Studio di biologia riproduttiva di taxa endemici ristretti riferiti alla famiglia Caryophyllaceae

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1 UNIVERSITÁ DEGLI STUDI DI CAGLIARI Dipartimento di Scienze della Vita e dell Ambiente Scuola di Dottorato in Ingegneria e Scienze per l Ambiente e il Territorio Corso di Dottorato in Scienze e tecnologie della Terra e dell Ambiente Coordinatore: Prof. Pierfranco Lattanzi Dottorato di ricerca Studio di biologia riproduttiva di taxa endemici ristretti riferiti alla famiglia Caryophyllaceae Candidate: Anna Nebot Escrigues Tutor: Prof. Gianluigi Bacchetta Co-tutor: Ph.D Donatella Cogoni 1

2 Introduzione Attualmente ci sono molte specie di piante minacciate in seguito a fattori naturali (diminuzione di impollinatori, depressione per endogamia, ecc.) o per cause antropiche (es. riduzione degli habitat) (Weller 199; Weekley and Race 2001). La biologia riproduttiva delle specie riguarda, almeno in parte, il suo successo riproduttivo (Rymer et al. 2005) con importanti conseguenze per la vitalità delle popolazioni (Evans et al. 2003). Studiare la biologia riproduttiva di specie in via di estinzione, rare o minacciate può essere molto utile sia per capire perché vengono classificate in queste categorie (Schemske et al. 199; Castro et al. 2008) sia per predire la capacità di sopravvivenza delle stesse (Schemske et al. 199; Bernadello et al. 2001). Quindi, conoscere la biologia riproduttiva delle specie fornisce importanti approfondimenti per impostare piani di conservazione per le piante in via di estinzione (Weller 199; Bosch et al. 1998; Weekley and Race 2001; Young et al. 2002). Le informazioni ottenute da questi studi possono anche essere utili per valutare alternative per strategie di gestione in situ ed ex situ (Menges 1986). La famiglia delle Caryophyllaceae include 86 generi e 2200 specie, distribuite principalmente nelle regioni temperate dell emisfero settentrionale. Nel bacino del Mediterraneo, uno degli hotspot di biodiversità, sono stati registrati taxa endemici (Myers et al. 2000) e la flora italiana include 376 taxa appartenenti a 3 generi di cui 92 sono endemici (Conti et al. 2005; Peruzzi et al. 2012). Tra questi, il genere Dianthus L. (Caryophyllaceae) è uno dei generi più diversificati in Europa, caratterizzato dalla presenza di numerosi taxa endemici nell area del Mediterraneo (Valente et al. 2010). In Sardegna sono presenti otto specie endemiche di Dianthus (Bacchetta et al. 2010), quattro delle quali presentano una distribuzione ristretta. Tra queste, Dianthus morisianus Vals. è l unica specie psammofila che si trova confinata in un unica popolazione presso Portixeddu, nel sistema costiero dunale di Buggerru, nel sud-ovest della Sardegna. È una delle specie maggiormente minacciate dell isola ed è stato classificato come Criticamente Minacciato (CR) secondo le categorie IUCN (Fenu et al. 2011). Le specie appartenenti al gruppo Silene mollissima (L.) Pers. group rappresentano taxa ancestrali che si a diversificano nell ovest del Mediterraneo (Keifer and Boquet 1979; Jeanmonod and Boquet 1981; Brullo and Signorello 198; Jeanmonod 198). Sono specie casmofitiche e presentano distribuzioni spesso puntiformi, crescono in luoghi rocciosi vicino al mare o nelle scogliere costiere e di montagna. Questo gruppo è formato da sette specie endemiche all interno del quale si rinvengono Silene velutina Pourr. ex Loisel. (Jeanmonod, 198) e Silene Ichnusa Brullo, De Marco & De Marco f. Gli obiettivi della mia ricerca del dottorato sono: Conoscere il successo riproduttivo di queste tre specie. Valutare gli effetti delle componenti fenologiche sul successo riproduttivo Analizzare se queste specie sono minacciate per fattori antropici o per fattori naturali (diminuzione dei impollinatori, depressione per endogamia, auto incompatibilità, ecc..). Valutare se ci sono differenze nei modelli fenologici riproduttivi tra le piante naturali e le piante coltivate ed introdotte. Risultati Fenologia fiorale di Dianthus Durante la fase vegetativa, prima del periodo di fioritura, sono state condotte numerose escursioni di campo al fine di individuare le popolazioni e indagarne la distribuzione e l abbondanza. Le caratteristiche climatiche delle aree di studio sono state registrate attraverso delle sonde termiche posizionate in ognuna delle popolazioni; i dati sono stati scaricati ogni 3 mesi e attualmente sono in fase di analisi. La durata di vita del singolo fiore è stata studiata in 20 individui opportunamente marcati prima dell apertura. Dal primo giorno di fioritura (15 maggio) i fiori sono stati monitorati a cadenza giornaliera facendo un censimento del numero di fiori aperti per pianta e per giorno. La durata di vita del singolo fiore è stata studiata su tutti i fiori formati dagli individui selezionati (166 della popolazione naturale e 100 della popolazione reintrodotta), opportunamente 2

3 marcati prima dell apertura nel momento d antesi e monitorati a cadenza giornaliera fino al momento della fruttificazione e annottando tutti gli stadi fenologici. Con questi dati si potrà conoscere: l intensità della fioritura sia per singolo individuo che per l intera popolazione, la durata della fioritura per individuo e della popolazione, il momento di massima fioritura (numero di giorni trascorsi dalla prima fioritura fino al giorno di picco della fioritura per pianta), la sincronia. Quest ultima consiste nell analizzare se la fioritura di un individuo si sovrappone con la fioritura di ogni altro individuo nella popolazione. Breeding system Il Sistema riproduttivo della specie è stato studiato mediante di 6 tipi diversi di esperimenti. Autoimpollinazione spontanea: questo esperimento è stato condotto su 18 fiori della popolazione naturale, 6 fiori della popolazione reintrodotta e 53 delle piante presenti all orto Botanico (di questi sono stati analizzati rispettivamente 8, 6 e 53 fiori in seguito al danneggiamento, a causa del pascolamento o del vento). I fiori sono stati messi dentro di un sacchetto di telo prima dall antesi e sono stati rimasti incappucciati fino al momento della raccolta dei semi. Questo ci ha permesso capire che il fiore è in grado di autoimpollinarsi. manuale self : consiste nell applicare polline di un fiore sullo stigma di un fiore della stessa pianta. Questi fiori sono incappucciati con un sacchetto prima del momento di antesi; il sacchetto è stato rimosso solo nel momento idoneo a praticare lo spostamento del polline dagli stami allo stigma. Questo esperimento è stato condotto su 21 fiori nella popolazione naturale, 19 nella popolazione reintrodotta e 57 nelle piante dell orto; (di questi sono stati analizzati rispettivamente 17, 11 e 57 fiori per le stesse cause sopra citate). manuale incrociata cross : consiste nel trasportare del polline dall'antera di un fiore allo stigma del fiore di un individuo differente. Questo tipo di incrocio è stato condotto su 27 fiori della popolazione naturale,23 nella reintrodotta e 56 nelle piante dell orto;(di questi sono stati analizzati rispettivamente 21, 18 e 56 fiori per le stesse cause sopra citate). Controllo: su questi fiori solo si deve mettere un etichetta identificativa e bisogna aspettare che si impollinino naturalmente. Questo esperimento ci permette di conoscere il successo riproduttivo delle impollinazioni naturali. Questo trattamento è stato fatto su 9 fiori della popolazione naturale (di questi sono stati analizzati rispettivamente solo 3 fiori per le stesse cause sopra citate), 5 della reintrodotta e 3 nell orto. Anemofilia: questi fiori vengono messi dentro sacchetti, con del telo di zanzariera, che lasciano passare il vento ma non gli impollinatori. Ho realizzato questo esperimento su 16 fiori della popolazione naturale, 9 della introdotta e 22 nelle piante dell orto; (di questi sono stati analizzati rispettivamente, 2 e 22 fiori per le stesse cause sopra citate). : i fiori vengono lasciati senza sacchetto, sotto impollinazione naturale e si aggiunge manualmente polline proveniente da un altra pianta. Questo esperimento ci permette di conoscere se le impollinazioni naturali hanno polline a sufficienza per produrre semi o se la specie presenta mancanza di polline. L esperimento è stato applicato su 6 fiori naturali, 5 su piante introdotte e 0 nelle piante dell orto ; (di questi sono stati analizzati rispettivamente, 2 e 0 fiori). Con questi risultati si è potuto capire che la specie è capace di produrre semi medianti tutti gli esperimenti. Successo riproduttivo I frutti formati dopo degli esperimenti d impollinazione sono stati raccolti e conservati in bustine di carta, (una bustina per ogni frutto etichettata con il codice del fiore e della pianta e con la data di raccolta). Successivamente, è stata calcolata l effettività dell esperimento calcolando il fruit-set, (proporzione di fiori impollinati che hanno formato il frutto), seed set (media di semi formati a partire del numero medio di ovuli formati per fiore), peso dei semi, percentuale di germinazione, T50 e giorni che la prima foglia della plantula ci mette ad emergere. 3

4 Popolazione naturale Media semi Peso medio 10 semi Fruit set % germinazione T50 Prima foglia Autoimpollinazione 15,88 0, ,23% - - Controllo 26,66 0, ,39% 7,36±1,85 Cross 30,52 0, ,6% 975,80±0,53 Self 33,16 0, ,7% 98% 3,89±0,09 supplementaria 32,8 0, % 90% 5,36±0,51 Anemofilia 18,2 0, ,33% 95% 3,72±0,0 Popolazione reintrodotta Media semi Peso medio 10 semi Fruit set % germinazione T50 Prima foglia Autoimpollinazione 6 0, ,66% 100 3,75±0,69 Controll 22 0, % - - Cross 23 0, ,66% 98,56±0,3 Self 28 0, ,5% 86,25,58±1,20 6 0, % 100 5,21±0,10 Anemofilia 0 0 0% 100,17±0,23 Esperimenti orto Media semi Peso medio 10 semi Fruit set % germinazione T50 Prima foglia Autoimpollinazione 15,28 0, ,75% 96,10±0,03 Controllo 28,70 0, ,75% 96,0±0,21 Cross 0,75 0,0119 9,28% 90 3,76±0,52 Self 31,2 0, ,55% 92,90±0,6 35,8 0,012 93,33% 97 3,71±0,36 Anemofilia 11,11 0,015 56,23% 92,18 3,8±0,29 Semi ottenuti nei diversi esperimenti: Popolazione naturale Frutti ottenuti Semi totali Self Cross Controllo Auto 9 12 Anemofilia Popolazione introdotta Frutti ottenuti Semi totali Self Cross Controllo 3 65 Auto 2 12 Anemofilia Esperimenti orto Frutti ottenuti Semi totali Self 1320 Cross Controllo Auto Anemofilia Test di germinazione in campo: Sono state fatte tre repliche di 0 semi per gli esperimenti di controllo e per l impollinazione, 50 semi per gli esperimenti di cross e self, 35 per l autoimpollinazione e 15 per gli esperimenti di anemofilia. Questi semi sono stati seminati in campo, nella popolazione naturale e lontani da altri individui di Dianthus morisianus al fine di assicurare che i semi che eventualmente germinano siano quelli seminati per noi. I semi sono stati messi all interno di colini di maglia fine. Questi colini sono stati posizionati nella sabbia, lasciando il bordo del colino al livello della superficie. I semi sono stati seminati a 3 centimetri di profondità sotto la superficie, seguendo il protocollo di Cogoni et al I colini sono stati fissati al substrato con paletti di legno per evitare che venissero spostati. Ogni colino è stato identificato attraverso un codice permanente per riconoscere la provenienza dei semi. I risultati di questo esperimento sono in fase di analisi.

5 Germinazione in laboratorio: Per conoscere il grado di germinazione dei semi appartenenti ad ogni esperimento, sono stati condotti test di germinazione. I semi sono stati incubati alle condizioni ottimali (15 C con 12/12h di luce/buio e sono stati monitorate ogni giorno). Con questi dati si potrà calcolare la percentuale di germinazione e il T50. I risultati di questo esperimento sono in fase di analisi. Repliche: Naturale Self Cross Introdotta Controllo 16x Vento 10 x Supplementario 10 x 7 x Plantule: I semi germinati nelle camere di crescita, fino ad un massimo di 30 per esperimento sono stati piantati in substrato nei banchi termo riscaldati (20 C) per potere analizzare la crescita a livello del numero di foglie il giorno in cui emerge la prima foglia la lunghezza della foglia più lunga. I risultati di questo esperimento sono in fase di analisi. Silene Il 18 febbraio sono stati messi a germinare 150 semi di Silene ichnusae e 150 semi di Silene velutina in vasi di 7l con substrato universale, torba, sabbia ed argilla. Su questi semi è stato calcolato il tasso di germinabilità. Di questi 150 semi sono germinati 78 per S. ichnusae e 2 per S. velutina e nove mesi dopo sono sopravvissute 7 piante di S. ichnusae e 1 di S. velutina. Diversamente da quanto atteso, quest anno la fioritura di entrambe le Silene si è verificata in anticipo, di conseguenza durante la prima escursione di campo le piante si trovavano già in fase di fruttificazione. Per questo motivo non è stato possibile realizzare gli stessi esperimenti fatti con Dianthus morisianus. Secondo anno: Ci si attende di studiare le popolazioni in situ di Silene ichnusae e Silene velutina seguendo lo stesso protocollo realizzato per Dianthus morisianus. Le piante di Silene ichnusa e S. velutina, saranno coltivate all orto per potere studiare la biologia riproduttiva delle specie ex situ. Bibliografia Bacchetta G, Brullo S, Casti M, Giusso del Galdo GP (2010) Taxonomic revision of the Dianthus sylvestris group (Caryophyllaceae) in central-southern Italy, Sicily and Sardinia. Nordic Journal of Botany 28: Bernadello G, Anderson GJ, Stuessy T, Crawford DJ (2001) A Survey of floral traits, breeding systems, floral visitors, and pollination systems of the angiosperms of the Juan Fernandez Islands (Chile). The Botanical Review 67: Bosch M, Simon J, Molero J, Blanché C (1998) Reproductive biology, genetic variation and conservation of the rare endemic dysploid Delphinium bolosii (Ranunculaceae). Biological Conservation 86: Brullo S, Signorello P (198). Silene hicesia, a new species from Aeolian islands. Will-denowia 1: Castro S, Silveira P and Navarro L (2008) Effect of pollination on floral longevity and costs of delaying fertilization in the out-crossing Polygala vayredae Costa (Polygalaceae). Annals of Botany 102:

6 Conti F, Abbate G, Alessandrini A, Blasi C (Eds.) An annotated checklist of the Italian Vascular Flora. Palombi Editori, Roma (2005)& Partner. Roma. Evans MEK, Menges ES, Gordon DR (2003) Reproductive biology of three sympatric endangered plants endemic to Florida scrub. Biological Conservation 111: Fenu, G, Mattana E, Bacchetta G (2011) Dianthus morisianus. In: IUCN IUCN Red List of Threatened Species. Version Jeanmonod D and Boquet G (1981) Remarques sur la distribution de Silene mollissima (L.) Pers. et des especes affines en Mediterranée occidentale. Candollea 36: Jeanmonod D (198): Révision de la section Siphonomorpha Otth du genere Silene L. (Caryophyllaceae) en Méditerranée occidentale, II: le groupe de S. mollissima. Candollea 39: Keifer H, and Boquet G (1979) Silene velutina Pourret ex Loiseleur (Caryophyllaceae) example of a Messinian destiny. - Candollea 3: Menges ES (1986) Predicting the future of rare plant populations: demographic monitoring and modelling. Natural Areas Journal 6: Myers N, Mittermeier RA, Mittermeier CG, da Fonseca GAB, Kent J (2000) Biodiversity hotspots for conservation priorities. Nature 03: Peruzzi L, Conti F, Bartolucci F (2012) Inventario delle piante vascolari endemiche d Italia. In S. Peccenini, G. Domina & C. Salmeri (eds.).flora vascolare d Italia: studi biosistematici, taxa endemici e loci classici: 5-6. Università di Roma Sapienza, Dip. di Biologia Vegetale, Orto Botanico Roma, Ottobre Rymer PD, Whelan RJ, Ayre DJ, Weston PH, Russell KG (2005) Reproductive success and pollinator effectiveness differ in common and rare Persoonia species (Proteaceae). Biological Conservation 123: Schemske DW, Husband BC, Rucklshaus MH, Goodwillie C, Parker IM, Bishop JG (199) Evaluating approaches to the conservation of rare and endangered plants. Ecology 75: Valente LM, Savolainen V, Vargas P (2010) Unparalleled rates of species diversification in Europe. Proc. R. Soc. B. 277: Weekley CW, Race T (2001) The breeding system of Ziziphus celata Judd ans DW Hall (Rhamnaceae), a rare endemic plant of the Lake Wales Ridge, Florida, USA: implications for recovery. Biological Conservation 100: Weller SG (199) The relationship of rarity to plant reproductive biology. In: Bowles ML, Whelan CJ (Eds.), Restoration of Endangered Species. Cambridge University Press, Cambridge, Young AG, Hill JH, Murray BG, Peakall R (2002) Breeding system, genetic diversity and clonal structure in the sub-alpine forb Rutidosis leiolepis F.Muell. (Asteraceae). Biological Conservation 106: Tipo di attività Date crediti Doing Scientific research -7/0/201 Corsi GIS 6-12/05/201 3 Corso Inglese B /201 1 Agrobiodiversity of the 16-21/06/201 Frequenza Summer school mediterranean area: a heritage to rediscover and conserve Convenio Providune 23/10/ Partecipazione a conferenze Convenio EcoplantMed 17/11/ Convenio GreatMed 17/11/ Partecipazione a congressi internazionali Lavoro scientifico su Atti di Congresso Internazionale Poster a congressi Relazioni annuali su attività Dottorato XXIII International Congress on Sexual Plant Reproduction Seeds for the future Is the threatened endemic Dianthus morisianus Vals. Caryophyllaceae) affected by inbreeding depression? Is the threatened endemic Dianthus morisianus Vals. Caryophyllaceae) affected by inbreeding depression? 1-18/07/201 10/12/