Risultati della Ricerca

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1 Risultati della Ricerca Titolo Resistenza all'attacco di agenti patogeni e fitofagi Descrizione estesa del risultato Nella specie Olea europaea una b-glucosidasi endogena, specifica per il fenolo secoiridoideo oleuropeina, è espressa nei tessuti di foglie e frutti dove è coinvolta nei processi di sviluppo e maturazione dei tessuti nonché nel complesso meccanismo di difesa multichimico contro agenti patogeni e fitofagi, quale la larva di Bactrocera, che si esplica attraverso la produzione di molecole ad elevata attività antibatterica e antiossidante. I nostri studi rilevano che la resistenza all'attacco della mosca è mediata da: -attività specifica della beta-glucosidasi nei confronti dell'oleuropeina che risulta più elevata nelle cultivar resistenti. -espressione differenziale della beta-glucosidasi durante la maturazione e in particolare una ridotta espressione durante la fase verde immatura. -relazione tra compartimentazione dell'enzima a livello subcellulare (cloroplasto) e del substrato oleuropeina (vacuolo) e timing della risposta di difesa costitutiva. La localizzazione cellulare e tissutale di questo enzima riveste una notevole importanza nella comprensione del ruolo svolto dal sistema b-glucosidasi/oleuropeina durante il processo di sviluppo foliare e di deamarizzazione del frutto. Grazie alla collaborazione con la Dr. Yoshiko Minami (Department of Biochemistry, Okayama University of Science, Japan) che ha fornito un anticorpo policlonale la b-glucosidasi è stata localizzata a livello dello stroma del cloroplasto, mentre l oleuropeina si trova nel vacuolo. L attività di ricerca ha riguardato lo studio della b-glucosidasi nella risposta iniziale all attacco di Bactrocera in cultivars che mostrano una diversa suscettibilità all infestazione. Nelle cultivars considerate, entro 20 min dopo l attacco, si ha una forte attività dell enzima nei tessuti danneggiati. Successivamente l attività decresce fino a non essere più rilevabile ad 1 ora dal danno e si stabilizza dopo 3 ore dal danno. I livelli di oleuropeina, invece, non cambiano sensibilmente nelle cultivar molto sensibili alla infestazione di B. oleae, mentre diminuiscono rapidamente nella cultivar che mostra una bassa suscettibilità. I nostri risultati suggeriscono fortemente che la suscettibilità del frutto di olivo verso l'infestazione della mosca è data dalla attività specifica della b-glucosidasi nel degradare l oleuropeina e produrre così le molecole reattive nei tessuti danneggiati. I prodotti relativi a tale ricerca, che potrebbero essere trasferiti nelle pratiche colturali per la difesa fitosanitaria dell'olivo, hanno riguardato: -identificazione molecolare di cultivar con maggiore efficienza del sistema di difesa oleuropeina/b-glucosidasi. -isolamento e caratterizzazione dell'enzima b-glucosidasi espresso nei frutti per studi di reazione in condizioni controllate. Attraverso tecniche proteomiche sono state individuate e parzialmente sequenziate tre diverse isoforme che presentano identico peso molecolare, ma diverso punto isoelettrico. Ciò ha fatto supporre modificazioni post-trasduzionali delle tre isoforme espresse nella drupa, che potrebbero derivare dallo stesso m-rna amplificato in reazioni PCR e RT-PCR su inneschi costruiti sulla unica sequenza di b-glucosidasi presente in banca dati. In particolare le tre isoforme non sono espresse a 50 DAF (Day After Flowering), due di queste sono espresse a 120 DAF mentre l'espressione di tutte e tre le isoforme avviene a partire da 160 DAF. -progettazione e realizzazione di un bioreattore a membrana caricato con l'enzima b-glucosidasi 1/5

2 nativo. La purificazione dell enzima è stata ottenuta utilizzando il metodo di separazione molecolare di diafiltrazione su membrana. Tale metodica è stata realizzata in collaborazione con l Istituto per le Tecnologie delle Membrane del CNR (ITM-CNR). Elettroforesi quantitative e qualitative hanno identificato un polipeptide di 65 kda come banda polipeptidica più rappresentata nel permeato della diafiltrazione a membrana di 50 KDa. La stabilità della ß-glucosidasi parzialmente purificata è stata monitorata utilizzando il substrato D-nitrophenil-ß-D-glucopiranoside (pnpglc) come standard di reazione. I dati ottenuti dimostrano che la diafiltrazione degli estratti da frutto aumenta significativamente l attività specifica della ß-glucosidasi che risulta essere rappresentata da una singola forma con una apparente mobilità elettroforetica di 65 kda, identificata come -glucosidasi da analisi immunoblot. L enzima isolato ha mostrato una elevata affinità per il substrato oleuropeina e una moderata attività per altri -D-glucosidi sintetici e naturali. - produzione di molecole bioattive derivanti dal'idrolisi enzimatica dell'oleuropeina nel bireattore. E' stato un bioreattore catalitico a membrana usando l enzima immobilizzato con metodi fisici. Al fine di identificare le proprietà catalitiche della -glucosidasi immobilizzata e la sua distribuzione nel bioreattore, modificando le tecniche citochimiche e immunocitochimiche, è stato sviluppato un nuovo metodo combinato che rileva l attività dell'enzima in situ e contemporaneamente la sua immunolocalizzazione nelle membrane. Questo nuovo metodo presenta notevoli vantaggi rispetto ai tradizionali metodi di stima indiretta dell attività enzimatica basata sul rilevamento dei prodotti di reazione nell intera soluzione. Il metodo consente inoltre di monitorare la distribuzione dell enzima nella membrana, informazione di cruciale importanza nell ottimizzazione delle metodologie di immobilizzazione, nella modellizzazione dei bioreattori e nel loro sviluppo su larga scala. L idrolisi enzimatica dell oleuropeina da parte di una b-glucosidasi specifica determina la produzione di dialdeidi alfa,beta-insature ad elevata attività antimicrobica e antiossidante. -determinazione dell ambiente chimico per la stabilizzazione delle molecole bioattive. Responsabile del risultato Silvia Mazzucca, () Tel.: Anno 2010 Classificazione del risultato Comparto produttivo: Produzioni vegetali fresche e trasformate COMPARTO OLIVICOLO-OLEARIO Comparto olivicolo-oleario in generale Particolari categorie di prodotti/comparti produttivi: Categorie di ambiti di ricerca: PARTICOLARI CATEGORIE DI PRODOTTI IN GENERALE Particolari categorie di prodotti/comparti produttivi in generale TEMATICHE TECNICHE SU SPECIFICHE FASI DELLE FILIERE PRODUTTIVE Piante, coltivazione e produzione primaria (varietà, genetica, coltivazione biologica, agrotecniche, difesa, ecc.) 2/5

3 DIFESA E RELATIVI INPUT Difesa e relativi input in generale Parole chiave difesa della coltura, oleuropeina Trasferibilità del risultato Si, trasferibilità previa sperimentazione Natura del risultato di processo-prodotto Aree interessate Calabria Impatto dal punto di vista tecnico resistenza alle avversità biotiche Impatto dal punto di vista socioeconomico miglioramento qualitativo Impatto dal punto di vista ambientale riduzione input chimici ed energetici sostenibilità ambientale delle produzioni Presupposti di contesto presenza politiche di incentivo Soggetti istituzionali da coinvolgere Industrie di settore Industrie di trasformazione Enti di ricerca Potenziali utilizzatori Divulgatori Ditte di agrofarmaci 3/5

4 Modalità di diffusione Progetti comuni con i vari soggetti, istituzionali e non, interessati Progetti comuni con industrie di trasformazione Pubblicazioni Spadafora, A.; Mazzuca, S.; Chiappetta, F.F.; Parise, A.; Perri, E.; Innocenti, A.M. (2008): Oleuropein-Specific-B-Glucosidase Activity Marks the Early Response of Olive Fruits(olea europaea)to Mimed Insect Attack, Vol. 7 p Mazzei, R.; Giorno, L.; Spadafora, A.; Mazzuca, S.; Drioli, E. (2006): Improvement of β-glucosidase activity of Olea europea fruit extracts processed by membrane technology, Vol. p Mazzuca, S.; Giorno, L.; Spadafora, A.; Mazzei, R.; Orioli, E. (2006): Immunolocalization of β-glucosidase immobilized within polysulphone capillary membrane and evaluation of its activity in situ, Vol. p Mazzuca, S.; Spadafora, A.; Innocenti, A. M. (2006): Cell and Tissue localization of β-glucosidase during the ripening of olive fruit (Olea europaea) by in situ activity assay, Vol. p Titolo del progetto Ricerca ed innovazione per l'olivicoltura meridionale - RIOM Coordinatore del progetto ENZO PERRI Contrada Li Rocchi, RENDE () Tel.: enzo.perri@crea.gov.it Ente finanziatore DISR 5 - Servizio fitosanitario centrale, produzioni vegetali Breve descrizione del progetto e dei suoi obiettivi Progetto / Ricerca di riferimento Gli obiettivi generali del progetto sono i seguenti: - caratterizzazione del germoplasma olivicolo delle sei regioni dell obiettivo uno; - miglioramento genetico e sanitario di ecotipi di germoplasma di olivo di interesse dell Italia meridionale per produrre accessioni da avviare alla certificazione volontaria; - studio e valorizzazione della biodiversità dell olivo; - caratterizzazione, valorizzazione e miglioramento quali-quantitativo delle produzioni olivicole (olio e olive da mensa); - sviluppo di strategie, agronomiche e tecnologiche, per la riduzione dei costi di produzione; 4/5

5 - sviluppo di sistemi di produzione olivicolo-oleari sostenibili per l ambiente; - sviluppo di innovazioni in alcune tecniche colturali (gestione del suolo, nutrizione delle piante, difesa fitosanitaria, ecc.) finalizzate ad incrementi quantitativi e qualitativi della produzione; - analisi di mercato ed analisi economica della filiera; - riduzione dell impatto ambientale dei sottoprodotti dell industria olearia; - maggiore sicurezza alimentare a tutela della salute del consumatore; - studiare e promuovere lo sviluppo delle imprese olivicole multifunzionali per lo sviluppo rurale, in accordo con la nuova politica agricola comune; - sviluppare nuovi modelli di rinnovamento e ristrutturazione degli impianti olivicoli; - studiare le proprietà salutistico-nutrizionali delle olive e degli oli; - studiare le caratteristiche di tipicità degli oli di oliva e sviluppare tecniche per la loro rintracciabilità, anche con l ausilio della Spettroscopia di Risonanza Magnetica. U.O. / Partner coinvolti nella realizzazione del risultato Università degli Studi di Reggio Calabria Referenti istituzionali già coinvolti nella ricerca Non sono presenti Referenti già coinvolti per il risultato 5/5