Microscopia Raman. - S.Prati, Analisi dei materiali organici (modulo 2), Lezione 5 -
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- Flaviano De Angelis
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1 Microscopia Raman
2 Spettroscopia Raman Tipologia di informazione: composizione molecolare, l ambiente chimico, la fase e la struttura cristallina Tipologia di materiale: gas, liquidi e solidi amorfi o cristallini Profondità di campionamento: pochi um (analisi superficiale)
3 Effetto Raman La tecnica sfrutta un fenomeno fisico scoperto nel 1928 dal fisico Indiano C.V. Raman, che gli valse il premio Nobel nel Egli scoprì che una piccola frazione della radiazione diffusa da certe molecole aveva energia diversa da quella della radiazione incidente, e che la differenza di energia era legata alla struttura chimica delle molecole responsabili della diffusione
4 Il principio su cui si basa la tecnica Raman è la diffusione di una radiazione monocromatica incidente sul campione. Quando una radiazione monocromatica colpisce una sostanza può provocare i seguenti effetti: - la maggior parte della radiazione passa attraverso il campione - una piccola parte della radiazione diffonde elasticamente in tutte le direzioni senza perdita di energia, cioè alla stessa frequenza della radiazione incidente (diffusione elastica o Rayleigh)c - una parte ancora più piccola viene invece diffusa anelasticamente cedendo (diffusione Raman Stokes) o acquisendo (diffusione Raman anti-stokes) energia nell'interazione con la molecola, vibrando così a frequenze che differiscono per quanti energetici vibrazionali.
5 Effetto Raman A temperatura ambiente, il livello vibrazionale fondamentale è più popolato, quindi le linee Stokes sono più intense delle anti-stokes. Inoltre, le linee Stokes e quelle anti-stokes sono simmetriche rispetto alla linea Rayleigh (differiscono entrambe di hν1 rispetto alla Rayleigh)
6 Spettro Raman
7 Frequenze di gruppo Raman I segnali Raman corrispondenti ai vari legami chimici sono ovviamente collocati nelle stesse regioni spettrali descritte per la spettroscopia infrarossa, fatte salve le differenze dovute alle regole di selezione Molte sostanze inorganiche presentano segnali Raman generalmente nel range cm -1, una regione spettrale di difficile utilizzo nell IR
8 Confronto Raman - IR Le differenze energetiche tra la radiazione incidente, e quindi la radiazione Rayleigh, e le radiazioni Raman corrispondono in termini di lunghezze d onda alla regione del medio infrarosso o MIR, ovvero nell intervallo µm (o nell intervallo di numeri d onda cm -1 ). Per questo motivo, in alcuni casi lo spettro Raman e quello infrarosso di una sostanza possono essere simili in quanto entrambi risultano da cambiamenti vibrazionali quantizzati
9 Confronto Raman - IR - Tecniche complementari e non competitive basatesu fenomeni diversi e con diverse regole di selezione (alcuni modi di vibrazione sono attivi nell IR e non nel Raman e viceversa) -Vantaggio della tecnica Raman: * l acqua e il vetro non causano interferenze * linee dello spettro Raman sono generalmente più strette - Vantaggio della tecnica IR: * spettri solitamente più ricchi di segnali e quindi tecnica di più generale applicazione
10 Spettrometro Raman
11 Esempio di spettro Raman Nello spettro Raman si ha in ordinata l intensità di emissione luminosa e in ascissa la frequenza assoluta in cm -1 oppure, più comunemente, lo spostamento Raman o Raman shift, cioè la differenza in numeri d onda tra la radiazione osservata e la radiazione incidente: Δσ = (σ oss - σ inc ) cm -1 Normalmente la parte dello spettro con i segnali Stokes, quella più informativa, è indicata per semplicità in cm -1 positivi, benchè si tratti in realtà di differenze negative Esempio: eccitazione con λ = 488 nm (equivalente a σ = cm -1 ), segnale Raman a 60 cm -1 Intensità Rayleigh 1.E+07 1.E+06 1.E+05 1.E+04 1.E+03 1.E+02 1.E+01 1.E+00 N.B. l energia associata alla vibrazione è soltanto il Δσ, non la σ o la λ assoluta! Numeri d'onda (cm-1) Raman shift (cm-1) Raman
12 Esecuzione di una misura Raman Per ottenere lo spettro Raman di un campione si utilizza una sorgente monocromatica con lunghezza d onda nel vicino UV, nel visibile o nel vicino infrarosso (NIR). Attualmente sono impiegate sorgenti LASER; alcuni esempi sono i seguenti: Laser UV, 244 o 325 nm Laser ad Argon, nm o nm Laser a He-Ne, nm Laser a rubino, nm Laser Nd-YAG (ittrio alluminio granato drogato con neodimio), 1064 nm La radiazione laser è focalizzata sul campione; le radiazioni diffuse dalla superficie sono raccolte, rivelate dal detector e mostrate sotto forma di spettro
13 Qual è il laser migliore? Lo spostamento Raman, per un dato legame ed un determinato modo di vibrazione, è indipendente dalla dalla lunghezza d onda del laser, ma dipende esclusivamente dalla differenza tra due stati vibrazionali per un dato legame l intensità di emissione Raman è proporzionale alla quarta potenza della frequenza della sorgente: l energia in gioco con laser a più alta frequenza (UV, visibile) è in grado di attivare nel campione transizioni elettroniche non desiderate che possono generare fenomeni di fluorescenza un altro inconveniente dei laser ad alta frequenza è il danno che possono causare ai campioni durante l irraggiamento, causando fotodecomposizione e quindi emissione di spettri Raman anomali nella caratterizzazione di pigmenti, si verifica sperimentalmente che il laser verde (514.5 nm) è più adatto nell ottenere spettri di pigmenti blu e verdi, mentre il laser rosso (632.8 nm) è più adatto per pigmenti rossi e gialli.
14 Esempio Nell esempio si nota in maniera evidente come la radiazione laser scelta per eccitare il campione, in questo caso un colorante, possa dare risultati pessimi (spettro nullo, sopra) o ottimi (spettro composito, sopra)
15 Spettrometri Raman portatili
16 Microscopia Raman Negli spettrometri Raman dotati di microscopio l'area interessata dall analisi può essere limitata a poche unità fino ad alcune centinaia di µm 2, a seconda del laser e dell'obiettivo utilizzati. Gli obiettivi normalmente impiegati sono 10x, 20x, 50x, 80x e 100x
17 Microscopia Raman Analisi di un pigmento di aspetto macroscopicamente grigio
18 Spettrometri Raman Come per la spettroscopia infrarossa, anche in quella Raman sono utilizzati due tipi di strumenti: quelli dispersivi, in cui la radiazione diffusa dal campione viene dispersa sequenzialmente con un sistema monocromatore chiamato reticolo, e quelli a Trasformata di Fourier o FT-Raman, in cui lo spettro Raman è raccolto contemporaneamente su tutto l intervallo di interesse utilizzando l algoritmo matematico omonimo La focalizzazione del Laser sul campione è possibile attraverso un sistema ottico semplice (specchi o lenti) oppure, come detto in precedenza, attraverso l impiego di un microscopio
19 Schema di uno strumento Raman dispersivo
20 Spettrometro FT-Raman da banco Inconveniente: rivelatore al Germanio raffreddato con azoto liquido (negli strumenti dispersivi è un CCD)
21 Spettrometri Raman/FT-IR Tecniche complementari, comparti campione separati µraman e FTIR-ATR combinati, agiscono sullo stesso campione
22 Combinato Raman-SEM Esegue sul campione sia l analisi molecolare (Raman) sia l analisi elementare (SEM-EDS) o morfologica (SEM)
23 Risoluzione spaziale Tra le tecniche di analisi molecolare, la spettrometria Raman è quella dotata di migliore risoluzione spaziale: può arrivare a distinguere due punti distanti 1 µm
24 DATA BASE ON LINE archivio di spettri Raman di pigmenti, uno dei primi e più importanti siti web dedicati all analisi di pigmenti, gestito dallo University College London e in particolare dal Prof. R.J Clark, forse il massimo esperto di Raman e pigmenti archivio di spettri di minerali, riferimento importante sia per i pigmenti sia per i materiali lapidei minerals.gps.caltech.edu/files/raman/caltech_data/index.htm archivio di spettri di minerali del California Institute of Technology
25 Per valutare la capacità diagnostica della spettrometria Raman è sufficiente confrontare gli spettri ottenibili da pigmenti rossi aventi composizione chimica differente
26 Spettri Raman di tre forme cristalline dell ossido di titanio: anatasio (tetragonale), brookite (ortorombica) e rutilo (tetragonale) Spettri TiO Intensità Anatasio Brookite Rutilo Raman shift (cm-1)
27 ANALISI DELLA COMPONENTE ORGANICA FLUORESCENZA!!!!
28 FLUORESCENZA -PRESENZA DI MATERIALE ORGANICO CONTENENTE SPECI CROMOFORE (COLORANTI ORGANICI O GLI STESSI LEGANTI) - INQUINANTI ESTERNI - PRODOTTI DI DEGRADO La fluorescenza si mostra come picco molto largo e scodato che copre i deboli picchi Raman.
29 Near-infrared laser Laser: 780 nm Spatial resolution down to 1 um. Due to the low quantum efficiency of the CCD detector towards the infrared region, peaks with an acceptable S/N ratio at higher wavenumbers could only be obtained with prolonged integration times. P. Vandenabeele, B. Wehling, L. Moens, H. Edwards, M. De Reu, G. Van Hooydonk, Analytica Chimica Acta 407 (2000)
30 Near-infrared laser Laser: 780 nm Spatial resolution down to 1 um. Due to the low quantum efficiency of the CCD detector towards the infrared region, peaks with an acceptable S/N ratio at higher wavenumbers could only be obtained with prolonged integration times. P. Vandenabeele, B. Wehling, L. Moens, H. Edwards, M. De Reu, G. Van Hooydonk, Analytica Chimica Acta 407 (2000)
31 Fluorescence and Raman spectra on painting materials: reconstruction of spectra with mathematical methods SERDS (shift excitation difference spectroscopy) and SSRS (subtracted shifted Raman spectroscopy) methods were applied for fluorescence-background rejection in the Raman spectra of colored materials. These techniques are based on the assumption that the fluorescence contribution can be completelyeliminated by subtracting two Raman spectra acquired at two shifted laser excitation frequencies. Iacopo Osticioli, Angela Zoppi and Emilio Mario Castellucci JOURNAL OF RAMAN SPECTROSCOPY J. Raman Spectrosc. 2006; 37:
32 Fluorescence and Raman spectra on painting materials: reconstruction of spectra with mathematical methods For the SERDS method a micro-raman experimental apparatus coupled with a tunable diode laser (central emission at 684 nm) was set up. SSRS measurements were made on a commercial micro-raman instrument; in this case the shifted spectrum was obtained by moving the spectrometer grating. Raman spectra were then reconstructed by applying the difference deconvolution method that automatically converts the difference signals in Raman peaks through a deconvolution operation. Iacopo Osticioli, Angela Zoppi and Emilio Mario Castellucci JOURNAL OF RAMAN SPECTROSCOPY J. Raman Spectrosc. 2006; 37:
33 Fluorescence and Raman spectra on painting materials: reconstruction of spectra with mathematical methods SERDS The SERDS technique allows fluorescence rejection by subtracting two Raman spectra acquired at two slightly shifted excitation frequencies using a tunable laser. The applied shift should be small enough to consider fluorescence background almost constant, and large enough to make theraman signals significantly shifted with respect to the laser excitation frequency. SSRS The SSRS technique has been suggested to overcome the problems regarding the use of a tunable excitation source in SERDS. The theoretical laser shift is provided by moving the diffraction grating position. Iacopo Osticioli, Angela Zoppi and Emilio Mario Castellucci JOURNAL OF RAMAN SPECTROSCOPY J. Raman Spectrosc. 2006; 37:
34 Fluorescence and Raman spectra on painting materials: reconstruction of spectra with mathematical methods SERDS 6,6-Dibromoindigotine (DBI) Iacopo Osticioli, Angela Zoppi and Emilio Mario Castellucci JOURNAL OF RAMAN SPECTROSCOPY J. Raman Spectrosc. 2006; 37:
35 Fluorescence and Raman spectra on painting materials: reconstruction of spectra with mathematical methods SERDS 6,6-Dibromoindigotine (DBI) Iacopo Osticioli, Angela Zoppi and Emilio Mario Castellucci JOURNAL OF RAMAN SPECTROSCOPY J. Raman Spectrosc. 2006; 37:
36 Fluorescence and Raman spectra on painting materials: reconstruction of spectra with mathematical methods SSRS Real sample from Mattia Preti The dinner of Emmaus Iacopo Osticioli, Angela Zoppi and Emilio Mario Castellucci JOURNAL OF RAMAN SPECTROSCOPY J. Raman Spectrosc. 2006; 37:
37 Fluorescence and Raman spectra on painting materials: reconstruction of spectra with mathematical methods SSRS Real sample from Mattia Preti The dinner of Emmaus Iacopo Osticioli, Angela Zoppi and Emilio Mario Castellucci JOURNAL OF RAMAN SPECTROSCOPY J. Raman Spectrosc. 2006; 37:
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