Manuale del kit artus CMV QS-RGQ

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1 Dicembre 2010 Manuale del kit artus CMV QS-RGQ 24 Versione 1 Diagnostica quantitativa in vitro Da utilizzare con gli strumenti QIAsymphony SP/AS e Rotor-Gene Q IT QIAGEN GmbH, QIAGEN Strasse 1, D Hilden R IT Sample & Assay Technologies

2 Tecnologie per campioni e test QIAGEN QIAGEN è un fornitore leader nel settore delle tecnologie innovative per campioni e test che consentono di isolare e rilevare il contenuto di qualunque campione biologico. I nostri prodotti e servizi avanzati di alta qualità assicurano la riuscita dall inizio alla fine. QIAGEN definisce gli standard in: purificazione di DNA, RNA e proteine test di acido nucleico e proteine ricerca microrna e RNAi automazione delle tecnologie per campioni e test Il nostro obiettivo è farvi raggiungere risultati e innovazioni eccezionali. Per ulteriori informazioni, visitate il sito

3 Indice generale Contenuto del kit 5 Simboli 5 Conservazione 6 Uso previsto 6 Limiti sull utilizzo del prodotto 6 Assistenza tecnica 7 Informazioni sulla sicurezza 7 Controllo di qualità 8 Presentazione 9 Principio 9 Informazioni sull agente patogeno 9 Prestazioni caratteristiche 10 Flusso di lavoro 18 Equipaggiamento e reagenti in dotazione all utente 23 Note importanti 25 Precauzioni generali 25 Prelievo, conservazione e trasporto dei campioni 25 Preparazione degli strumenti QIAsymphony SP/AS 27 Preparazione dei campioni 30 Preparazione delle miscele di carrier RNA (CARRIER) tampone AVE (AVE) per campioni di plasma 30 Uso di un controllo interno 31 Set di controllo del test e set di parametri del test 32 Analisi con dosaggio multiplo 33 Rese degli acidi nucleici 33 Conservazione degli acidi nucleici 34 Impostazione della soglia per l'analisi PCR 34 Quantificazione 34 Protocolli Isolamento del DNA sul QIAsymphony SP 35 Setup del test sul QIAsymphony AS 44 Manuale del kit artus CMV QS-RGQ 12/2010 3

4 PCR e analisi dei dati sul Rotor-Gene Q 51 Guida alla ricerca guasti 63 Bibliografia 70 Informazioni per l ordine 71 4 Manuale del kit artus CMV QS-RGQ 12/2010

5 Contenuto del kit Kit artus CMV QS-RGQ (24) Numero del catalogo Numero di reazioni 24 Blu CMV RG Master 3 x 300 μl Giallo CMV Mg-Sol* 600 μl Rosso CMV QS 1 (1 x 10 4 copie/μl) 200 μl Rosso CMV QS 2 (1 x 10 3 copie/μl) 200 μl Rosso CMV QS 3 (1 x 10 2 copie/μl) 200 μl Rosso CMV QS 4 (1 x 10 1 copie/μl) 200 μl Verde CMV IC 1000 μl Bianco Acqua (PCR-grade) 1000 μl Manuale 1 * Soluzione di magnesio. Standard di quantificazione. Controllo interno. Simboli <N> Contenuto sufficiente per <N> test Utilizzare entro Negli apparecchi medicali per diagnosi in vitro Numero del catalogo Numero del lotto Numero del materiale Componente Manuale del kit artus CMV QS-RGQ 12/2010 5

6 Contiene Numero Limiti di temperatura Produttore legale Fare riferimento alle informazioni fornite nel manuale Nota importante Conservazione I componenti del kit artus CMV QS-RGQ devono essere conservati ad una temperatura di 20 C e possono essere utilizzati fino alla data di scadenza riportata sull etichetta. Evitare congelamenti e scongelamenti ripetuti (più di due volte), perché ciò potrebbe ridurre le prestazioni del test. Uso previsto Il kit artus CMV QS-RGQ è un test in vitro per l amplificazione degli acidi nucleici utilizzato per quantificare il DNA del citomegalovirus (CMV) nel plasma umano EDTA o nel sangue umano intero EDTA. Questo kit utilizza la reazione a catena della polimerasi (PCR) ed è configurato per gli strumenti QIAsymphony SP/AS e Rotor-Gene Q. Il kit artus CMV QS-RGQ è destinato ad essere usato in associazione con la presentazione clinica e con altri marker di laboratorio per la prognosi della malattia. Limiti sull utilizzo del prodotto L uso di tutti i reagenti è riservato esclusivamente alla diagnostica in vitro. L utilizzo è consentito soltanto a personale dotato delle necessarie conoscenze e competenze in merito alle procedure della diagnostica in vitro (EN375). Per ottenere risultati PCR ottimali è assolutamente necessario attenersi al protocollo. Rispettare le date di scadenza dei singoli componenti, riportate sulla confezione e sulle etichette. Non utilizzare reagenti scaduti. Sebbene accada raramente, eventuali mutazioni nelle regioni altamente conservate del genoma virale coperte dai primer e/o dalla sonda del kit 6 Manuale del kit artus CMV QS-RGQ 12/2010

7 possono essere causa di una sotto-quantificazione o perfino della mancata individuazione del virus. La validità e le prestazioni del kit vengono revisionate ad intervalli regolari. Assistenza tecnica Alla QIAGEN siamo orgogliosi della qualità e della disponibilità del nostro staff tecnico. Il nostro reparto di assistenza tecnica è composto da scienziati esperti che hanno alle spalle una lunga esperienza maturata a livello pratico e teorico nelle tecnologie per campioni e test e nell impiego dei prodotti QIAGEN. In caso voleste porgere delle domande o incontraste delle difficoltà con il kit artus CMV QS-RGQ o con i prodotti QIAGEN in generale, vi preghiamo di non esitare a contattarci. I clienti QIAGEN sono la fonte principale d informazione relativa all uso avanzato o specializzato dei nostri prodotti. Tali informazioni sono utili sia ai nostri scienziati che ai ricercatori della QIAGEN. Pertanto vi esortiamo a contattarci, in caso aveste dei suggerimenti da darci sulle prestazioni dei prodotti o su nuove applicazioni e tecniche varie. Per ricevere assistenza tecnica e ulteriori informazioni, consultate il nostro sito oppure contattate il servizio assistenza tecnica QIAGEN o il distributore locale (consultare il retro della copertina o il sito Informazioni sulla sicurezza Quando si opera con sostanze chimiche, indossare sempre un camice da laboratorio, guanti monouso e occhiali protettivi. Per ulteriori informazioni, consultare le appropriate schede di sicurezza (MSDS). Le schede MSDS, nel pratico e compatto formato PDF, sono disponibili online all indirizzo Qui è possibile trovare, visualizzare e stampare la scheda MSDS per ciascun kit QIAGEN e i relativi componenti. Per le informazioni antinfortunistiche riguardanti il kit QIAsymphony DSP Virus/Pathogen Midi, consultare il Manuale QIAsymphony DSP Virus/Pathogen. Per le informazioni antinfortunistiche riguardanti il kit QIAsymphony DNA Mini, consultare il Manuale QIAsymphony DNA. Per le informazioni antinfortunistiche riguardanti gli strumenti, fare riferimento al manuale dello strumento relativo. Smaltire i campioni e i residui dei test secondo le locali disposizioni in materia di sicurezza. Informazioni in caso di emergenza: 24 ore al giorno Le informazioni mediche in caso di emergenza sono disponibili 24 ore al giorno in inglese, francese e tedesco presso: Centro di informazioni antiveleni, Mainz, Germania. Manuale del kit artus CMV QS-RGQ 12/2010 7

8 Tel: Controllo di qualità In conformità con il sistema di gestione per la qualità di QIAGEN certificato ISO ogni lotto del kit artus CMV QS-RGQ è stato testato in base a specifiche prestabilite per garantire la costante qualità del prodotto. 8 Manuale del kit artus CMV QS-RGQ 12/2010

9 Presentazione Il kit artus CMV QS-RGQ è un sistema pronto all uso per la rilevazione del DNA di CMV tramite la reazione a catena della polimerasi (PCR) su strumenti Rotor-Gene Q con preparazione dei campioni e setup del test eseguiti con strumenti QIAsymphony SP/AS. La CMV RG Master contiene reagenti ed enzimi per l amplificazione specifica di una regione di 105 bp del genoma di CMV, nonché per la rilevazione immediata dell amplicone specifico nel canale di fluorescenza Cycling Green per Rotor-Gene Q. Il kit artus CMV QS-RGQ contiene anche un secondo sistema di amplificazione eterologa per la rilevazione di una possibile inibizione della PCR, che viene identificato come controllo interno (IC) nel canale di fluorescenza Cycling Yellow per Rotor-Gene Q. Esso inoltre non riduce il limite analitico di rilevabilità della PCR di CMV. Il kit contiene controlli positivi esterni (CMV QS 1 4) che consentono di determinare la carica dell agente patogeno. A tale proposito consultare il paragrafo Quantificazione, pag. 34. Principio Per la diagnosi tramite reazione a catena della polimerasi (PCR) vengono amplificate specifiche regioni del genoma dell agente patogeno. Per la realtime PCR la rilevazione richiede l impiego di sostanze fluorescenti, di solito legate a sonde oligonucleotidiche, che si legano in modo specifico al prodotto di amplificazione. La rilevazione dell intensità di fluorescenza durante la realtime PCR consente di identificare e quantificare i prodotti senza dover riaprire le provette dei campioni al termine della PCR. Informazioni sull agente patogeno Il citomegalovirus umano (CMV) è presente nel sangue, nei tessuti e in quasi tutte le secrezioni di soggetti infetti. La trasmissione può avvenire per via orale, sessuale, intrauterina o perinatale, tramite trasfusione di sangue o trapianto d organo. L infezione da CMV produce spesso uno stato asintomatico, accompagnato da una persistenza del virus nell organismo per tutta la vita. In caso di manifestazione dei sintomi, sia nei ragazzi che negli adulti, è evidente una somiglianza con la mononucleosi, con febbre, lieve epatite e malessere generale. Sono stati osservati decorsi gravi dell'infezione da CMV, soprattutto nei soggetti infettati per via intrauterina e nei pazienti immunodeficienti. Mackay, I.M. (2004) Real-time PCR in the microbiology laboratory. Clin. Microbiol. Infect. 10, 190. Manuale del kit artus CMV QS-RGQ 12/2010 9

10 Prestazioni caratteristiche Sensibilità analitica plasma Il limite di rilevazione analitica, tenendo conto della purificazione (limite di sensibilità), è stato determinato per il kit artus CMV QS-RGQ utilizzando campioni clinici CMV-positivi in combinazione con l estrazione sul QIAsymphony SP. Per il plasma, la sensibilità analitica del kit artus CMV QS-RGQ (tenendo conto della purificazione) è stata determinata utilizzando una serie di diluizioni del virus CMV da 1000 copie al valore nominale di 0,316 copie di CMV/ml, aggiunte ai campioni clinici di plasma. I campioni sono stati poi sottoposti ad estrazione del DNA con il kit QIAsymphony DSP Virus/Pathogen Midi in combinazione con il protocollo Cellfree1000 (volume di estrazione: 1 ml, volume di eluizione: 60 μl). Ciascuna delle 10 diluizioni è stata analizzata con il kit artus CMV QS-RGQ in 4 giorni diversi nell ambito di 4 sedute con 8 replicati ciascuna. I risultati sono stati determinati mediante un analisi probit. La Figura 1 illustra graficamente l analisi probit. Il limite di rilevazione analitica del kit artus CMV QS-RGQ (tenendo conto della purificazione) in combinazione con il Rotor-Gene Q è pari a 42,5 copie/ml (p = 0,05). Ciò significa che esiste una probabilità del 95% che vengano rilevati 42,5 copie/ml % Proporzioni Proportions ,63 ~ ,5 copies/ml copie/ml (95%) (29,4 70,2 ( copie/ml) copies/ml) log (dose) Figura 1. Analisi probit: plasma, CMV (Rotor-Gene Q). Sensibilità analitica, tenendo conto della purificazione, (plasma, utilizzando il kit QIAsymphony DSP Virus/Pathogen Midi) del kit artus CMV QS-RGQ sul Rotor-Gene Q. 10 Manuale del kit artus CMV QS-RGQ 12/2010

11 Specificità plasma La specificità del kit artus CMV QS-RGQ è garantita in primo luogo dalla selezione dei primer e delle sonde, nonché dalla selezione di condizioni di reazione stringenti. I primer e le sonde sono stati controllati per accertare eventuali omologie con tutte le sequenze pubblicate nelle banche genetiche mediante analisi comparativa delle sequenze. La rilevabilità di tutti i genotipi importanti è stata così assicurata. Inoltre, la specificità è stata convalidata con 100 diversi campioni di plasma CMV-negativi. Questi campioni non hanno generato segnali con i primer e le sonde di CMV inclusi nell CMV RG/TM Master. Una potenziale cross-reattività del kit artus CMV QS-RGQ è stata rilevata con il gruppo di controllo elencato nella Tabella 1 (sotto riportata). Nessuno dei patogeni testati è risultato reattivo. Non sono state riscontrate cross-reattività con infezioni miste. Tabella 1. Analisi della specificità del kit con patogeni potenzialmente cross-reattivi Gruppo di controllo Herpes virus umano tipo 1 (virus Herpes simplex tipo 1) Herpes virus umano tipo 2 (virus Herpes Simplex virus 2) Herpes virus umano tipo 3 (virus Varicella-Zoster) Herpes virus umano tipo 4 (virus di Epstein-Barr) CMV (Cycling Green) Controllo interno (Cycling Yellow) Herpes virus umano tipo 6A + Herpes virus umano tipo 6B + Herpes virus umano tipo 7 + Herpes virus umano 8 (herpes virus associato al sarcoma di Kaposi) + La tabella continua alla pagina seguente. Manuale del kit artus CMV QS-RGQ 12/

12 Tabella 1. Continua Controllo interno Gruppo di controllo CMV (Cycling Green) (Cycling Yellow) Virus dell epatite A + Virus dell epatite B + Virus dell epatite C + Virus dell immunodeficienza umana 1 Virus umano della leucemia a cellule T tipo 1 Virus umano della leucemia a cellule T tipo Virus del Nilo occidentale + Enterovirus + Parvovirus B19 + Range lineare plasma Il range lineare del kit artus CMV QS-RGQ (tenendo conto della purificazione) è stato determinato analizzando una serie di diluizioni del materiale CMV in un intervallo da 1,00 x 10 8 copie/ml a 3,16 x 10 1 copie/ml nel plasma. La purificazione è stata eseguita in replicati (n = 4 per concentrazioni 1,00 x 10 7 copie/ml; n = 8 per concentrazioni <1,00 x 10 7 copie/ml) utilizzando il kit QIAsymphony DSP Virus/Pathogen Midi in combinazione con il protocollo Cellfree1000 (volume di estrazione: 1 ml, volume di eluizione: 60 μl). Ogni campione è stato analizzato con il kit artus CMV QS-RGQ. Il range lineare del kit artus CMV QS-RGQ (tenendo conto della purificazione) è stato determinato per coprire le concentrazioni da 7,94 x 10 1 copie/ml a 1,00 x 10 8 copie/ml per il plasma (Figura 2, pag. 13). Robustezza plasma La verifica della robustezza consente la determinazione del tasso globale d errore del kit artus CMV QS-RGQ. Per verificare la robustezza, 100 campioni di plasma CMV-negativi sono stati arricchiti con 130 copie/ml di CMV (concentrazione pari all incirca tre volte il limite di sensibilità analitica). In seguito ad estrazione con il kit QIAsymphony DSP Virus/Pathogen Midi in 12 Manuale del kit artus CMV QS-RGQ 12/2010

13 combinazione con il protocollo Cellfree1000_DSP per il plasma (volume di estrazione: 1 ml, volume di eluizione: 60 μl), i campioni sono stati analizzati con il kit artus CMV QS-RGQ. Inoltre, la robustezza del controllo interno è stata valutata mediante purificazione e analisi dei 100 campioni di plasma arricchiti. Non sono state osservate inibizioni. La robustezza del kit artus CMV QS-RGQ è risultata 99%. 10 log 10 della concentrazione stimata (copie/ml) log 10 estimated concentration (copies/ml) y = x 1,0521x ,3653 R 2 = 0, log 10 della log 10 concentrazione nominal concentration nominale (copies/ml) (copie/ml) Figura 2. Range lineare del kit artus CMV QS-RGQ (plasma). Calcolo del range lineare. La linea retta è stata determinata mediante una regressione lineare del log 10 delle concentrazioni calcolate con il log 10 delle concentrazioni nominali. La figura mostra l equazione della linea di regressione. Sensibilità analitica sangue intero Il limite di rilevazione analitica, tenendo conto della purificazione (limite di sensibilità), è stato determinato per il kit artus CMV QS-RGQ utilizzando campioni clinici CMV-positivi in combinazione con l estrazione sul QIAsymphony SP. Per il sangue intero, la sensibilità analitica (tenendo conto della purificazione) del kit artus CMV QS-RGQ è stata determinata utilizzando una serie di diluizioni del virus CMV da 1000 copie al valore nominale di 3,16 CMV/ml, aggiunte ai campioni di sangue intero umano. I campioni sono stati poi sottoposti ad estrazione del DNA con il kit QIAsymphony DNA Mini in combinazione con il protocollo VirusBlood200 (volume di estrazione: 200 μl, volume di eluizione: 60 μl). Ciascuna delle 8 diluizioni è stata analizzata con il kit artus CMV QS-RGQ in 3 giorni diversi nell ambito di 6 sedute con 11 replicati ciascuna. I risultati sono stati determinati mediante un analisi probit. La Manuale del kit artus CMV QS-RGQ 12/

14 Figura 3 illustra graficamente l analisi probit. Il limite di rilevazione analitica del kit artus CMV QS-RGQ (tenendo conto della purificazione) in combinazione con il Rotor-Gene Q è pari a 164,55 copie/ml (p = 0,05). Ciò significa che esiste una probabilità del 95% che vengano rilevati 164,55 copie/ml % 0.8 Proporzioni Proportions , ~ 164, copie/ml copies/ml (95%) (82,01 636,34 ( copie/ml) copies/ml) log (dose) Figura 3. Analisi probit: sangue intero, CMV (Rotor-Gene Q). Sensibilità analitica, tenendo conto della purificazione, (sangue intero, utilizzando il kit QIAsymphony DNA Mini) del kit artus CMV QS-RGQ sul Rotor-Gene Q. Specificità sangue intero La specificità del kit artus CMV QS-RGQ è garantita in primo luogo dalla selezione dei primer e delle sonde, nonché dalla selezione di condizioni di reazione stringenti. I primer e le sonde sono stati controllati per accertare eventuali omologie con tutte le sequenze pubblicate nelle banche genetiche mediante analisi comparativa delle sequenze. La rilevabilità di tutti i genotipi importanti è stata così assicurata. Inoltre, la specificità è stata convalidata con 100 diversi campioni di sangue intero CMV-negativi. Questi campioni non hanno generato segnali con i primer e le sonde di CMV inclusi nell CMV RG/TM Master. Una potenziale cross-reattività del kit artus CMV QS-RGQ è stata rilevata con il gruppo di controllo elencato nella Tabella 1 (pag. 11). Nessuno dei patogeni testati è risultato reattivo. Non sono state riscontrate cross-reattività con infezioni miste. 14 Manuale del kit artus CMV QS-RGQ 12/2010

15 Range lineare sangue intero Il range lineare del kit artus CMV QS-RGQ (tenendo conto della purificazione) è stato determinato analizzando una serie di diluizioni del virus CMV da 5,00 x 10 7 a 1,00 x 10 2 nel sangue intero. La purificazione è stata eseguita in replicati (n = 4 per concentrazioni 1,00 x 10 7 copie/ml; n = 8 per concentrazioni <1,00 x 10 7 copie/ml) utilizzando il kit QIAsymphony DNA Mini in combinazione con il protocollo VirusBlood200 (volume di estrazione: 200 μl, volume di eluizione: 60 μl). Ogni campione è stato analizzato con il kit artus CMV QS-RGQ. Il range lineare del kit artus CMV QS-RGQ (tenendo conto della purificazione) è stato determinato per coprire le concentrazioni da 1,00 x 10 3 copie/ml a 5,00 x 10 7 copie/ml per il sangue intero (Figura 4). log 10 della log concentrazione 10 estimated concentration stimata (copie/ml) (copies/ml) y y = 1,0514x x 0, R 2 R 2 = = 0, log log 10 nominal concentration (copies/ml) 10 della concentrazione nominale (copie/ml) Figura 4. Range lineare del kit artus CMV QS-RGQ (sangue intero). Calcolo del range lineare. La linea retta è stata determinata mediante una regressione lineare del log 10 delle concentrazioni calcolate con il log 10 delle concentrazioni nominali. La figura mostra l equazione della linea di regressione. Robustezza plasma La verifica della robustezza consente la determinazione del tasso globale d errore del kit artus CMV QS-RGQ. Per verificare la robustezza, 100 campioni di sangue intero CMV-negativi sono stati arricchiti con 500 copie/ml di CMV (concentrazione pari all incirca a tre volte il limite di sensibilità analitica). In seguito ad estrazione con il kit QIAsymphony DNA Mini in combinazione con il protocollo VirusBlood200 per il sangue intero, questi campioni sono stati analizzati con il kit artus CMV QS-RGQ. Inoltre, la robustezza del controllo interno è stata valutata mediante purificazione e analisi dei 100 campioni di Manuale del kit artus CMV QS-RGQ 12/

16 sangue intero arricchiti. Non sono state osservate inibizioni. La robustezza del kit artus CMV QS-RGQ è risultata 99%. Precisione I dati sulla precisione del kit the artus CMV QS-RGQ consentono la determinazione della varianza totale del test. La varianza totale è costituita dalla variabilità intra-assay (variabilità di risultati multipli di campioni con la stessa concentrazione all interno di uno stesso esperimento), dalla variabiltà inter-assay (variabilità di risultati multipli del test ottenuti su diversi strumenti dello stesso tipo da diversi operatori all interno dello stesso laboratorio) e dalla variabilità inter-lotto (variabilità di risultati multipli del test utilizzando diversi lotti). I dati ottenuti sono stati utilizzati per determinare la deviazione standard, la varianza e il coefficiente di variazione per il patogeno specifico e il controllo interno di PCR. I dati di precisione analitica del kit artus CMV QS-RGQ (senza tenere conto della purificazione) sono stati raccolti utilizzando la quantità standard della concentrazione più bassa (QS 4; 10 copie/μl). L analisi è stata eseguita con 8 replicati. I dati di precisione sono stati calcolati sulla base dei valori C T delle curve di amplificazione (C T : ciclo soglia, vedi Tabella 2, pag. 17). Inoltre, i dati di precisione relativi ai risultati quantitativi in copie/μl sono stati determinati utilizzando i corrispondenti valori C T (Tabella 3, pag. 17). Sulla base di questi risultati, lo scarto statistico di un dato campione con la concentrazione menzionata è pari a 1,21% (C T ) o 14,38% (concentrazione), e a 1,93% (C T ) per la rilevazione del controllo interno. Questi valori si basano sulla totalità dei singoli valori delle variabilità stabilite. 16 Manuale del kit artus CMV QS-RGQ 12/2010

17 Tabella 2. Dati di precisione sulla base dei valori C T Variabilità intra-assay: CMV QS 4 Variabilità intra-assay: controllo interno Variabilità inter-assay: CMV QS 4 Variabilità inter-assay: controllo interno Variabilità inter-lotto: CMV QS 4 Variabilità inter-lotto: controllo interno Varianza totale: CMV QS 4 Varianza totale: controllo interno Deviazione standard Varianza Coefficiente di variazione (%) 0,17 0,03 0,57 0,31 0,10 1,16 0,38 0,14 1,27 0,47 0,22 1,77 0,33 0,11 1,10 0,53 0,28 2,02 0,36 0,13 1,21 0,51 0,26 1,93 Tabella 3. Dati di precisione sulla base dei risultati quantitativi (in copie/μl) Variabilità intra-assay: CMV QS 4 Variabilità inter-assay: CMV QS 4 Variabilità inter-lotto: CMV QS 4 Varianza totale: CMV QS 4 Deviazione standard Varianza Coefficiente di variazione (%) 1,34 1,80 13,30 1,54 2,38 15,25 1,46 2,12 14,41 1,45 2,11 14,38 Manuale del kit artus CMV QS-RGQ 12/

18 Riproducibilità I dati di riproducibilità consentono una regolare valutazione delle prestazioni del kit artus CMV QS-RGQ, nonché un confronto di efficacia con altri prodotti. Questi dati sono ottenuti dalla partecipazione a programmi di performance consolidati. Cross-contaminazione L assenza di cross-contaminazione fra i campioni per l intero flusso di lavoro è stata dimostrata dalla corretta rilevazione di tutti i campioni positivi e negativi in posizioni alternate (modello a scacchiera) per un sistema artus QS-RGQ rappresentativo. Flusso di lavoro Il flusso di lavoro di QIAsymphony RGQ inizia con la purificazione degli acidi nucleici da campioni di plasma o di sangue intero umano sullo strumento QIAsymphony SP. Gli eluiti contenenti gli acidi nucleici purificati, ottenuti dalla procedura di preparazione del campione, vengono trasferiti al modulo QIAsymphony AS che esegue il setup del test (Figura 5). I test sono poi trasferiti al Rotor-Gene Q per analisi della PCR e dei dati (Figura 6). Un riepilogo del flusso di lavoro è fornito nelle pagine Per maggiori informazioni, vedere i protocolli dettagliati nel presente manuale (pagine 35, 44 e 51). 18 Manuale del kit artus CMV QS-RGQ 12/2010

19 Figura 5. Automazione walkaway sugli strumenti QIAsymphony SP/AS. Campioni, reagenti e prodotti di consumo vengono caricati nei rispettivi cassetti. La preparazione dei campioni e il setup del test sono poi completamente automatizzati sugli strumenti QIAsymphony SP/AS. Figura 6. Trasferimento dei campioni al Rotor-Gene Q. Dopo la preparazione del campione e il setup del test, le reazioni sono caricate nel 72-Well Rotor del Rotor-Gene Q per l analisi della real-time PCR. Manuale del kit artus CMV QS-RGQ 12/

20 Riepilogo del flusso di lavoro di QIAsymphony QIAsymphony SP Caricare il cassetto Waste" (Materiali di scarto). Caricare il rack per eluizione nel cassetto Eluate (Eluito). Funzionamento indipendente Funzionamento integrato Caricare il rack per eluizione sullo slot 1. Caricare il rack per eluizione con adattatore, incluso il telaio di trasferimento, sullo slot 1. Caricare il cassetto Reagents and Consumables (Reagenti e prodotti di consumo). Caricare il cassetto Sample (Campione). Definire una processazione/un lotto mediante l interfaccia utente della preparazione del campione. Avviare il protocollo. Terminata la processazione del campione, rimuovere manualmente il rack per eluizione dal cassetto Eluate (funzionamento indipendente), oppure trasferire direttamente il rack per eluizione al QIAsymphony AS mediante il modulo di trasferimento (funzionamento integrato). Funzionamento indipendente Funzionamento integrato Rimuovere l assegnazione dello slot di eluizione sul touch screen, poi aprire il cassetto Eluate (Eluito) e rimuovere manualmente il rack per eluizione. Premere Transfer (Trasferimento) per trasferire il rack per eluizione dal QIAsymphony SP al QIAsymphony AS. Scaricare il file dei risultati di QIAsymphony SP. 20 Manuale del kit artus CMV QS-RGQ 12/2010

21 QIAsymphony AS Passare all interfaccia utente di setup del test sul touch screen. Avviare la procedura di definizione del test. Funzionamento indipendente Funzionamento integrato Premere New (Nuovo). Viene visualizzato un messaggio che chiede se usare il rack di eluizione come rack campioni. Premere Yes per confermare. Definire un analisi. Le schermate visualizzate sul touch screen servono da guida passo per passo attraverso tutto il processo di definizione del test. Caricare nei cassetti Eluate and Reagents (Eluiti e reagenti) e Assays (Test) i campioni, i reagenti e i prodotti di consumo del caso. Per informazioni particolareggiate sul carico, vedere la schermata Loading Information (Informazioni sul carico). In alternativa, premere Queue (Coda) e scaricare il file delle informazioni. Avviare l analisi. Terminata l analisi, rimuovere i test. Premere Remove (Rimuovere) e poi rimuovere manualmente il o i rack dal cassetto Assays. Trasferire il o i rack al Rotor-Gene Q. Scaricare il file dei risultati di QIAsymphony AS e il file del termociclatore. Trasferire il file del termociclatore al Rotor-Gene Q. Manuale del kit artus CMV QS-RGQ 12/

22 Rotor-Gene Q Selezionare o creare un profilo termico. Cliccare Start Run (Avvio analisi). Terminata l analisi, analizzare i risultati. Manutenzione Eseguire le corrette procedure di manutenzione per QIAsymphony SP/AS e Rotor-Gene Q secondo i manuali per l uso degli strumenti relativi. Vedere la sezione 8 del Manuale utente QIAsymphony SP/AS Descrizione generale e la sezione 9 del Manuale utente Rotor-Gene Q per maggiori dettagli sulle procedure di manutenzione quotidiane, periodiche e settimanali. 22 Manuale del kit artus CMV QS-RGQ 12/2010

23 Equipaggiamento e reagenti in dotazione all utente Quando si opera con sostanze chimiche, indossare sempre un camice da laboratorio, guanti monouso e occhiali protettivi. Per ulteriori informazioni, consultare le appropriate schede di sicurezza (MSDS), disponibili presso il fornitore dei prodotti. Pipette (regolabili)* e puntali per pipetta sterili con filtri Agitatore vortex * Centrifuga da banco* con rotore per provette di reazione da 2 ml, per centrifugazione a 6800 x g Per la preparazione dei campioni Strumento QIAsymphony SP (cat. n )* Kit QIAsymphony DSP Virus/Pathogen Midi (cat. n ) per campioni di plasma o kit QIAsymphony DNA Mini (cat. n ) per campioni di sangue intero Adattatori per QIAsymphony SP: Rack QS per microprovette di eluizione (adattatore di raffreddamento, EMT, v2, Qsym, cat. n ) Inserto provetta 3B (Inserto, 2.0ml v2, portacamp. (24), Qsym, cat. n ) Prodotti di consumo per QIAsymphony SP: Cartucce di preparazione dei campioni, 8 pozzetti (cat. n ) Coperchi per 8 barre (cat. n ) Puntali con filtro, 1500 μl (cat. n ) Puntali con filtro, 200 μl (cat. n ) Microprovette di eluizione CL (cat. no ) Sacchetti per smaltimento puntali (cat. n ) Microprovette da 2,0 ml tipo H o microprovette da 2,0 ml tipo I (Sarstedt, cat. n e , da usare con campioni e controlli interni Per il setup del test Strumento QIAsymphony AS (cat. n )* * Assicurarsi che gli strumenti siano stati revisionati e calibrati secondo le raccomandazioni del produttore. Manuale del kit artus CMV QS-RGQ 12/

24 Adattatori e portareagenti per QIAsymphony AS: Portareagente 1 QS (Adattatore raffreddamento, portareagente 1, Qsym, cat. n ) Portareagente 2 QS (Adattatore raffreddamento, portareagente 2, Qsym, cat. n ) Provette per strisce RG 72 QS (adattatore raffreddamento, provette per strisce RG 72, Qsym, cat. n ) Prodotti di consumo per QIAsymphony AS: Provette per strisce e tappi, 0.1 ml (cat. n ) Provette coniche, 2 ml, Qsym AS (cat. n ) o microprovette da 2.0 ml tipo I (Sarstedt, cat. n , Provetta conica, 5 ml, Qsym AS (cat. n ) o provette a base piatta da PP (Sarstedt, cat. n , Flaconi reagente, 30 ml, Qsym AS (cat. n ) Microprovette di eluizione CL (cat. no ) Puntali con filtro, 1500 μl (cat. n ) Puntali con filtro, 200 μl (cat. n ) Puntali con filtro, 50 μl (cat. n ) Sacchetti per smaltimento puntali (cat. n ) Per PCR Strumento Rotor-Gene Q 5plex HRM* Software Rotor-Gene Q versione 2.02, o superiore * Assicurarsi che gli strumenti siano stati revisionati e calibrati secondo le raccomandazioni del produttore. Consigliamo di informarsi sulla disponibilità. 24 Manuale del kit artus CMV QS-RGQ 12/2010

25 Note importanti Precauzioni generali Attenersi sempre a quanto segue: Utilizzare puntali con filtro sterili per pipette. Durante le operazioni manuali, tenere chiuse le provette il più possibile ed evitare ogni contaminazione. Prima dell inizio del test scongelare tutti i componenti a temperatura ambiente (15 25 C). Una volta scongelati, miscelare i componenti (pipettandoli ripetutamente su e giù o in vortex a impulsi) e sottoporli a breve centrifugazione. Verificare che nelle provette dei reagenti non siano presenti bolle o schiuma. Non miscelare i componenti di kit con numero di lotto diverso. Accertarsi che gli adattatori necessari siano stati preraffreddati a 2 8 C. Prima del caricamento, operare rapidamente tenendo i reagenti per PCR in ghiaccio o nel blocco di raffreddamento. Procedere senza interruzioni da una fase all altra del flusso di lavoro. Non superare mai un ora di tempo per il trasferimento da un modulo all altro (da QIAsymphony SP a QIAsymphony AS a Rotor-Gene Q). Prelievo, conservazione e trasporto dei campioni Tutti i campioni vanno trattati come materiale potenzialmente infettivo. Sono ammessi come campioni solo i seguenti materiali, per i quali si dovranno osservare scrupolosamente le regole e le istruzioni particolari qui riportate per il prelievo, il trasporto e la conservazione. La validazione interna del kit artus CMV QS-RGQ è stata effettuata su campioni di plasma umano in EDTA e campioni di sangue umano intero in EDTA. Non sono stati validati altri materiali come campioni. Per preparare il campione, utilizzare unicamente il kit raccomandato per l isolamento del DNA (vedere Protocollo: isolamento del DNA sul QIAsymphony SP, pag. 35). Utilizzando come campioni certi materiali, si dovranno osservare scrupolosamente alcune istruzioni particolari per il prelievo, il trasporto e la conservazione. Manuale del kit artus CMV QS-RGQ 12/

26 Prelievo dei campioni Ogni prelievo di sangue causa lesioni ai vasi (arterie, vene, capillari). Utilizzare unicamente materiali innocui e sterili. Per il prelievo di sangue sono disponibili appositi materiali monouso. Non utilizzare aghi capillari troppo sottili per la punzione in vena. Il prelievo di sangue venoso deve essere eseguito in punti appropriati, nella piega del gomito, nell avambraccio o sul dorso della mano. Il sangue deve essere prelevato con provette standard per campioni (tappo rosso, Sarstedt o provette equivalenti di altra marca). Prelevare un volume di 5 10 ml di sangue EDTA. Miscelare le provette capovolgendole più volte subito dopo la raccolta del campione (8 x, senza agitare). Non usare campioni da soggetti eparinizzati (vedere Sostanze interferenti plasma e Sostanze interferenti sangue intero di seguito). Conservazione dei campioni Per il plasma, il sangue intero deve essere separato in plasma e componenti cellulari mediante centrifugazione per 20 minuti a x g entro 6 ore. Il plasma così isolato deve essere immesso in provette sterili in polipropilene. La sensibilità del test può risultare ridotta se si congelano i campioni di routine o li si conserva per un lungo periodo. Trasporto dei campioni in linea di principio, il materiale dei campioni deve essere trasportato in un contenitore idoneo infrangibile. Si evita così il pericolo potenziale d infezione dovuto a perdite. I campioni devono essere trasportati secondo le norme locali e nazionali per il trasporto di materiali patogeni.* I campioni devono essere spediti entro 6 ore. È preferibile non conservare i campioni nello stesso luogo in cui sono stati prelevati. È possibile spedire i campioni per posta, secondo le norme legali per il trasporto di materiali patogeni. Noi raccomandiamo di effettuare il trasporto per corriere. I campioni di sangue vanno spediti refrigerati (2 8 C) e il plasma separato surgelato ( 15 / 30 C). Sostanze interferenti plasma Il sistema non è influenzato dai livelli elevati di albumina ( 6 g/dl), bilirubina ( 30 mg/dl) e lipidi ( 1 g/dl trigliceridi) né dai campioni emolitici ( 2 g/dl emoglobina). L eparina influisce sulla PCR. Non si devono utilizzare i campioni raccolti in provette contenente eparina come anticoagulante. Non si devono utilizzare neppure i campioni di pazienti eparinizzati. * International Air Transport Association (IATA). Dangerous Goods Regulations. 26 Manuale del kit artus CMV QS-RGQ 12/2010

27 Sostanze interferenti sangue intero Il sistema non è influenzato dai livelli elevati di bilirubina ( 30 mg/dl), lipidi ( 1 g/dl trigliceridi), né di DNA genomico umano ( 3 μg/ml). L eparina influisce sulla PCR. Non si devono utilizzare i campioni raccolti in provette contenente eparina come anticoagulante. Non si devono utilizzare neppure i campioni di pazienti eparinizzati. Preparazione degli strumenti QIAsymphony SP/AS Chiudere tutti i cassetti e i coperchi. Accendere gli strumenti QIAsymphony SP/AS e attendere la visualizzazione della schermata Sample Preparation e la fine della procedura di inizializzazione. Registrarsi nello strumento (i cassetti si sbloccano). Caricamento delle cartucce reagenti (RC) nel cassetto Reagents and Consumables I reagenti per la purificazione degli acidi nucleici sono contenuti in un innovativa cartuccia reagenti (RC) (vedere la Figura 7). Ciascun recipiente della cartuccia reagenti (RC) contiene un particolare reagente, vale a dire particelle magnetiche, tampone di lisi, tampone di lavaggio oppure tampone di eluizione. Le cartucce reagenti (RC) utilizzate solo parzialmente possono essere richiuse con le Strisce Sigillanti Riutilizzabili per evitare la produzione di scarti a causa dei reagenti rimasti al termine della procedura di purificazione. Coperchio perforante (PL) Rack per enzima (ER) Aperture per i tappi a vite delle provette per enzima Striscia Sigillante Riutilizzabile Recipiente per particelle magnetiche Telaio con recipienti per reagenti Supporto della cartuccia reagenti Figura 7. Cartuccia reagenti QIAsymphony (RC). La cartuccia reagenti (RC) contiene tutti i reagenti necessari per la procedura di purificazione. Manuale del kit artus CMV QS-RGQ 12/

28 Prima di avviare la procedura, accertarsi che le particelle magnetiche siano completamente risospese. Rimuovere il recipiente delle particelle magnetiche dal telaio della cartuccia reagenti, agitarlo vigorosamente su vortex per almeno 3 minuti e riposizionarlo nel telaio della cartuccia reagenti prima dell uso. Collocare la cartuccia reagenti (RC) sul relativo supporto. Collocare il rack per enzima (ER) sul supporto della cartuccia reagenti. Prima di utilizzare una cartuccia reagenti (RC) per la prima volta, posizionare il coperchio perforante (PL) sulla cartuccia reagenti (RC) (Figura 8). Il coperchio perforante (PL) presenta parti acuminate. Fare attenzione quando lo si posiziona sulla cartuccia reagenti (RC). Accertarsi di posizionare il coperchio perforante (PL) sulla cartuccia reagenti (RC) nel senso corretto. Dopo aver aperto il recipiente delle particelle magnetiche e le provette del rack per enzima (i tappi a vite possono essere conservati nelle apposite aperture, vedere Figura 5), si procede caricando la cartuccia reagenti (RC) nel cassetto Reagents and Consumables. Coperchio perforante (PL) Figura 8. Semplice preparazione della stazione di lavoro con cartuccia reagenti (RC). Le cartucce reagenti (RC) utilizzate solo parzialmente possono essere conservate fino al successivo utilizzo; vedere Conservazione nel Manuale QIAsymphony DSP Virus/Pathogen o nel Manuale QIAsymphony DNA. Caricamento della plastica da laboratorio nel cassetto Reagents and Consumables Caricare le cartucce per la preparazione dei campioni, i coperchi per 8 barre (entrambi preposizionati su rack in box unitari) e i puntali con filtro monouso (puntali da 200 μl forniti in rack blu, puntali da 1500 μl forniti in rack neri) nel cassetto Reagents and Consumables. 28 Manuale del kit artus CMV QS-RGQ 12/2010

29 Accertarsi che i coperchi dei box unitari vengano rimossi prima di caricare i box stessi nel cassetto Reagents and Consumables. I puntali sono provvisti di filtri per impedire la cross-contaminazione. Le aperture del rack per puntali sulla stazione di lavoro QIAsymphony SP possono essere occupate da qualsiasi tipo di rack per puntali. Il sistema QIAsymphony SP identificherà il tipo di puntale caricato durante la scansione di inventario. Non rifornire i rack per puntali o i box unitari con le cartucce per la preparazione dei campioni o con i coperchi per 8 barre prima di avviare l esecuzione di un altro protocollo. Il sistema QIAsymphony SP è in grado di utilizzare rack e box parzialmente utilizzati. Caricamento del cassetto Waste (Rifiuti) Le cartucce per la preparazione dei campioni e i coperchi per 8 barre utilizzati per l esecuzione di un protocollo vengono riposti su rack in box unitari vuoti nel cassetto Waste. Accertarsi che il cassetto Waste contenga sufficienti box unitari vuoti per la plastica da laboratorio prodotta durante l esecuzione del protocollo. Accertarsi che i coperchi dei box unitari vengano rimossi prima di caricare i box nel cassetto Waste. Se si utilizzano i box dei coperchi per 8 barre per raccogliere sia le cartucce per la preparazione dei campioni usati che i coperchi per 8 barre usate, accertarsi che venga rimosso lo spaziatore nei box. Sul lato anteriore del cassetto Waste attaccare un sacchetto per raccogliere i puntali con filtro usati. Il sistema non verifica la presenza del sacchetto per lo smaltimento dei puntali. Accertarsi che il sacchetto sia correttamente attaccato prima di avviare l esecuzione di un protocollo. Per maggiori informazioni consultare i manuali d uso in dotazione con lo strumento. Svuotare il sacchetto dei puntali dopo la processazione di max. 96 campioni per evitare l intasamento. Il contenitore di scarico raccoglie i residui liquidi prodotti durante la procedura di purificazione. Il cassetto Waste si chiude solo se il contenitore di scarico è inserito. Smaltire i residui liquidi in conformità con le normative di sicurezza e ambientali locali vigenti in materia. Non autoclavare il contenitore di scarico pieno. Svuotare il contenitore di scarico dopo aver processato al massimo 96 campioni. Manuale del kit artus CMV QS-RGQ 12/

30 Caricamento del cassetto Eluate (Eluito) Caricare il rack per eluizione necessario nel cassetto Eluate. Utilizzare lo Elution slot 1 con il corrispondente adattatore di raffreddamento. Per il funzionamento integrato, caricare il rack per eluizione con adattatore, incluso il telaio di trasferimento, sullo slot 1. Scansione di inventario Prima di avviare la procedura, lo strumento controlla che nei corrispondenti cassetti siano stati caricati sufficienti materiali di consumo per i lotti in coda. Preparazione dei campioni Il kit QIAsymphony DSP Virus/Pathogen Midi è adatto all'impiego con campioni di plasma umano, il kit QIAsymphony DNA Mini all impiego con campioni di sangue umano intero. Evitare la formazione di schiuma all interno o sui campioni. I campioni devono essere termostatati a temperatura ambiente (15 25 C) prima di avviare la procedura. Preparazione delle miscele di carrier RNA (CARRIER) tampone AVE (AVE) per campioni di plasma Il carrier RNA (CARRIER) deve essere impiegato quando si usa il kit QIAsymphony DSP Virus/Pathogen Midi. Per preparare una soluzione madre contenente il carrier RNA, aggiungere 1350 μl di tampone AVE (AVE) (fornito in flaconcini da 2 ml) alla provetta contenente 1350 μg di carrier RNA liofilizzato in modo da ottenere una soluzione di 1 μg/μl. Disciogliere completamente il carrier RNA (CARRIER), dividerlo in aliquote di opportune dimensioni e conservarlo a 2 8 C al massimo per 2 settimane. Calcolo del volume della miscela di carrier RNA (CARRIER) per provetta Il volume minimo di miscela di carrier RNA (CARRIER) tampone AVE (AVE) deve tenere conto della perdita di liquido dovuta al pipettaggio e all evaporazione. Vedere la Tabella 4 per i volumi da utilizzare per l analisi con il kit artus CMV QS-RGQ. Le provette contenenti la miscela di carrier RNA (CARRIER) tampone AVE (AVE) e un controllo interno vengono collocate in un portaprovette. Il portaprovette contenente la/e miscela/e di carrier RNA (CARRIER) tampone AVE (AVE) deve essere collocato nello slot A del cassetto del campione. Si possono utilizzare fino a 8 provette della miscela per ogni lotto e fino a 24 provette per ogni analisi di 4 lotti. 30 Manuale del kit artus CMV QS-RGQ 12/2010

31 Uso di un controllo interno Un controllo interno (CMV IC) viene fornito con il kit artus CMV QS-RGQ. Questo controllo permette all utilizzatore sia di controllare la procedura di isolamento del DNA che di verificare la possibile inibizione della PCR. Se si analizzano CMV e EBV nella stessa PCR sul Rotor-Gene Q (vedere Analisi con dosaggio multiplo, pag. 33), utilizzare il CMV IC per tutti i campioni e non l EBV RG IC incluso nel kit artus EBV QS-RGQ Kit. Utilizzare lo stesso CMV IC anche per setup del test dei controlli PCR (fase 13 del protocollo di setup del test, pag. 46). L utilizzo del kit QIAsymphony DSP Virus/Pathogen Midi o del kit QIAsymphony DNA Mini in combinazione con il kit artus CMV QS-RGQ richiede l inserimento del controllo interno (CMV IC) nella procedura di purificazione per monitorare l efficienza della preparazione dei campioni e del test a valle. Per i campioni di plasma, i controlli interni vanno aggiunti alla miscela di carrier RNA (CARRIER) tampone AVE (AVE); il volume totale della miscela controllo interno carrier RNA (CARRIER) tampone AVE (AVE) deve rimanere di 120 μl. Per i campioni di sangue intero, i controlli interni devono essere diluiti nel Tampone ATE. Si aggiunge un volume totale di 60 μl di miscela di controllo interno tampone ATE per campione. Per questa applicazione, aggiungere il controllo interno all'isolamento come riportato nella Tabella 4. Questo rappresenta l aggiunta di controllo interno all isolamento in ragione di 0,1 μl per 1 μl di volume di eluizione. Si consiglia di preparare miscele fresche per ogni analisi subito prima dell uso. Manuale del kit artus CMV QS-RGQ 12/

32 Tabella 4. Preparazione del controllo interno carrier RNA (CARRIER) Whole blood Plasma samples samples Componente Volume (μl) Volume (μl) Soluzione madre con carrier RNA (CARRIER) 5 0 Controlo internol* 9 9 Tampone AVE Tampone ATE 0 51 Volume finale per campione (volume morto escluso) Volume totale per n campioni (n x 120) (n x 60) * Il calcolo della quantità di controllo interno è basato sui volumi di eluizione iniziali (90 μl). Il volume addizionale a vuoto dipende dal tipo di provetta per campione utilizzata. Non caricare con oltre 1,92 ml (corrispondenti ad un massimo di 13 o 26 campioni; questo volume è specifico per le microprovette da 2,0 ml tipo H e le microprovette da 2,0 ml tipo I, Sarstedt cat. n e ). La miscela di controllo interno richiesta corrisponde a 3 campioni supplementari (ossia 360 μl) (questo volume è specifico per le microprovette da 2,0 ml tipo H e le microprovette da 2,0 ml tipo I, Sarstedt cat. n e ). La miscela di controllo interno richiesta corrisponde a 4 campioni supplementari (ossia 240 μl) (questo volume è specifico per le microprovette da 2,0 ml tipo H e le microprovette da 2,0 ml tipo I, Sarstedt cat. n e ). Set di controllo del test e set di parametri del test I set di controllo del test combinano un protocollo con alcuni parametri addizionali, quali un controllo interno, per la purificazione del campione sul QIAsymphony SP. Un set predefinito di controllo del test è preinstallato per ogni protocollo. Se si analizzano CMV e EBV nella stessa PCR sul Rotor-Gene Q (vedere Analisi con dosaggio multiplo di seguito), utilizzare il set di controllo del test CMV adeguato per la purificazione dei campioni. 32 Manuale del kit artus CMV QS-RGQ 12/2010

33 I set di parametri del test combinano una definizione del test con alcuni parametri addizionali definiti, quali conteggio dei replicati e numero degli standard del test, per il setup del test sul QIAsymphony AS. Analisi con dosaggio multiplo In certi casi è possibile effettuare il dosaggio di più patogeni in un singolo campione nella stessa PCR all'interno del flusso di lavoro QIAsymphony RGQ. In questo caso si parla di analisi con dosaggio multiplo. Per eseguire un analisi con dosaggio multiplo occorre soddisfare diverse condizioni. Il kit artus CMV QS-RGQ può essere utilizzato con il kit artus EBV QS-RGQ (cat. n ) nell'esecuzione dell analisi con dosaggio multiplo se vengono rispettate le condizioni seguenti. Preparazione dei campioni sul QIAsymphony SP Per la purificazione dei campioni da analizzare per CMV e EBV utilizzando lo stesso eluito, utilizzare il CMV IC per tutti i campioni e non l'ebv RG IC incluso nel kit artus EBV QS-RGQ. Servirsi del set di controllo del test CMV adeguato per la purificazione dei campioni. Setup del test sul QIAsymphony AS Per una corretta quantificazione e valida informazione fornita dal controllo interno, il controllo interno per il setup dei due dosaggi deve corrispondere a quello utilizzato per la preparazione del campione (CMV IC). Utilizzare un CMV IC proveniente dallo stesso lotto per la preparazione dei due campioni e per il setup del test dei controlli PCR (fase 13 del protocollo di setup del test, pag. 46). Non utilizzare un CMV IC con un numero di lotto diverso. PCR sul Rotor-Gene Q Date le differenze di intensità di fluorescenza quando si utilizzano 2 test diversi nell'analisi con dosaggio multiplo, è necessario eseguire una calibrazione del gain per ciascun sistema di rilevamento artus separatamente prima di iniziare la PCR (fasi 9 15 del protocollo PCR, pag ). Rese degli acidi nucleici Gli eluiti preparati con carrier RNA (CARRIER) possono contenere molto più carrier RNA (CARRIER) degli acidi nucleici bersaglio. Si consiglia di utilizzare metodi di amplificazione quantitativa per stabilire le rese. Manuale del kit artus CMV QS-RGQ 12/

34 Conservazione degli acidi nucleici Per una conservazione a breve termine che non superi le 24 ore, si consiglia di mantenere gli acidi nucleici purificati a una temperatura di 2 8 C. Per una conservazione a lungo termine che superi le 24 ore, si consiglia la conservazione a 20ºC. Impostazione della soglia per l'analisi PCR Le impostazioni ottimali di soglia per una data combinazione dello strumento Rotor-Gene Q e del kit artus QS-RGQ devono essere stabilite empiricamente provando ciascuna singola combinazione, dato che si tratta di un valore relativo che dipende dal flusso di lavoro diagnostico generale. Come punto di partenza si può fissare la soglia ad un valore preliminare di 0,04 per l'analisi della prima PCR, ma questo valore deve essere affinato in un'analisi comparativa dei successivi processi del flusso di lavoro. La soglia deve essere impostata manualmente appena sopra il segnale di background dei controlli negativi e dei campioni negativi. Il valore medio di soglia calcolato da questi esperimenti funzionerà molto probabilmente per la maggioranza dei processi futuri, ma l'utilizzatore dovrà ugualmente rivedere il valore di soglia prodotto ad intervalli regolari. Il valore di soglia sarà normalmente compreso nel range 0,03 0,05 e dovrà essere arrotondato a non più di tre cifre decimali. Quantificazione Gli standard di quantificazione (CMV QS 1 4) nel kit artus CMV QS-RGQ sono trattati come campioni precedentemente purificati e si usa lo stesso volume (20 μl). Per generare una curva standard sugli strumenti Rotor-Gene Q, tutti i 4 standard quantitativi devono essere utilizzati e definiti nella finestra di dialogo Edit Samples dello strumento Rotor-Gene Q come standard con le concentrazioni specificate (vedere manuale utente dello strumento). Gli standard di quantificazione sono definiti come UI/μl. Si deve applicare la seguente equazione per convertire i valori, determinati mediante la curva standard, in copie/ml di campione. Risultato (copie/ml) = Risultato (copie/μl) x volume di eluizione iniziale (90 μl)* Volume campione (ml) In linea di principio, si deve immettere nell equazione di cui sopra il volume iniziale del campione. Occorre tenere conto di ciò quando il volume del campione è stato cambiato prima dell estrazione dell acido nucleico (per es. riducendo il volume mediante centrifugazione o aumentandolo con l aggiunta al volume richiesto per l isolamento). * Il calcolo è basato sui volumi di eluizione iniziali (90 μl). 34 Manuale del kit artus CMV QS-RGQ 12/2010