85 C ± 2 C seguendo il tempo d incubazione riportato in Tabella 2. Agitare 2-3 volte durante il periodo d incubazione. 4. Centrifugare il campione a velocità compresa tra 6000 e rpm per 10 minuti. 5. Trasferire la quantità di fase acquosa indicata in Tabella 2 in una microprovetta da 2.0 ml o in una provetta da 15 ml (a seconda del campione). Nota: la fase superiore è acquosa; se i campioni contengono grassi e/o oli la fase acquosa si trova nella fase intermedia. 6. Aggiungere la quantità di Buffer E indicata in Tabella 2 e agitare bene per 1 minuto, quindi centrifugare il campione a rpm per 5 minuti. Nota: il sottonatante deve esse limpido. In caso contrario, ripetere il passaggio in centrifuga. 7. Trasferire la quantità di sottonatante indicato in Tabella 2 in un tubo di polipropilene contenente 5 ml di Buffer T (evitare di prelevare le proteine che si trovano nella fase intermedia). Si consiglia di eliminare prima il sopranatante e quindi trasferire il sottonatante evitando la fase intermedia. Procedere al capitolo 4.8 di questo manuale. [8] Manuale d uso ION FORCE DNA EXTRACTOR FAST Rev /06/2018