APPROCCIO ANALITICO ALL ANALISI TOSSICOLOGICA IN AMBITO VETERINARIO

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1 Istituto Zooprofilattico delle Regioni Lazio e Toscana APPROCCIO ANALITICO ALL ANALISI TOSSICOLOGICA IN AMBITO VETERINARIO Dr. Mila Nocentini Responsabile Laboratorio Chimico Sezione di Firenze V CONVEGNO NAZIONALE DEGLI ISTITUTI ZOOPROFILATTICI SPERIMENTALI SULL ALIMENTAZIONE ANIMALE

2 Indice di Presentazione Confronto fra tossicologia in ambito umano e veterinario Aspetti normativi Risultati ottenuti nel periodo Dati tossicologici di alcune sostanze Principi di farmacocinetica Quali matrici? Quali metodi analitici? Conclusioni

3 Tossicologia umana Clarke s s Analysis of drugs and poisons Part 1 Chapters Edited by A. Moffath et al. 3 TH edition 1. Hospital toxicology 2. Drugs of abuse 3. Alcohol, drugs and driving 4. Workplace drug testing 5. Forensic toxicology 6. Post mortem toxicology 7. Drugs in saliva 8. Hair analysis 9. Drug abuse in sport 10. Therapeutic drug monitoring 11. Quality control and assessment 12. Farmacocinetics and metabolism 13.Natural toxins 14. Pesticides 15. Volatile substances.

4 Tossicologia veterinaria Veterinary toxicology: : basic and clinical principles Chapters Edited by Ramesh C. Gupta. 1. General 2. Organic toxicity 3. Nanoparticle, radiation and carcinogenesis 4. Drugs of use and abuse 5. Metals and micronutriens 6. Insecticides and molluscicides 7. Rodenticides and avicides 8. Herbicides and fungicides 9. Industrila toxicans 10. Enviromental toxicology 11. Bacterial toxins 12. Poisons and venomous organism 13. Extrogenic toxicants 14. Poisonus plants 15.Mycotoxins 16. Feed and water contaminants.

5 Aspetti normativi Legge Regionale 16 Agosto 2001 N. 39 (Bollettino Ufficiale della Regione Toscana n. 27 del 27/08/01) Norme sul divieto di utilizzo e detenzione di esche avvelenate Art. 7: Analisi di laboratorio anche ricorrendo alle strutture dell Istituto Zooprofilattico di cui alla legge regionale 29 luglio 1999 n. 44

6 Aspetti normativi ORDINANZA 10 febbraio 2012 del Ministero del Lavoro, della Salute e delle Politiche Sociali (Gazzetta Ufficiale n. 58 del 09/03/12) Norme sul divieto di utilizzo e di detenzione di esche o di bocconi avvelenati Art. 3. Istituti Zoooprofilattici Sperimentali 1. Gli Istituti zooprofilattici sperimentali sottopongono a necroscopia l'animale ed effettuano gli opportuni accertamenti e analisi di laboratorio sui campioni pervenuti o prelevati in sede necroscopica. 2. Gli Istituti eseguono la necroscopia entro quarantotto ore e le analisi entro trenta giorni dall'arrivo del campione, comunicandone gli esiti al medico veterinario che ha segnalato l'evento, al Servizio veterinario dell'azienda sanitaria locale territorialmente competente, al sindaco e, in caso di accertato avvelenamento, all'autorita' giudiziaria.

7 Risultati periodo Numero di Analisi effettuate ANNO Numero di Campioni Campioni Positivi , , , , , , ,2 Totale Percentuale di Positività

8 Distribuzione delle positività nel periodo 2005/2011 Stricnina Crimidina Metaldeide Fosfuro di Zinco Anticoagulanti P. organoclorurati P. Organofosforati P. Carbammati % Positività

9 Warfarin Dicumarolo flocumafen Anticoagulanti Cumarina Brodifacoum Difenacoum Bromadiolone Warfarin Coumatetralyl Coumachlor Brodifacoum Coumatetralyl Coumachlor Difenacoum Bromadiolone Positivi (%)

10 Pesticidi PESTICIDI ORGANOCLORURATI I pesticidi organoclorurati sono composti nei quali esiste almeno un legame carbonio- cloro Questi insetticidi sono generalmente molto lipofili e non vengono trasformati in metaboliti più idrofli ed escreti. Sono così capaci di suddividersi nei tessuti grassi e bioaccumularsi. PESTICIDI ORGANOFOSFORATI PESTICIDI CARBAMMATI I pesticidi organofosforati sono ampiamente utilizzati in agricoltura nelle coltivazioni di frutta vegetali e cereali. L intossicazione acuta da organofosforici è determinata dall inattivazione irreversibile dell enzima acetilcolinesterasi che blocca la degradazione del neurotrasmettitore acetilcolina. I carbammati e i ditiocarbammati sono utilizzati come insetticidi, erbicidi e fungicidi. Preferiti agli organoclorurati perché meno stabili, si decompongono facilmente. Agiscono causando inibizione della colinesterasi per inattivazione reversibile dell'enzima acetilcoliesterasi.

11 Molecole appartenenti alle 3 famiglie di pesticidi, clorurati, fosforati e carbammati che hanno mostrato la maggior incidenza Positivi (%) Endosulfan Coumaphos Isofenphos Methiocarb Carbofuran Altri Endosulfan: pesticida organoclorurato è costituito dagli isomeri alfa e beta che possono essere metabolizzati in solfato di endosulfan e diolo di endosulfan Coumaphos, isofenfos: Pesticidi organofosforati, il primo usato come acaricida il secondo come insetticida Methiocarb, carbofuran: pesticidi carbammati, il primo è usato come lumachicida, il secondo è un insetticida spesso usato in combinazione con isofenfos

12 DISTRIBUZIONE DELLE POSITIVITA Positivi (%) Esche CANE GATTO VOLATILI AN SELVATICI CAVALLO OVINI LAGOMORFI

13 Dati tossicologici di alcune sostanze STRICNINA ENDOSULFAN METALDEIDE FOSFURO DI ZINCO COUMARINICI

14 STRICNINA La stricnina è un alcaloide che si presenta sotto forma di polvere bianca, cristallina, inodore ed insolubile in acqua. Si estrae Strychnos nux vomica L. (Fam. Loganiacee Pianta arborea originaria delle zone tropicali dell Asia Tra gli animali domestici i gatti sono quelli più suscettibili alla stricnina. Suini e cani mostrano la stessa sensibilità, mentre gli equini sono capaci di tollerare quantità relativamente elevate di stricnina. I bovini sono molto resistenti all ingestione di stricnina, presumibilmente dovuto alla parziale distruzione che ne effettuano nel rumine. La dose letale di stricnina negli animali è compresa tra 0.2 e 1.0 mg/kg: Nei cani va da 0.5 e 0.8 mg/kg la stricnina determina delle alterazioni a carico della muscolatura scheletrica con iperestensione degli arti e rigidita' della maggior parte dei muscoli estensori poiche' inibisce l'azione della glicina che e' un neurotrasmettitore inibitorio. Cit. TOXNET - Databases Shapes: on toxicology, Introductory hazardous basics chemicals, you can't environmental live without health, and toxic releases.

15 Endosulfan Pesticida organoclorurato, usato come insetticida in agricoltura, in particolar modo nelle coltivazioni di cotone E costituito dagli isomeri alfa e beta che possono essere metabolizzati in solfato di endosulfan e diolo di endosulfan. Dopo ingestione, l endosulfan è rapidamente assorbito dal tratto gastrointestinale e distribuito ai reni, al fegato e, in misura minore, ad altri tessuti. L isomero beta è più facilmente assorbito dell isomero alfa. I cani mostrano sintomi di intossicazione da Endosulfan per ingestione di pesticida superiori a 200 mgkg. Salivazione, emesi e convulsioni sono i tipici segnali mostrati. L ingestione di circa 8g di endosulfan risulta letale per un bovino entro le 15 ore successive. Una dose di 8 mg/kg giornaliera per due giorni consecutivi produce segnali di avvelenamento negli ovini Cit. TOXNET - Databases Shapes: on toxicology, Introductory hazardous basics chemicals, you can't environmental live without health, and toxic releases.

16 Metaldeide La metaldeide è un tetramero ciclico dell acetaldeide che si presenta come una polvere bianca dall odore di aldeide. Questo composto è un lumachicida molto efficace e molto usato perché presenta un particolare tropismo nei confronti dei gasteropodi Essa è rapidamente assorbita dal tratto gastrointestinale probabilmente in differenti frammenti di polimeri di acetaldeide Nei cani tipici sintomi sono emesi, depressione, tremori, perdita di coordinazione, iperpnea, tachicardia prostazione e cianosi. Nei gatti i sintomi di tossicità sono simili a quelli dei cani, ma spesso si evidenzia anche il nistagmo Gli avicoli mostrano eccitabilità, tremori, spasmi muscolari e diarrea La dose letale di metaldeide negli animali è compresa tra 100 e 1000 mg/kg: Nei cani va da 250 e 1000 mg/kg Cit. TOXNET - Databases Shapes: on toxicology, Introductory hazardous basics chemicals, you can't environmental live without health, and toxic releases.

17 Fosfuro di zinco Il fosfuro di zinco è usato come rodenticida. Si presenta sotto forma di polvere grigia, insolubile in acqua ed in etanolo. e che in ambiente acido si decompone per dare origine a fosfina. Il fosfuro di zinco, una volta ingerito reagisce con acqua ed HCl nel tratto gastro-intestinale per produrre il gas fosfina (PH3), gas altamente tossico. La sua tossicità è dovuta proprio al rilascio dopo ingestione di FOSFINA mentre la componente metallica non sembra mostrare tossicità La dose letale per bovini, ovini, suini, cani e gatti è compresa tra 20 e 40 mg/kg Negli avicoli è compresa tra 10 e 30 mg/kg Cit. TOXNET - Databases Shapes: on toxicology, Introductory hazardous basics chemicals, you can't environmental live without health, and toxic releases.

18 Coumarinici Gli anticoagulanti si dividono in sostanze di prima generazione e di seconda generazione. Alla prima generazione appartengono warfarin, coumatetralyl. I composti della seconda generazione includono difenacoum, bromadiolone, brodifacoum Questi agiscono con due diverse modalità: alterano il processo della coagulazione del sangue ed inibiscono a livello intestinale la crescita dei microorganismi preposti alla sintesi di Vitamina K. Questa vitamina, che è coinvolta nell attivazione di ben quattro fattori della coagulazione: fattore II (PROTROMBINA), fattore VII (PROCONVERTINA), fattore IX (FATTORE ANTIEMOFILICO B) e fattore X (FATTORE DI STUART). Negli animali domestici i sintomi di avvelenamento compaiono dopo un periodo che va da 12 ore a parecchi giorni e possono includere sanguinamento gengivale, sangue nelle urine eccessivo sanguinamento per piccole abrasioni, La dose letale (es brodifacoum) negli animali è compresa tra 0.05 e 4 mg/kg Negli cani è compresa tra 0.25 e 3 mg/kg Cit. TOXNET - Databases Shapes: on toxicology, Introductory hazardous basics chemicals, you can't environmental live without health, and toxic releases.

19 Farmacocinetica 3 principali processi A) assorbimento B) distribuzione nei tessuti C) eliminazione Modalità di assunzione: prevalentemente orale

20 Assorbimento Organo ph Area Superficiale Stomach Small intestine 1-3 S1 5-7 S2 7-8 <5 m m 2 Colon 7-8 <5 m 2 Assorbimento Shapes: del Introductory tossico nel basics tratto you can't gastro live without intestinale

21 Eliminazione attraverso il fegato

22 Eliminazione attraverso i reni Rappresentazione schematica di un nefrone

23 Metabolizzazione La metabolizzazione è parte integrante dell eliminazione del tossico Queste biotrasformazioni avvengono principalmente a livello epatico e anche renale. A) Trasformazioni sintetiche o coniugazioni B) Trasformazioni non sintetiche

24 Trasformazioni sintetiche o coniugazioni Glicuronazione Solfatazione Glicil coniugazione Acetilazione Metilazione Trasformazioni non sintetiche Ossidazioni Riduzioni Idrolisi

25 Endosulfan

26 Parathion Fosfuro di zinco Zn 3 P 2 + 6H + 2PH Zn 2+

27 Quali matrici? Matrici non omogenee Esche Stomaco, contenuto gastrico, vomito: Campione essenziale nella procedura di screening, contiene normalmente la dose più alta di tossico in seguito ad un assunzione per via orale Sangue: contiene il tossico ed i suoi metaboliti, è un buon campione nel caso di avvelenamento da gas o composti volatili, se il campione viene adeguatamente conservato. Urine: via di eliminazione del tossico e dei metaboliti

28 Quali matrici? Fegato: I tossici e loro metaboliti tendono ad essere presenti nel fegato in concentrazione più elevata rispetto alla concentrazione nel sangue. Reni: nel caso di avvelenamento da metalli, i reni mostrano danni evidenti, e il tossico tende ad accumularsi in questo tessuto. Nel caso di tossicità cronica l accumulo avviene a livello dei capelli ed ossa

29 Tabella matrici

30 Tabella matrici

31 Tabella matrici

32 Tabella matrici

33 ESCA ESAME VISIVO Dati relativi alla Provincia L. R 39/2001 METODO ANALITICO In caso di decesso dell animale prelievo di altre matrici

34 Sintomi clinici dati necroscopici Tossico o suoi metaboliti Matrice Metodo di Analisi

35 Tecniche analitiche Saggi colorimetrici Fosfuri: (Alluminio, Magnesio, Zinco e Calcio) M x P y + H + yph 3 + M x+ Bumbrah G.S., et al. Phosphide poisoning: a review of literature Forensic Sci Int 214(2012) 1-6 Metaldeide: Con acido solforico e guaiacolo sviluppo colorazione fucsia Matrici principali: Esche, Contenuto gastrico

36 Tecniche analitiche ANALITI TECNICA MATRICE Metalli Pesticidi (Organoclorurati, organofosforati, piretroidi, carbammati ) ICP MS GC MS Esca, fegato, rene, contenuto gastrico Esca, fegato, contenuto gastrico Fosfuro di zinco Esca,contenuto gastrico Rodenticidi (derivati della cumarina ed altri) Pesticidi basso bollenti HPLC MS Esca, fegato Esca, fegato, contenuto gastrico

37 Tecniche analitiche: estrazione METALLI Mineralizzazione a microonde in ambiente acido Estrazione in GPC PESTICIDI Metodo QuEChERS RODENTICIDI Estrazione Colonne SPE Metodo QuEChERS

38 Tecniche analitiche: estrazione QuEChERS (Quick, Easy, Cheap Effective, Rugged, Safe) Step 0 Step 1 Omogeneizzazione del campione di fegato Trasferimento di 3g nella provetta QuEChERS di estrazione e aggiunta 12 ml di acqua Step 2 15 ml di 1% AcOH in MeCN. Aggiunta della fase QuEChERS di estrazione (MgSO 4 + NaOAc). Step 3 Step 4 Step 5 Trasferimento di 8 ml del surnatante nelle provette QuEChERS d-spe (PSA + MgSO 4 ). Purificazione con florisil Evaporazione di 4 ml a 50 C con N 2 fino al volume di ml. Aggiunta di toluene fino a 1 ml Analisi GC-MS/ HPLC MS Lehotay S. J., (2007) J. AOAC INT 90,2, ; Murphy L. et al., (2010) J. Anal Toxicol vol 34 june

39 RT: RelativeAbundance Cromatogramma di un campione di fegato di cane estratto in GCP (gel permeation chromatography) NL: 3.16E8 TIC F: MS Time (min) RT: Relative Abundance Cromatogramma di un campione di fegato di cane estratto con i QuEChERS NL: 3.39E8 TIC F: MS Time (min)

40 Conclusioni Campioni omogenei (fegato e rene) metodi quantitativi Campioni non omogeni (esche, contenuto gastrico) metodi qualitativi Accreditamento delle prove Per ottenere buoni risultati nelle analisi tossicologiche restano fondamentali alcune informazioni quali: sintomatologia e dati necroscopici Informatizzazione dei dati relativi alle schede di accompagnamento (O.M 10/02/2012)

41 Collaboratori -Claudia Focardi -Martina Fortini -Chiara Giannetti