Uptake e accumulo di nanoparticelle a base di acido poli(lattico-co-glicolico) in Vitis vinifera e fitopatogeni fungini (Botrytis cinerea;

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1 Uptake e accumulo di nanoparticelle a base di acido poli(lattico-co-glicolico) in Vitis vinifera e fitopatogeni fungini (Botrytis cinerea; Aspergillus spp.)

2 Vitis vinifera e l attacco da patogeni fungini Botrytis cinerea Aspergillus spp. Fumonisina B1 Ocratossina A

3 Metodi tradizionali: i pesticidi Ossidazione Fotossidazione Biodegradazione Lisciviazione Inquinamento acqua Inquinamento suolo Regolamento 1107/2009 da Gennaio 2014

4 Nanobiotecnologia Somministrazione di pesticidi attraverso nanovettori Pesticida Nanoparticella

5 Nanocapsule polimeriche Lume Rivestimento Carico nm

6 Nanocapsule polimeriche PLGA: Acido poli(lattico-co-glicolico) 460 nm 500 nm

7 Dimensioni Metodo osmotico 600 nm 200 nm 1.5 μm 200 nm 30 nm Metodo microfluidico 1.5 μm 200 nm Misura del potenziale Z: carica superficiale negativa

8 PLGA NPs in sistemi vegetali e fungini Le PLGA NPs sono in grado di attraversare la parete e la membrana cellulare??? Cellula vegetale Cellula fungina Cellula animale Schrade et al. 2013; Macromolecular Bioscience

9 PLGA NPs in Vitis vinifera PLGA NPs con cumarina-6 Cellule in sospensione Analisi a fluorescenza Analisi TEM 15 mg l -1 3 gr cellule/ 20 ml B5N Localizzazione subcellulare Meccanismo d internalizzazione Uptake cellulare

10 Risultati: parte 1 Uptake cellulare

11 Localizzazione subcellulare Citoplasma Nucleo Vacuolo Siti d accumulo delle PLGA NPs: CITOPLASMA NUCLEO Risultati: parte 1

12 Localizzazione subcellulare PLGA NPs adese alla parete PLGA NP attraversa la parete Accumulo di PLGA NPs al livello citoplasmatico Risultati: parte 1

13 Uptake cellulare Parete cellulare: selezione dimensione dipendente nm 50 nm Risultati: parte 1

14 Meccanismo d internalizzazione FM μl 15 mg l -1 Risultati: parte 1

15 Risultati: parte 1 Meccanismo d internalizzazione

16 Meccanismo d internalizzazione Ikarugamicina 10 μm >30 min Bandmann et al FEBS Letters 586: Wortmannina 30 μm >30 min Anieto & Robinson 2005 Protoplasma 226:3-11 Acido salicilico 10 μm >30 min Du et al PNAS 110: Risultati: parte 1

17 PLGA NPs in piante di Vitis vinifera V. vinifera in vitro Analisi a fluorescenza

18 Assorbimento fogliare Incubazione con 2.5 mg l -1 PLGA NPs 1-5 min 5-15 min Segnale intenso: tricomi non ghiandolari Segnale intenso: pareti ventrali stomi 1-2 ore Parenchima palizzata Camera sottostomatica Risultati: parte 2

19 Assorbimento radicale Osservazione a 1-3 ore Incubazione con 2.5 mg l -1 PLGA NPs Segnale intenso: peli radicali Osservazione a 48 ore Segnale debole: strati 1-2 cilindro corticale Segnale intenso: strati 3-4 cilindro corticale Segnale intenso: cilindro vascolare Risultati: parte 2

20 Trasporto Controllo Osservazione a 48 ore Xilema RADICE xilema FOGLIA Risultati: parte 2

21 PLGA NPs in funghi fitopatogeni Botrytis cinerea Aspergillus niger Aspergillus carbonarius Sospensione fungina Analisi a fluorescenza

22 Uptake in cellule fungine Incubazione con 15 mg l -1 PLGA NPs Aspergillus niger Botrytis cinerea Osservazione a 1-5 minuti: Segnale intenso in corpi sferici di aspetto vescicolare Aspergillus carbonarius Risultati: parte 3

23 Ruolo della carica superficiale Guscio in PLGA: carica superficiale NEGATIVA Guscio in PLGA e sottile strato di chitosano: carica superficiale NEUTRA Guscio in PLGA e spesso strato di chitosano: carica superficiale POSITIVA Risultati: parte 4

24 Conclusioni PLGA NPs attraversano la parete e la membrana delle cellule vegetali (Vitis vinifera) e fungine (Botrytis cinerea; Aspergillus spp.) in relazione alla carica superficiale delle particelle PLGA NPs non attraversano il tonoplasto, accumulandosi al livello citoplasmatico ma non vacuolare, suggerendo come meccanismo d internalizzazione le vie di endocitosi PLGA NPs sono potenzialmente in grado di attraversare i tessuti di plantule di V. vinifera propagate in vitro

25 GRAZIE PER L ATTENZIONE