Trasferimento di energia in risonanza

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1 Trasferimento di energia in risonanza alla Förster (FRET)

2 FRET: introduzione È una tecnica per misurare distanze inter o intra molecolari l i nell intervallo 1 10 nm I due punti di interesse devono essere marcati con due cromofori diversi: il donatore (che deve essere fluorescente) e l accettore. Lo spettro di emissione del donatore deve sovrapporsi (almeno parzialmente) allo spettro di assorbimento dell accettore. In queste condizioni un donatore eccitato, anziché emettere fluorescenza, può trasferire la propria energia di eccitazione all accettore, attraverso un fenomeno di risonanza. La probabilità di questo fenomeno dipende dalla distanza ed orientazione tra le due sonde, che quindi possono essere misurate. * *

3 FRET: vantaggi (rispetto ad altre tecniche strutturali, più potenti, come la cristallografia a raggi X o l NMR) Strumentazione semplice ed economica. Elevata sensibilità (è richiesto poco campione). Esperimenti in soluzione, in condizioni fisiologiche. Possibilità ibilitàdi effettuare misure in vivo. mpio intervallo di distanze misurabili. Risoluzione temporale nell ordine dei nanosecondi.

4 FRET: teoria T i t b ti di di 0 Teoria perturbativa di ordine 0 Funzione d onda imperturbate Potenziale d interazione dipolo dipolo θ θ T ( )( ) R R R R V μ μ μ μ θ R k R R μ μ 3 T k θ θ θ cos cos 3cos R k V k FRET ψ ψ μ μ ψ ψ ψ ψ ψ ψ 2 * * * * k k k k R r ε φ ε ψ μ ψ ψ μ ψ * 2 * 6 2 v R v R R ν τ ν ψ μ ψ ψ μ ψ

5 FRET: teoria k FRET 1 0 τ R R k 2 2 R α n 4 Φ 0 J J 0 f 4 (ν) ε (ν) ν dν 0 f (ν) dν

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7 Per rotazione libera di donatore ed accettore durante il tempo di vita del donatore: k media dinamica Per fluorofori orientati casualmente, ma immobili durante il tempo di vita (matrice solida o viscosa): k media statica 6 2/

8 FRET: efficienza E probabilità che un donatore eccitato trasferisca la sua energia. E k FRET E 1 6 kr + knr R 3 1+ k k τ 0 k FRET FRET R0 2 k r + k 1 nr + k FRET 2 0 In generale, l efficienza dipende dall orientazione. 1 E Se i cromofori ruotano liberamente sulla scala dei 6 R tempi della fluorescenza, allora k 2 2/3. 1+ R 0 L efficienza dipende dalla sesta potenza della distanza Elevata sensibilità Si misurano bene solo distanze confrontabili con R 0 (da R 0 /2a 2R 0 ). Si può avere un R 0 ottimale scegliendo opportunamentei cromofori (ossia la loro sovrapposizione spettrale).

9 Red donor emission otted green acceptor absorption ansyl labeled labeled phospatidylethanolamine

10 onor cceptor R 0 (Å) Naphthalene ansyl 22 Pyrene Coumarin 39 Terbium Rhodamine 65 Tryptophan ansyl Tryptophan Heme 29 Tryptophan p Pyrene 28 Bodipy Bodipy 57 Tryptophan PH 40 Tryptophan Tyrosine-NO 2 26

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12 E Φ 0 FRET: misura dell efficienza k FRET k r + k nr + k FRET k r k r + k nr 1 Φ k r + k nr + k FRET k r 1 Φ 1 Φ E 0 1 Φ Φ L efficienza si può misurare dalla diminuzione della fluorescenza del donatore k r k r + k nr + k FRET 1 Φ 1 Φ k r + k nr + k FRET 0 k r Φ F 1 E 1 Φ 0 F 0 k r + k nr k r k FRET k r

13 Oppure dalla diminuzione del tempo di vita del donatore E ET 1 τ τ 0 τ 1 1 τ 0 k + k + k k + r nr ET r k nr τ 1 τ 1 0 k r + k nr k ET k + k + k k + k + r nr ET r nr k ET E ET

14 Oppure dall aumento della fluorescenza dell accettore (se è fluorescente!) F em ex ( λ ) ε ( λ ) φ F em ( λ ) ε ( λ ) φ + ε ( λ ) φ ex ex E F F ( λ ( λ em em ) ) ε ( λ ex ) φ ε ( + ε ( λ λ ) φ ex ex ) φ E 1 + ε ε λ ( λ ( ex ( ex )E ) E em ε ( λ ex ) F ( λ ) [ 1 em ε ( λ ) F ( λ ) ex ]

15 FRET: applicazioni

16 FRET: applicazioni Struttura di macromolecole

17 Measuring conformational dynamics: k ET 1 R 0 0 τ R 6 I ( t ) I 0 e ( k ET 1 + τ ) t

18 For a gaussian distribution of distances: P( r ) 2 1 R R 1 2 σ 2π σ e I ( t ) I 0 0 P ( R ) e ( k ET 1 + τ ) t dr

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22 ansyl labeled labeled melittin

23 Coil helix transition

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25 Peptides Foldamers for Energy Transfer Förster Energy Transfer dipole dipole interaction E 2 1 R k R0 6

26 Peptide foldamers Foldamers are molecules that have well defined and predictable folding properties in solution. S. H. Gellman, ccounts of Chemical Research 1998, 31, 173.

27 C α,α, disubstituted aminoacids

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29 Peptide r α 1 Ε 1 α 2 Ε 2 α 3 Ε 3 Trp-TOC Fmoc-TOC

30 Confronto esperimenti calcoli <κ 2 > 2/ Calcul lated efficien ncy lation Calc culated popu Experimental efficiency Experimental population

31 Soluzione Cristallo N O N O Meccanica molecolare l (confermata dai dati di fluorescenza) Raggi X

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33 Oct-ib-Gly-Leu-ib-Gly-Gly-Leu-ib-Gly-Ile-Lol E~0.81 E ~0.37

34 Processi di associazione i FRET: applicazioni In vivo detection of calcium binding CFP cyan fluorescent protein YFPyellow fluorescent protein CaMCalmodulin M13Calmodulin Binding peptide pp (Tsien et al. 1998, Science 280:1954)

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37 FRET: applicazioni Processi idi associazione i Single molecule detection of association between two epidermal growth factor receptors in the membrane of a living cell (Sako et al. 2000, Nature Cell Biol. 2:168)

38 Ibridizzazione FRET: applicazioni

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41 Processi di associazione i FRET: applicazioni In vivo detection of calcium binding CFP cyan fluorescent protein YFPyellow fluorescent protein CaMCalmodulin M13Calmodulin Binding peptide pp (Tsien et al. 1998, Science 280:1954)

42 FRET: applicazioni Sensore di fosforilazione

43 FRET: applicazioni Sensore di estrogeni

44 FRET: applicazioni ttività enzimatica Nota: il metodo FRET permette la misura di attività enzimatica in vivo, utilizzando la microscopia di fluorescenza.