ACTICLOT dpt REF 824. C i. Test del tempo di protrombina diluito per la determinazione di Lupus Anticoagulants (LA) (codice CPT n.

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1 M Sekisui Diagnostics, LLC 500 West Avenue, Stamford, CT Tel. (203) Fax (203) FINALITÀ D'USO ACTICLOT dpt è un test previsto per la determinazione qualitativa di anticoagulanti lupici (LA) in campioni di plasma umano. Il test può essere eseguito con coagulometri semi- o completamente automatici. Il test è per uso diagnostico in vitro e non è previsto per uso interno negli esseri umani o negli animali. ACTICLOT dpt REF 824 Test del tempo di protrombina diluito per la determinazione di Lupus Anticoagulants (LA) C i (codice CPT n ) Sekisui Diagnostics GmbH EC REP Kaplaneigasse 35, D Pfungstadt, Germany Tel / Fax / Cl8C SPIEGAZIONE DEL TEST Gli anticoagulanti lupici (LA) sono autoanticorpi fosfolipidi-dipendenti associati a patologie del sistema autoimmunitario come la sindrome da anticorpi antifosfolipidi (APS). 1,2 L APS primaria è una condizione patologica caratterizzata da fenomeni trombotici inspiegabili, aborti ricorrenti, trombocitopenia e/o alterazioni neurologiche. L APS secondaria si verifica in presenza di LA associati a malattie autoimmuni, quali il lupus sistemico eritematoso (LES), come nei casi descritti inizialmente da Conley e Hartmann 3. Gli anticoagulanti lupici sono anticorpi contro complessi eterogenei di fosfolipidi anionici (per esempio cardiolipina, fosfatidilinositolo, fosfatidiletanolamina e fosfatidilserina) 4 e proteine che legano i fosfolipidi 5 nel plasma. I principali componenti proteici degli autoantigeni LA comprendono la β2-glicoproteina I (β2gpi), la protrombina e l annessina V. Gli anticorpi antifosfolipidi sono caratterizzati dalla capacità di prolungare i tempi di coagulazione dei test in vitro che si basano sulla coagulazione, come l aptt lupus-sensibile, il tempo di coagulazione al caolino (KCT), il test al veleno di vipera di Russell (drvvt) e il tempo di protrombina diluito (dpt). 6-8 Data l eterogenicità degli autoanticorpi patologici fosfolipidi-dipendenti, è ampiamente riconosciuto che non esiste alcun singolo test della coagulazione che identifichi tutti gli anticorpi LA. Nel 1995, il sottocomitato scientifico sugli anticorpi antifosfolipidi della società internazionale di trombosi ed emostasi (ISTH) ha raccomandato che ogni plasma in cui si sospetti la presenza di LA debba essere testato con almeno due test diagnostici per gli LA e con uno studio di mixing con plasma da pool normali per stabilire la presenza di un autoanticorpo o la carenza di un fattore. 9 Inoltre, il sottocomitato scientifico dell ISTH ha stabilito che la diagnosi di LA richiede la dimostrazione della natura fosfolipide-dipendente degli autoanticorpi. Ciò è possibile eseguendo un test di coagulazione di conferma in presenza di elevate quantità di fosfolipidi. La presenza di LA è confermata da una riduzione significativa del tempo di coagulazione plasmatico in presenza di un elevata concentrazione di fosfolipidi rispetto alla ridotta concentrazione di fosfolipidi presente nel test di screening per LA. Studi clinici dimostrano che il tempo di protrombina diluito è un test di coagulazione efficace per gli LA e può identificare gli LA che non vengono rilevati da altri test, quali l'aptt lupus-sensibile e il drvvt In alcuni campioni di pazienti l aggiunta del test del tempo di protrombina diluito a un pannello di test per gli LA ha aumentato la sensibilità degli esami diagnostici per gli LA. 8,13 ACTICLOT dpt è un test del tempo di protrombina diluito completamente integrato per lo screening e la conferma della presenza di autoanticorpi LA fosfolipide-dipendenti. Questo protocollo di screening utilizza un reagente attivatore che contiene una formulazione unica a base di fattore tissutale ricombinante rilipidato e calcio. L utilizzo del fattore tissutale ricombinante nella formulazione del test dpt aumenta le prestazioni del test stesso. 12 Nel protocollo di conferma, viene utilizzata una formulazione unica di un reagente fosfolipidico per dimostrare la natura fosfolipide-dipendente degli LA individuati nei campioni risultati positivi alla procedura di screening. PRINCIPIO DEL METODO ACTICLOT dpt è un test di coagulazione che identifica la presenza di LA nel plasma. La coagulazione si innesca per attivazione del fattore tissutale della via coagulativa (estrinseca) che interagisce con il fattore tissutale in presenza di calcio ioni. Il fattore tissutale si lega al fattore VIIa inducendo l'attivazione dei fattori IX e X. Il fattore Xa trasforma la protrombina in trombina che innesca la formazione del coagulo per clivaggio del fibrinogeno in fibrina. L'attivazione della via del fattore tissutale permette di evitare la via di contatto (intrinseca) ed esclude qualsiasi interferenza dovuta a carenza del fattore XII. Nel protocollo di screening, il plasma del paziente viene miscelato con ACTICLOT LA Buffer e ACTICLOT dpt Activator. Il tempo di coagulazione è determinato in base a metodi semi- o completamente automatizzati. Il risultato positivo è indicato da un tempo di coagulazione prolungato rispetto al range normale stabilito. Nel protocollo di conferma, il plasma del paziente viene miscelato con ACTICLOT LA Phospholipids e ACTICLOT dpt Activator. Il risultato positivo è indicato da una riduzione significativa del tempo di coagulazione rispetto al tempo di coagulazione del protocollo di screening. 1

2 L'identificazione della presenza di LA nei campioni di plasma è subordinata all'esecuzione di entrambi i protocolli di screening e di conferma e all'ottenimento di un risultato positivo con entrambi i test (cfr. Algoritmo decisionale per la diagnosi di LA a pagina 10). I protocolli di screening e di conferma possono essere eseguiti in simultanea, permettendo di ottenere il più rapidamente possibile un risultato analitico per ciascun campione di plasma. In alternativa, i campioni di plasma possono essere dapprima sottoposti a screening per determinare l'eventuale presenza di LA e poi alla ripetizione del test per confermare la fosfolipide-dipendenza degli autoanticorpi rilevati. REAGENTI R1 R2 R3 LA Buffer : 3 flaconi, 40 test per flacone, contiene una formulazione unica di tampone, sali e ingredienti inerti. LA Phospholipids : 3 flaconi, 40 test per flacone, contiene una miscela brevettata di fosfolipidi, conservanti e additivi inerti. dpt Activator : 6 flaconi, 40 test per flacone, contiene una miscela brevettata di fattore tissutale umano ricombinante, calcio, fosfolipidi, conservanti e additivi inerti. AVVERTENZE E PRECAUZIONI D'IMPIEGO I reagenti contengono piccole quantità di sodio azoturo che, a contatto con le tubazioni di scarico in rame e piombo, può dare luogo alla formazione di sostanze esplosive. Dopo aver provveduto allo smaltimento del sodio azoturo, sciacquare con abbondante acqua. Esclusivamente per uso diagnostico in vitro. Non per uso interno negli esseri umani o negli animali. Non utilizzare i componenti del kit oltre la data di scadenza stampata. Non miscelare reagenti appartenenti a lotti di kit differenti. Evitare la contaminazione microbica dei reagenti. Non fumare, mangiare o bere nei luoghi in cui vengono manipolati i campioni o i reagenti del kit. Non pipettare i reagenti con la bocca. Indossare camice da laboratorio e guanti monouso per tutta la durata del test e, al termine, lavarsi accuratamente le mani. LA Buffer - - H412, P273 LA Phospholipids dpt Activator Dichiarazioni Pericoli: Prudenza: - - H412, P273 Pericolo H315 Provoca irritazione cutanea. H335 Può irritare le vie respiratorie. H350 Può provocare il cancro. CONT CdCl2 H315, H319, H335, H340, H350, H360, H373, P202, P260, P264, P280, P305+P351+P338, P332+P313, P308+P313 H319 Provoca grave irritazione oculare. H340 Può provocare alterazioni genetiche. H360 Può nuocere alla fertilità o al feto. H373 Può provocare danni agli organi in caso di esposizione prolungata o ripetuta H412 Nocivo per gli organismi acquatici con effetti di lunga durata. P202 Non manipolare prima di avere letto e compreso tutte le avvertenze. P260 Non respirare la polvere/i fumi/i gas/la nebbia/i vapori/gli aerosol. P264 Lavare accuratamente dopo l uso. P273 Non disperdere nell ambiente. P280 Indossare guanti/indumenti protettivi/proteggere gli occhi/il viso. P305+P351+P338 In caso di contatto con gli occhi: sciacquare accuratamente per parecchi minuti. Togliere le eventuali lenti a contatto se è agevole farlo. Continuare a sciacquare. P332 + P313 In caso di irritazione della pelle: Consultare un medico. P308 + P313 IN CASO di esposizione o di possibile esposizione: Consultare un medico. 2 PREPARAZIONE E CONSERVAZIONE DEI REAGENTI Tutti i reagenti vengono forniti liofilizzati. Se conservati correttamente ad una temperatura compresa tra 2 e 8 C, i reagenti sigillati si mantengono stabili fino alla data di scadenza stampa sull'etichetta dei rispettivi flaconi. Ricostituire ciascun reagente seguendo le istruzioni riportate di seguito. 1. LA Buffer (R1): Ricostituire un flacone con 3,0 ml di acqua distillata o deionizzata filtrata. Miscelare accuratamente i reagenti e lasciarli riposare a temperatura ambiente per almeno 15 minuti per garantire una completa dissoluzione. 2. LA Phospholipids (R2): Ricostituire un flacone con 2,0 ml di acqua distillata o deionizzata filtrata. Miscelare accuratamente i reagenti e lasciarli riposare a temperatura ambiente per almeno 15 minuti per garantire una completa dissoluzione. 3. dpt Activator (R3): Ricostituire un flacone con 2,0 ml di acqua distillata o deionizzata filtrata. Miscelare accuratamente i reagenti e lasciarli riposare a temperatura ambiente per almeno 15 minuti per garantire una completa dissoluzione. NON AGITARE AL VORTEX! MANTENERE A TEMPERATURA AMBIENTE! NON REFRIGERARE! NON CONGELARE! La stabilità dei reagenti ricostituiti è riportata di seguito: R1 R2 R3 H 10 giorni 10 giorni 8 ore l 2-8 C C 2-8 C C C I reagenti ricostituiti R1 e R2 possono essere recuperati dallo strumento entro 10 giorni. Il reagente ricostituito R3 può essere recuperato dallo strumento entro 8 ore. (Per i requisiti di temperatura validi per ciascun reagente, fare riferimento alla tabella sopra riportata.) PRELIEVO E PREPARAZIONE DEI CAMPIONI Per questo dosaggio si deve utilizzare plasma povero di piastrine raccolto in provette con citrato. Consultare "Collection, Transport and Processing of Blood Specimens for Testing Plasma-based Coagulation Assays and Molecular Hemostasis Assays; Approved Guidelines-Fifth Edition", CLSI Document H21-A5, 2008". 14 Il plasma va prelevato nel modo seguente: 1. Utilizzando una siringa o provette sotto vuoto siliconate, prelevare 9 parti di sangue in 1 parte di soluzione anticoagulante di citrato trisodico (diidrato) al 3,2% (0,109 M). 2. Centrifugare il campione di plasma ad una velocità minima di x g per 10 minuti per ottenere plasma povero di piastrine. Il plasma deve contenere meno di 10 4 piastrine/µl. È possibile eliminare le piastrine anche facendo passare il plasma attraverso un filtro da 0,22 micron. 3. Il plasma deve essere conservato ad una temperatura compresa 2 e 8 C ed analizzato entro 4 ore. In alternativa, il plasma può essere conservato a 70 C fino a 6 mesi. H 4 ore 6 mesi l 2-8 C -70 C 4. Scongelare rapidamente il plasma congelato a 37 C. Il plasma scongelato deve essere conservato a 2-8 C ed analizzato entro 4 ore. 3

3 Note: 1. Se l'ematocrito del campione di sangue originale è superiore al 55%, il risultato del test ACTICLOT dpt può essere inesatto e potrebbe essere opportuna una correzione del rapporto sangue-anticoagulante. 2. Non analizzare campioni visibilmente itterici o lipemici con strumenti foto-ottici in quanto i tempi di coagulazione ottenuti con tali strumenti potrebbero essere errati. Si consiglia di utilizzare un metodo analitico alternativo, manuale o semi-automatico. 3. Non eseguire il test ACTICLOT dpt con campioni emolizzati. PROCEDURA Materiali in dotazione si veda Reagenti Materiali necessari ma non in dotazione Plasma di controllo normale LAtrol (Sekisui Diagnostics REF 816N) Plasma di controllo anormale LAtrol (Sekisui Diagnostics REF 816A) Plasma da pool normali (PNP) Pipette monocanali per la dispensazione di volumi rispettivamente da µl, µl e µl Acqua distillata o deionizzata filtrata (0,22 µm) Coagulometro completamente o semi-automatico Protocollo di screening ACTICLOT dpt Procedura semi-automatizzata per l'st4 1. Trasferire un volume sufficiente di ACTICLOT dpt Activator e ACTICLOT LA Buffer nei pozzetti dei reagenti a 37 C di un ST4. negativo LA) in una cuvetta per coagulazione. Incubare per 2 minuti a 37 C. 3. Aggiungere 50 µl di ACTICLOT LA Buffer preriscaldato nella cuvetta contenente il plasma da analizzare. 4. Aggiungere 50 µl di ACTICLOT dpt Activator preriscaldato nella cuvetta contenente il plasma da analizzare. Avviare subito il cronometro e registrare il tempo di coagulazione. Procedura automatica Il test di screening ACTICLOT dpt può essere eseguito sulla maggior parte dei coagulometri automatici. Le applicazioni per analizzatori automatici speciali sono disponibili su richiesta. 1. Trasferire ACTICLOT LA Buffer e ACTICLOT dpt Activator nei pozzetti dei reagenti del coagulometro automatico. negativo LA) in una cuvetta per coagulazione. 3. Aggiungere 50 µl di ACTICLOT LA Buffer nella cuvetta contenente il plasma da analizzare. Incubare per 2 minuti a 37 C. 4. Aggiungere 50 µl di ACTICLOT dpt Activator preriscaldato a 37 C nella cuvetta contenente il plasma da analizzare. Annotare il tempo di coagulazione. Protocollo di conferma ACTICLOT dpt Procedura semi-automatizzata per l'st4 1. Trasferire un volume sufficiente di ACTICLOT dpt Activator e ACTICLOT LA Phospholipids nei pozzetti dei reagenti a 37 C di un ST4. negativo LA) in una cuvetta per coagulazione. Incubare per 2 minuti a 37 C. 3. Aggiungere 50 µl di ACTICLOT LA Phospholipids preriscaldati nella cuvetta contenente il plasma da analizzare Aggiungere 50 µl di ACTICLOT dpt Activator preriscaldato nella cuvetta contenente il plasma da analizzare. Avviare subito il cronometro e registrare il tempo di coagulazione. Procedura automatica Il test di conferma ACTICLOT dpt può essere eseguito sulla maggior parte dei coagulometri automatici. Le applicazioni per analizzatori automatici speciali sono disponibili su richiesta. 1. Trasferire ACTICLOT LA Phospholipids e ACTICLOT dpt Activator nei pozzetti dei reagenti del coagulometro automatico. negativo LA) in una cuvetta per coagulazione. 3. Aggiungere 50 µl di ACTICLOT LA Phospholipids nella cuvetta contenente il plasma da analizzare. Incubare per 2 minuti a 37 C. 4. Aggiungere 50 µl di ACTICLOT dpt Activator preriscaldato a 37 C nella cuvetta contenente il plasma da analizzare. Annotare il tempo di coagulazione. RANGE DI RIFERIMENTO NORMALI Per garantire il funzionamento corretto del test ACTICLOT dpt, è necessario che ciascun laboratorio stabilisca i propri range di riferimento normali per i test di screening e di conferma. Per stabilire il range di riferimento normale (si veda la sezione VALORI PREVISTI) vanno analizzati un minimo di 20 donatori di sangue sani, sia uomini che donne in età adulta. Nello stabilire i range di riferimento normali, occorre prestare attenzione ad effettuare il prelievo e la preparazione dei campioni di plasma normali allo stesso modo dei campioni di plasma da analizzare. Se vengono analizzati esclusivamente campioni congelati, anche i range di riferimento normali vanno stabiliti utilizzando campioni normali congelati. Per stabilire i range di riferimento normali o per i test di routine non si raccomanda di analizzare popolazioni di plasma miste, costituite sia da campioni freschi che congelati. È necessario stabilire nuovamente il range di riferimento normale ogni volta che viene utilizzato un nuovo lotto di reagenti, un nuovo coagulometro o almeno una volta all'anno. I dati del range di riferimento normale vanno rilevati nell'arco di alcuni giorni, in modo da tenere conto della variabilità inter-giornaliera. Determinazione del tempo di screening medio e del range di riferimento normale per il test di screening dpt Analizzare i 20 campioni di plasma normale con il test di screening e determinarne il tempo di screening medio (in secondi). Il tempo di screening medio + 2 DS rappresenta il limite superiore del range di riferimento normale e viene utilizzato come valore limite (cut-off) per stabilire se un campione del paziente è positivo per LA nel test di screening. Determinazione del tempo di conferma medio per il test di conferma Analizzare i 20 campioni di plasma normale con il test di conferma e determinarne il tempo di conferma medio. Determinare il tempo di conferma medio (in secondi) per gli stessi 20 campioni di plasma normale sottoposti al test di screening. NOTA: per stabilire la presenza di LA in un campione di plasma, quest'ultimo deve essere sottoposto al test di screening e a quello di conferma. Il tempo di screening e di conferma medio dei campioni di plasma normale viene utilizzato per i calcoli alla base della diagnosi di LA nei campioni dei pazienti. Di seguito vengono descritti due metodi di calcolo per i campioni dei pazienti: tempo di screening/tempo di conferma (S/C) e il rapporto normalizzato. Sono stati descritti metodi alternativi per il calcolo dei risultati dei test LA. 15 Determinazione del range di riferimento normale in base al metodo del rapporto S/C Il rapporto S/C viene calcolato per ciascuno dei venti campioni di plasma normale dividendo il tempo di screening per il tempo di conferma: rapporto S/C = tempo di screening dpt (sec.) tempo di conferma dpt (sec.) 5

4 Determinare il rapporto medio S/C (± 2 D.S.) per i venti campioni di plasma normale. Il rapporto S/C normale medio + 2 DS viene utilizzato per stabilire il limite superiore del range di riferimento normale per diagnosticare la presenza di LA nei campioni in esame. Determinazione del range di riferimento normale in base al metodo del rapporto normalizzato Dividere il tempo di screening di ciascun campione di plasma normale per il tempo di screening medio del range di riferimento normale (si veda sopra). Dividere quindi il tempo di conferma di ciascun campione di plasma normale per il tempo di conferma medio del range di riferimento normale (si veda sopra). Il rapporto normalizzato viene determinato dividendo il rapporto di screening normalizzato per il rapporto di conferma normalizzato: rapporto normalizzato = tempo di screening dpt plasma normale (sec.) tempo di screening dpt normale medio (sec.) tempo di conferma dpt plasma normale (sec.) tempo di conferma dpt normale medio (sec.) Determinare il rapporto normalizzato medio (± 2 DS) dei venti campioni normali. Il rapporto normalizzato medio + 2 DS viene utilizzato per stabilire il limite superiore del range di riferimento normale per diagnosticare la presenza di LA nei campioni in esame. INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI Un algoritmo decisionale per l'analisi dei campioni di plasma dei pazienti è riportato alla fine del presente foglietto illustrativo per facilitare l'interpretazione dei risultati. A. I campioni di plasma dei pazienti vengono sottoposti al test di screening. Determinare se il tempo di coagulazione del campione di plasma è superiore o inferiore al limite superiore del range di riferimento normale stabilito. 1. Se il tempo di coagulazione (sec.) del campione di plasma sottoposto a test di screening rientra nel range di riferimento normale stabilito (media + 2 DS), il risultato del test è negativo per LA. 2. Se il tempo di coagulazione (sec.) del campione di plasma sottoposto a test di screening è superiore al limite superiore del range di riferimento normale stabilito (media + 2 DS), si sospetta che il campione sia positivo per LA. Un plasma con un risultato positivo al test di screening ACTICLOT dpt deve essere sottoposto al test di conferma ACTICLOT dpt per identificare la presenza di LA nel campione di plasma. Un risultato positivo per LA al test di screening ACTICLOT dpt può essere confermato soltanto con il test di conferma ACTICLOT dpt. B. Ciascun campione di plasma risultato positivo al test di screening viene sottoposto al test di conferma. Determinare il rapporto S/C o il rapporto normalizzato del plasma in esame. 1. Se il rapporto S/C o il rapporto normalizzato del campione di plasma in esame è superiore al limite superiore stabilito per il range di riferimento normale (media + 2 DS), il campione di plasma è confermato positivo per LA. 2. Se il rapporto S/C o il rapporto normalizzato del campione di plasma in esame rientra nel range di riferimento normale (media ± 2 DS), il campione di plasma non è confermato positivo per LA. Questo campione deve essere fatto oggetto di studi di mixing. Studi di mixing Se il campione di plasma presenta un tempo di screening ACTICLOT dpt prolungato e il rapporto S/CO o il rapporto normalizzato rientra invece nel range di riferimento normale, si può sospettare la presenza di anormalità biologiche, quali ad esempio la carenza di un fattore della coagulazione del sangue (per es. fattore II, V o X), un inibitore del fattore (per es. l'inibitore del fattore VIII), o che il paziente sia in trattamento con anticoagulanti orali (ad es. Coumadin ). In tal caso si raccomanda di eseguire uno studio di mixing. Uno studio di mixing si effettua aggiungendo pari volumi di plasma in esame e plasma da pool normali. I test ACTICLOT dpt di screening e di conferma devono essere eseguiti con il plasma miscelato in rapporto 1: Se il tempo di screening dpt della miscela 1:1 è superiore al range di riferimento normale stabilito dal laboratorio (media + 2 DS), si sospetta che il campione di plasma sia positivo per LA. Se il tempo di screening dpt della miscela 1:1 rientra nel range normale (media ± 2 DS), si sospetta la presenza di carenza di un fattore del sangue. Se lo si desidera, si possono eseguire test del fattore appropriati (si veda Algoritmo decisionale). 2. Se il rapporto S/C o il rapporto normalizzato della miscela 1:1 è superiore al range di riferimento normale stabilito dal laboratorio (media + 2 DS), il campione di plasma è confermato positivo per LA. Se il rapporto S/C o il rapporto normalizzato della miscela rientra nel range di riferimento normale stabilito dal laboratorio (rapporto medio ± 2 DS), si sospettano altre anormalità (per es. Coumadin, inibitore del fattore). VALORI PREVISTI Nella Tabella 1 sono riportati i range di riferimento normali tipici per i test ACTICLOT dpt di screening e di conferma, i tempi di coagulazione e il rapporto S/C, ottenuti utilizzando coagulometri in commercio. Questi risultati sono soltanto indicativi. I campioni di plasma congelati prelevati da singoli donatori sono stati acquistati da fornitori commerciali o prelevati e preparati dal personale di laboratorio in cui viene eseguito il test conformemente al documento H21-A4 dell'nccls. 14 I donatori comprendevano sia uomini che donne, di età adulta e con valori PT e aptt normali. Non erano disponibili altri dati demografici. TABELLA 1: Range di riferimento normali per il test ACTICLOT dpt con coagulometri in commercio a Coagulometro Tempo di screening, sec. (media ± 2 DS) Tempo di conferma, sec. (media ± 2 DS) Rapporto S/C (media ± 2 DS) a dati dell'sekisui Diagnostics 16 CONTROLLO DI QUALITÀ ACL 300+ (n=25) BCT (n=32) CA7000 (n=20) MLA 900C (n=93) ST4 (n=25) STA Compact (n=25) 34,4 + 4,5 51,2 + 7,8 38,8 + 8,8 26,7 + 4,8 38,4 + 4,2 36,6 + 5,9 29,2 + 4,8 50,5 + 11,0 35,8 + 4,0 26,2 + 5,2 34,9 + 8,5 35,7 + 3,1 1,18 + 0,12 1,02 + 0,12 1,08 + 0,26 1,02 + 0,16 1,11 + 0,19 1,03 + 0,09 Un plasma di controllo LA normale e uno di controllo LA anormale devono essere analizzati con ciascun gruppo di una serie analitica, nel caso di cambio del personale o all'inizio di ogni turno di lavoro, o in base alle linee guida previste dal rispettivo laboratorio. I controlli devono essere poveri di piastrine, con meno di 10 4 piastrine/µl. I plasmi di controllo LA normale ed anormale sono disponibili presso la Sekisui Diagnostics (rispettivamente REF 816N e REF 816A). I valori per entrambi i plasmi di controllo LA normale e anormale devono rientrare nei range dei controlli stabiliti dal laboratorio. Se i valori dei controlli non rientrano nei limiti dei controlli precedentemente stabiliti dal rispettivo laboratorio ed è stato appurato che la strumentazione funziona correttamente, i risultati devono essere eliminati e i campioni sottoposti alla ripetizione del test con reagenti freschi. Prima di analizzare i campioni dei pazienti, è necessario aver ottenuto valori corretti per i controlli normale e anormale. TRACCIABILITÀ DEI CONTROLLI Informazioni relative alla tracciabilità dei controlli possono essere richieste all'sekisui Diagnostics. 16 7

5 LIMITI DEL METODO Il tempo di screening del test ACTICLOT dpt può risultare prolungato nei pazienti con carenze di fattore congenite o acquisite. Le carenze di fattore congenite possono essere determinate sulla base di studi di mixing, descritti in precedenza. I campioni di plasma contenenti inibitori del fattore (carenze acquisite) possono essere identificati o meno negli studi di mixing poiché l'inibitore può non essere completamente neutralizzato dal PNP utilizzato in tali studi. L'ACTICLOT dpt Activator contiene degli agenti che neutralizzano l'eparina non frazionata fino a 1,0 U/ml compreso. I campioni di plasma che contengono livelli di eparina non frazionata superiori a 1,0 U/ml possono dare risultati non corretti e non devono essere pertanto utilizzati con il presente test. I campioni di plasma prelevati da pazienti trattati con Coumadin e altri anticoagulanti orali possono presentare tempi di coagulazione prolungati con i test ACTICLOT dpt di screening e di conferma. Negli studi di mixing, questi tempi di coagulazione possono essere abbreviati fino a rientrare nel range normale, a condizione che LA non sia presente. Nessun test LA è in grado da solo di identificare tutti i campioni LA-positivi. Il sottocomitato scientifico dell'isth raccomanda di sottoporre i campioni sospettati di contenere LA a due o più test di screening per la determinazione di LA e ad almeno un test di conferma contenente un'elevata concentrazione di fosfolipidi. 9 CARATTERISTICHE DI PRESTAZIONE Precisione Gli studi di precisione per il test ACTICLOT dpt sono stati condotti dall'sekisui Diagnostics e da due laboratori indipendenti su diversi coagulometri: l'acl 300R della Instrumentation Laboratory, il BCT della Dade Behring, il CA-7000 della Sysmex, il coagulometro MLA 900C della Instrumentation Laboratory e STart 4 e STA Compact della Diagnostica Stago. Gli studi hanno incluso test multipli eseguiti per diversi giorni utilizzando plasmi di controllo disponibili in commercio. I risultati sono riportati in sintesi nella Tabella 2. TABELLA 2: Dati di precisione per il test ACTICLOT dpt con plasmi di controllo normale e anormale (Lupus-positivi) Coagulometro ACL 300R Controllo* Tempo medio del test di screening dpt (sec.) intradosaggio interdosaggi Tempo medio del test di conferma dpt (sec.) intradosaggio interdosaggi Normale 32,8 2,5 5,1 30,2 3,8 5,3 Anormale 63,8 1,9 7,1 36,9 3,2 3,8 Specificità e sensibilità Nello studio clinico I, la specificità e sensibilità del test ACTICLOT dpt sono state determinate utilizzando 20 campioni di plasma normali e 23 campioni di plasma noti essere debolmente positivi per LA. I risultati sono indicati nella Tabella 3. Si riportano anche i risultati del test ACTICLOT dpt in combinazione con quelli ottenuti dai test LA disponibili in commercio DVVtest/DVVconfirm (dell'sekisui Diagnostics). TABELLA 3: Studio clinico I specificità e sensibilità a N. di plasmi normali risultati negativi al test N. di plasmi normali sottoposti a test Protocollo di screening ACTICLOT dpt Protocollo di conferma ACTICLOT dpt ACTICLOT dpt (S/C) + DVV (T/C) 20/20 20/20 NR b Specificità 100% 100% NR b N. di plasmi LA noti risultati positivi al test N. di plasmi LA noti sottoposti a test 21/23 18/23 22/23 Sensibilità 91% 78% 95,6% a eseguito sul coagulometro CA-7000 b Non Riportato Nello studio clinico II, ventinove campioni di plasma noti essere LA-positivi sono stati analizzati con il test ACTICLOT dpt, DVVtest/DVVconfirm e un reagente aptt LA-sensibile disponibile in commercio. Se utilizzata in un pannello con questi test, la sensibilità di ACTICLOT dpt è riportata nella TABELLA 4. La sensibilità è aumentata combinando i risultati ottenuti con ogni singolo test. TABELLA 4: Studio clinico II Sensibilità di un pannello del test LA di ACTICLOT dpt, DVVtest/DVVconfirm e aptt ACTICLOT dpt a ACTICLOT dpt a + DVV b ACTICLOT dpt a + DVV b + aptt b BCT Normale 47,5 0,5 3,2 51,6 1,7 4,5 Anormale 89,2 0,6 5,2 61,9 1,2 3,7 N. di plasmi LA noti risultati positivi al test N. di plasmi LA noti sottoposti a test 23/29 25/29 28/29 CA-7000 MLA 900C STart 4 STA Compact Normale 44,3 0,9 ND 37,9 2,0 ND Anormale 84,1 5,4 ND 48,6 3,3 ND Normale 27,9 2,5 3,7 27,2 2,8 4,1 Anormale 51,6 2,4 8,6 30,5 1,5 3,7 Normale 38,1 0,7 ND 37,3 3,8 ND Anormale 60,6 6,5 ND 44,0 6,7 ND Normale 40,2 0,8 3,4 39,7 0,9 4,3 Anormale 77,9 1,1 7,2 46,0 1,0 4,8 Sensibilità 78% 86% 97% a eseguito sul coagulometro ACL 300R b eseguito sul coagulometro Sysmex CA-1500 Confronto metodologico Sono stati condotti due studi di confronto tra i metodi con i test ACTICLOT dpt e DVVtest/DVVconfirm. In entrambi gli studi sono stati esaminati campioni di pazienti risultati precedentemente positivi per LA o con valori entro il range normale. Nel primo studio, condotto sul sistema STA Compact, i risultati di 49 su 54 campioni di pazienti analizzati (90,7%) erano concordanti. Nel secondo studio, condotto sul sistema BCT, i risultati di 82 su 93 campioni di pazienti analizzati (88,2%) erano concordanti. 16 * Sekisui Diagnostics REF 816N, 816A ND = Non Determinato 8 9

6 BIBLIOGRAFIA Algoritmo decisionale per la diagnosi di LA con il test ACTICLOT dpt 1. Harris, E. N. The Antiphospholipid Syndrome. Diagnosis, Management, and Pathogenesis. Clin Rev Allergy Immunol 1995, 13(1): Levine, J. S., Branch, D. W. and Rauch, J. The Antiphospholipid Syndrome. NEJM 2002, 346: Conley, C. L. and Hartmann, R. C. A Hemorrhagic Disorder Caused by a Circulating Anticoagulant in Patients with Disseminated Lupus Erythematosus. J Clin Invest 1952, 31: Thiagarajan, P., Shapiro, S. S. and DeMarco, L. Monoclonal Immunoglobulin M lambda Coagulation Inhibitor with Phospholipid Specificity: Mechanism of a Lupus Anticoagulant. J Clin Invest 1980, 66: Triplett, D. A. Antiphospholipid Antibodies. Arch Pathol Lab Med 2002, 126(11): Thiagarajan, P., Pengo, V. and Shapiro, S. S. The use of the Dilute Russell Viper Venom Time for the Diagnosis of Lupus Anticoagulants. Blood 1986, 68: Exner, T., Papadopoulos, G. and Koutts, J. Use of a Simplified Dilute Russell Viper Venom Time (drvvt) Confirms Heterogeneity among 'Lupus Anticoagulants.' Blood Coag Fibrinol 1990, 1: Johns, A. S., Chamley, L., Ockelford, P. A., Pattison, N. S., McKay, E. J., Corkill, M. and Hart, H. Comparison of tests for the lupus anticoagulant and antiphospholipid antibodies in systemic lupus erythematosus. Clinical and Experimental Rheumatology 1994, 12: Brandt, J. T., Triplett, D. A., Alving, B. and Scharrer, I. Criteria for the Diagnosis of Lupus Anticoagulants: An Update. Thromb Haemost 1995, 74(4): Liestøl, S., Jacobsen, E. M. and Wisloff, F. Dilute Prothrombin Time-based Lupus Ratio Test. Integrated LA Testing with Recombinant Tissue Thromboplastin. Thromb Res 2002, 105: Triplett, D. A., Brandt, J. T., Kaczor, D., and Schaeffer, J. Laboratory Diagnosis of Lupus Inhibitors: a Comparison of the Tissue Thromboplastin Inhibition Procedure with a New Platelet Neutralization Procedure. Am J Clin Path 1983, 79: Arnout, J., Vanrusselt, M., Huybrechts, E. and Vermylen, J. Optimization of the Dilute Prothrombin Time for the Detection of the Lupus Anticoagulant by Use of a Recombinant Tissue Thromboplastin. Br J Haematol 1994, 87: Mackie, I. J., Lawrie, A. S., Greenfield, R. S., Guinto, E. R. and Machin, S. J. A New Lupus Anticoagulant Test Based on Dilute Prothrombin Time. Thromb Res 2004, 114: CLSI. Collection, Transport and Processing of Blood Specimens for Testing Plasma-based Coagulation Assays and Molecular Hemostasis Assays; Approved Guidelines-Fifth Edition", CLSI Document H21-A5, Vol. 28, No. 5, Lawrie, A. A., Mackie, I. J., Purdy, G. and Machin, S. J. The Sensitivity and Specificity of Commercial Reagents for the Detection of Lupus Anticoagulants Show Marked Differences in Performance between Photo-optical and Mechanical Coagulometers. Thromb Haemost 1999, 81: Dati disponibili su file presso la Sekisui Diagnostics, Stamford, Connecticut ACL è un marchio commerciale di Instrumentation Laboratory, SpA. BCT è un marchio commerciale registrato di Dade Behring Inc. MLA è un marchio commerciale registrato di Instrumentation Laboratory, SpA. STACLOT e STA Compact sono marchi commerciali registrati di Diagnostica Stago, sas. Sysmex è un marchio commerciale registrato di Sysmex Corporation. LA NEGATIVO Analizzare Il Plasma Con Altri Test (drvvt, aptt, KCT, ecc.) o APA ELISAs LA NEGATIVO NO NO Plasma Di Un Paziente Con Sintomi APS Protocollo Di Screening dpt Test Del Tempo Di Coagulazione Prolungato? Protocollo Di Conferma dpt Il Test Di Conferma è Risultato Positivo? Preparare Il Campione Per Studi Di Mixing Con Il Campione Di Plasma Più PNP (1:1) Protocollo Di Screening dpt Test Del Tempo Di Coagulazione Prolungato? SÌ (1) Protocollo Di Conferma dpt NO (2) SÌ (1) SÌ LA POSITIVO Caratterizzare Anticorpi Antifosfolipidi Specifici (3) Analizzare Per Determinare L eventuale Presenza Di Carenze Di Fattori, Inibitori O Anticoagulanti Orali NO (2) Il Test Di Conferma È Risultato Positivo? SÌ LA POSITIVO 10 (1) Si sospetta la presenza di LA (2) Il prolungamento del tempo di coagulazione con il protocollo di screening non è stato corretto in modo significativo nel protocollo di conferma. (3) Test ELISA per anti-ß2gp1, anti-protrombina, anti-cardiolipina, anti-annessina V, etc. 11

7 Chiave dei simboli Consultare le istruzioni per l uso Consultare la SDS Dispositivo medico per diagnosi in vitro Prodotto da 2 C 8 C Conservare tra 2 C e 8 C Numero di lotto Data di scadenza Numero di catalogo Marchio CE Rappresentante sutorizzato per l Europa 12 13