C.I. MEDICINA DI LABORATORIO Microbiologia Clinica CL Medicina e Chirurgia AA Modulo 9: PERTOSSE. Giovanni Di Bonaventura, PhD

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1 C.I. MEDICINA DI LABORATORIO Microbiologia Clinica CL Medicina e Chirurgia AA Modulo 9: PERTOSSE Giovanni Di Bonaventura, PhD Università G. d Annunzio di Chieti-Pescara Dipartimento di Scienze Mediche, Orali e Biotecnologiche Nuovo Polo Farmacia, corpo D, III livello (tel ) Centro Scienze dell Invecchiamento (Ce.S.I.), V livello (tel ) gdibonaventura@unich.it

2 epidemiologia La pertosse, comunemente chiamata tosse convulsa, è una malattia altamente contagiosa del sistema respiratorio causata da coccobacilli Gram-negativi: La maggior parte di questi casi è causata da Bordetella pertussis; tuttavia, il 3-35% dei casi di pertosse è causato da Bordetella parapertussis, che dà una patologia più mite, simile alla pertosse; possibili co-infezioni B. bronchiseptica (bronchite in cani e gatti), B. holmesii (raramente causa infezioni sistemiche in neutropenico) Classicamente considerata come malattia dell infanzia, la pertosse può essere riscontrata, in forma atipica, in adolescenti ed adulti: prima della introduzione della vaccinazione, l 80% dei casi era osservato negli adolescenti l immunità conferita da malattia naturale e dalla vaccinazione declina nel tempo fino a scomparire a distanza di 5-10 anni una seconda vaccinazione non è indicata a causa degli effetti collaterali Prima della introduzione della vaccinazione nell infanzia, la pertosse era una delle principali cause di mortalità infantile in tutto il mondo. Nonostante il raggiungimento di una copertura vaccinale estesa la pertosse è ancora endemica probabilmente a causa della diminuzione della protezione vaccinale associata ai nuovi vaccini acellulari (vaccino contro pertosse, difterite e tetano, DTaP). Nei Paesi industrializzati, rappresenta infatti la malattia meno controllata tra quelle prevenibili da vaccino (5 milioni di nuovi casi e decessi/anno). La trasmissione dell infezione avviene da malato a sano, attraverso le goccioline di saliva emesse con la tosse, gli starnuti o anche semplicemente parlando. La contagiosità si estende dall inizio del periodo catarrale fino a 2 settimane dalla comparsa della tosse. Non si ammette l esistenza di portatori sani ma solo di malati in forma atipica o asintomatica. 2

3 clinica La classica sintomatologia comprende una fase catarrale (1-2 settimane), seguita da una fase parossistica (1-6 settimane) ed infine una fase di convalescenza (da 2-4 settimane a diversi mesi). La fase catarrale è caratterizzata da sintomatologia aspecifica (rinorrea, starnuti, tosse). Assenza di febbre. La fase parossistica è caratterizzata da frequenti episodi di tosse convulsa, urlo (stridìo) inspiratorio ed emesi post-tussiva. Al termine dell urlo inspiratorio può manifestarsi apnea e soffocamento. I sintomi nei ragazzi più grandi e negli adulti possono essere atipici (soprattutto nei soggetti vaccinati) e generalmente più lievi: fase parossistica dilatata, presenza di stridìo soltanto nel 20-40% dei casi, minore fequenza di emesi post-tussiva. Leucocitosi ( WBCs/mm 3 e conta assoluta linfocitaria > /mm 3 ) generalmente presente anche se in alcuni casi di minore intensità o assente. Diagnosi differenziale: infezione virale (adenovirus, virus respiratorio sinciziale, virus influenzali), infezioni batteriche (M. pneumoniae, M. tuberculosis), esacerbazione di bronchite cronica, cause non infettive (scolo retronasale, asma, presenza di oggetti estranei, reflusso gastrointestinale, tumori). 3

4 diagnosi La diagnosi deve essere rapida per limitare la severità dei sintomi e ridurre il periodo di contagiosità. Il saggio più idoneo per diagnosticare la pertosse dipende dalla fase temporale della malattia. Nelle indicazioni fornite dai Centers for Disease Control and Prevention (CDC) si raccomanda una combinazione di saggi diagnostici: entro 2 settimane da insorgenza della tosse: utilizzo simultaneo di coltura e PCR* in presenza di tosse da 2 a 4 settimane: PCR e dosaggio delle IgGPT nel siero in presenza di tosse da più di 4 settimane: saggi sierologici * possibile eseguire anche DFA (Direct-Fluorescent Antigen) test 4

5 campione biologico: prelievo e trasporto Prima di effettuare il prelievo del campione: richiedere informazioni al paziente per setto deviato od ostruzione nasale, ed invitarlo a soffiarsi il naso. Tampone rino-faringeo: 1. Inserire nella narice un tampone sterile in dacron ad asta flessibile e, seguendo il pavimento della fossa nasale, arrivare al nasofaringe posteriore. 2. Lasciarlo in sede per almeno 10 secondi per adsorbire i germi presenti nel muco. E consigliabile: - prelevare 2 campioni (uno per narice): uno per il colturale, l altro per la ricerca molecolare (PCR). - in alternativa, effettuare subito un nuovo prelievo per raccogliere le secrezioni stimolate dal primo scraping. - non utilizzare tamponi in cotone o alginato di calcio, controindicati per l amplificazione in PCR. Aspirato rino-faringeo: 1. Paziente in posizione supina ed a collo esteso. 2. Collegare un catetere per alimentazione pediatrico ad una siringa sterile. 3. Caricare il catetere con soluzione fisiologica, inserirlo nella narice e spingerlo fino al rinofaringe posteriore. 4. Espellere ed aspirare la soluzione fisiologica rapidamente. 5. Aspirare delicatamente il muco. Gold standard: aspirato rino-faringeo, in quanto consente di campionare una superficie mucosale maggiore; inoltre, il campione è maggiormente protetto da eventuali contaminazioni. Trasporto: entro 3 h a RT, altrimenti il campione viene mantenuto in un terreno di trasporto (Regan-Lowe, Amies charcoal transport medium) per max 24h (+4 C). 5

6 isolamento colturale Gold standard per la conferma di laboratorio di un caso sospetto di pertosse, l isolamento del ceppo batterico consente la tipizzazione molecolare e la valutazione della sensibilità agli antibiotici farmaci utilizzati per il trattamento terapeutico. La sensibilità dell indagine colturale è massima nelle prime due settimane, in corrispondenza della fase catarrale. Ridotta sensibilità nei soggetti già vaccinati ed in quelli sottoposti a terapia. Il campione viene seminato su terreni selettivi e non- per la ricerca di Bordetella: Regan-Lowe agar - contenente carbone (neutralizza acidi grassi e perossidi, tossici per B. pertussis), sangue di cavallo (favorisce la crescita), cefalexina (inibisce la normale flora del nasofaringe) Bordet-Gengou agar con e senza cefalexina; consente la osservazione della modulazione del fenotipo di virulenza di B. pertussis in dipendenza delle condizioni ambientali (temperatura e composti chimici): fase I (espressione fattori virulenza), fase II o III (perdita emolisi), fase IV (perdita virulenza) Le piastre vanno incubate a C in aerobiosi (Bordetella è aerobio stretto), in elevata umidità ed ispezionate a giorni alterni fino a 7 giorni. Le colonie, di piccole dimensioni (1 mm Ø) hanno aspetto lucido simile a «goccia di mercurio». Colorazione Gram: cocco-bacilli Gram- di piccole dimensioni. Per le colonie con il profilo biochimico corrispondente al genere Bordetella, si procede con la sierotipizzazione mediante agglutinazione su vetrino con antisiero specifico per le fimbrie (Fim 2, Fim 3) di B. pertussis e B. parapertussis. 6

7 diagnostica molecolare RT-PCR o PCR Target: B. pertussis: Insertion Sequence IS481 ed il promotore della tossina (ptxp). B. parapertussis: Insertion Sequence IS1001. B. holmesii: reca. Per la diagnosi molecolare di B. bronchiseptica si esegue una PCR sul gene fla. PCR + HYBRIDIZATION 7

8 diagnostica sierologica Esistono vari saggi ELISA con antigeni purificati o misti, ma solo la PT (tossina pertossica) è specifica per B. pertussis. L emagglutinina filamentosa (FHA) e la pertactina (PRN) sono infatti presenti in altre specie di Bordetella e in altri batteri quali Haemophilus, M. pneumoniae, E. coli. Il ruolo degli anticorpi di isotipo IgA e IgM come indice di risposta protettiva non è ancora chiaro. La diagnosi sierologica basata su campioni appaiati (da fase acuta e da convalescenza, distanziati di 4 settimane) è un metodo sensibile e specifico e dovrebbe registrare un aumento di IgG anti-pt dal primo al secondo campione. Tuttavia, la difficoltà di ottenere due prelievi e l incertezza nei valori diagnostici fa si che la diagnosi basata su un singolo campione sia quella prevalentemente utilizzata. valori di IgG anti-pt > 120 IU/mL indicano un infezione recente valori compresi fra 50 e 120 IU/mL possono suggerire un contatto recente ma non sicuro. La determinazione delle IgA anti-pt può essere utilizzata ma solo con livelli indeterminati di IgG anti-pt. La diagnosi sierologica non è attendibile in: pazienti che siano stati vaccinati da meno di un anno: i vaccini ap contengono PT, FHA e PRN come antigeni vaccinali infanti a causa della immaturità del sistema immune e della interferenza con gli anticorpi materni 8

9 direct-fluorescent antigen (DFA) B. pertussis e B. parapertussis possono essere ricercate direttamente nel campione mediante l utilizzo di anticorpi mono-/policlonali taggati con molecola fluorescente. Da effettuare in combinazione con colturale o NAATs. I risultati sono presuntivi e debbono confermare il sospetto clinico e/o alter evidenze di laboratorio. Possibili falsi-positivi e falsi-negativi 9