Lab Developed Testing Solutions FLOW. Caratteristiche del sistema
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- Bernardo Antonucci
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1 Lab Developed Testing Solutions FLOW Caratteristiche del sistema
2 Trasforma il tuo laboratorio con la Soluzione FLOW La Soluzione FLOW è un flusso di lavoro estremamente flessibile, modulabile, semi automatizzato che include dati e campioni. Processa senza interruzione varie tipologie di campione e di provette in maniera del tutto tracciabile, grazie al codice a barre, dalla manipolazione dei campioni primari, all estrazione degli acidi nucleici all allestimento della PCR fino alla qpcr. La connettività LIMS, la gestione del software middleware e una struttura informatica intelligente agevolano la transizione dei dati, senza lasciare spazio agli errori manuali. La natura modulabile degli strumenti e dell analisi consente di migliorare davvero il tuo laboratorio, e di farlo come vuoi tu. FLOW Flex FLOW Flex è la configurazione strumentale minima che può essere supportata dal software FLOW. È costituita da uno strumento per l allestimento della PCR (PCR Setup PSU), da uno strumento MagNa Pure 96 e da uno strumento Roche per la PCR quantitativa. Nel FLOW Flex lo strumento per il setup della PCR viene utilizzato anche per la gestione dei Campioni Primari (Primary Sample Handling PSH) generando così un flusso di lavoro non lineare dei campioni. FLOW Classic FLOW Classic ha la stessa configurazione strumentale di FLOW Flex, con un robot pipettatore in più che può essere sia una stazione per il Primary Sample Hndling (PSH) che una stazione per il setup dellla PCR (PSU). In questa configurazione, il flusso di lavoro è lineare e prevede compiti specifici per ogni robot pipettatore. 2
3 Espandi le tue possibilità Sono due le strade per implementare la Soluzione FLOW: installare un FLOW Flex o un FLOW Classic aggiuntivo o aggiungere sistemi di estrazione e amplificazione a un flusso di lavoro esistente. Di seguito, alcuni esempi: FLOW Fusion FLOW Fusion è un applicazione software che consente di far funzionare due diverse installazioni FLOW in maniera coordinata. Consente carichi indipendenti di campioni e genera opzioni di flusso di lavoro più flessibili. Questo strumento software opera con flussi di lavoro lineari e non. Tale configurazione richiede una Licenza Aggiuntiva del Software FLOW (FLOW Software Additional License). FLOW Fusion e la Licenza Aggiuntiva saranno disponibili quando verrà rilasciata la versione 2.1 del Software FLOW. FLOW Ultra FLOW Ultra è una configurazione che espande un installazione FLOW con molteplici strumenti MagNa Pure (3 al massimo) e per la qpcr (5 al massimo). Questa opzione viene supportata nei flussi di lavoro lineari e non, e richiede solo una licenza FLOW Software. Esiste anche la possibilità di combinare FLOW Ultra e FLOW Fusion. 3
4 Strumento FLOW Primary Sample Handling Gestisce diverse tipologie di campione Accetta indistintamente provette primarie e secondarie Pipetta il campione nelle piastre di processamento del MagNA Pure 96 Dotato di sensore per i coaguli Opera in ambiente chiuso Monitora a 360 gradi l intero processo Fabbricato da Hamilton secondo le Norme di Buona Fabbricazione (GMP) FLOW Primary Sample Handling Utilizzo Gestione dei Campioni Primari per il Sistema MagNa Pure 96 Trasferimento dei campioni dalla provetta alla piastra di processamento del MagNa Pure 96 Tipologia Strumento da banco Dimensioni 112,4 90,3 100,6 cm (L P A) Peso Tempo di esecuzione Tempo di preparazione Tipologia di campioni Tipologie di provette primarie e secondarie supportate 163 kg Trasferimento di 96 campioni da provetta a piastra in circa 20 minuti, a seconda del materiale campionato Massimo 15 minuti per posizionare manualmente campioni, puntali e piastre sul vassoio di caricamento Il caricamento con la lettura dei codici a barre avviene in automatico Senza pretrattamento: sangue intero, siero, plasma, cellule in sospensione (risospese in PBS), saliva, urina Con pretrattamento: Lavaggio bronco alveolare, feci, eluato di tampone, liquor, espettorato mm, mm, mm, mm Adattatori per le Provette FLOW (2 ml) Ogni corsa supporta fino a 256 campioni Capacità delle piastre 1 porta piastre di processamento del FLOW può alloggiare un massimo di 3 piastre di processamento del MagNA Pure 96 Volume dei campioni Pipettamento dei liquidi Determinazione del livello dei liquidi Volume di pipettamento minimo Lettura codice a barre Controllo contaminazioni Materiali monouso Puntali Piastre Provette μl. 1,000 μl solo per 48 campioni Un braccio pipettatore con 4 canali di aspirazione ad aria controllati in maniera indipendente Misura di livello del liquido capacitiva 50 µl a campione, 20 µl per il controllo interno Lettore di codice a barre montato sulla piattaforma di caricamento automatico per puntali e provette Lettore di codice a barre montato sul piano dello strumento per le piastre Lampada a UV Puntali High Vol, 1 ml con filtro Piastre di processamento del MagNA Pure 96 DA 96 POZZETTI Provette FLOW (2 ml) 4
5 Strumento MagNA Pure 96 Consente l estrazione di acidi nucleici fino a un massimo di 96 campioni in meno di un ora Flessibilità: può processare oltre 10 tipologie di campioni diversi per corsa Sicurezza del risultato, grazie al controllo delle operazioni e alla tracciabilità Ottima gestione dei campioni con elevata precisione intra e inter saggio e tra lotto e lotto Fabbricato secondo le norme di buona fabbricazione e registrato secondo CE-IVD Strumento MagNA Pure 96 Utilizzo Tipologia Il Sistema MagNA Pure 96 purifica DNA, RNA e acidi nucleici virali da vari materiali di partenza attraverso la tecnologia a particelle di vetro magnetiche (MGP) Strumento da banco Dimensioni ,5 100 cm (L P A) Peso Tempo di esecuzione Rack Numero di campioni 235 kg Circa 50/60 minuti per campioni con volume pari a 200 μl Circa 80/90 minuti per campioni con volume pari a 500 μl Rack di caricamento a cassetto per i reagenti d estrazione Da 1 a 96 reazioni per corsa Capacità delle piastre 1 per le piastre di processamento del MagNA Pure 96 1 per le piastre di uscita del MagNA Pure 96 Volume dei campioni Volume di eluizione Da 50 a 200 µl Pipettamento dei liquidi Rilevazione della pressione dei liquidi Lettura codice a barre Controllo contaminazioni Materiali monouso Puntali Piastre Reagenti Liquido di sistema Reagenti preriempiti e pronti all uso Da 50 a 500 μl con 96 reazioni per corsa, 1,000 μl solo per 48 campioni Due bracci robotici: 1. Reagente in testa con 4 canali per fluido controllati individualmente 2. Processo in testa con serie di 96 ugelli e pipette (tecnologia puntali CO-RE) Sensore di pressione per liquidi Lettore codice a barre interno e esterno Lampada a UV Puntali con filtro MagNA Pure 96 Filter Tips (1000 µl) Piastre di processamento MagNA Pure 96 Processing Cartridges Piastre di uscita MagNA Pure 96 Output Plates Contenitore interno del liquido di sistema del Magna Pure 96 da 2 lt oppure Contenitore esterno del liquido di sistema del Magna Pure 96 da 5 lt Kit per volumi ridotti per DNA e NA virale, marcato CE-IVD: MagNA Pure 96 DNA and Viral NA Small Volume Kit Kit per volumi elevati per DNA e NA virale, marcato CE-IVD: MagNA Pure 96 DNA and Viral NA Large Volume Kit Kit per volumi elevati per RNA cellulare: MagNA Pure 96 Cellular RNA Large Volume Kit (solo per uso ricerca. Non utilizzabile per procedure diagnostiche) 5
6 Strumento FLOW PCR Setup Allestimento reazione in funzione dei dati impostati Grande flessibilità nella preparazione della PCR Piastre da 96 e 384 pozzetti Preparazione in automatico della master mix Fabbricato da Hamilton secondo le norme di buona fabbricazione (GMP) Può supportare la funzione di FLOW Primary Sample Handling Strumento Roche per la Configurazione della PCR* Utilizzo Tipologia Strumento da banco Gestione dei campioni primari e/o Preparazione della PCR Dimensioni 112,4 90,3 100,6 cm (L P A) Peso180 kg Tempo di preparazione Tempo di esecuzione 15 minuti max. Dipende dal numero di campioni, dalla complessità dell allestimento della reazione e dal numero complessivo di reazioni; minuti per le applicazioni più comuni Capacità delle piastre 5 posizioni per piastre LightCycler 480 Multiwell PCR Plates 3 posizioni per le piastre di uscita MagNA Pure 96 Output Plates 2 posizioni per le piastre per le reazioni di retrotrascrizione (incubazione esterna necessaria) Preparazione automatizzata della master mix Per master mix pronte all uso, miscele di rilevazione o per singoli componenti Fino a 3 componenti (enzima, acqua, componente aggiuntivo) possono essere combinati per le reazioni della master mix Fino a 3 componenti (primer forward, primer reverse, sonda) possono essere combinati per preparare la miscela di reazione Supporta fino a 21 componenti per creare una master mix per PCR Pipettamento dei liquidi 8 canali indipendenti di pipettaggio da 1 ml Rilevazione del livello dei liquidi Volume di pipettamento minimo Rilevazione capacitiva del livello del liquido 5 μl in pozzetti vuoti, 2 μl in pozzetti parzialmente riempiti (piastra da 384) e 5 μl in pozzetti vuoti, 5 μl in pozzetti parzialmente riempiti (piastra da 96) Lettura codice a barre Lettore di codice a barre montato sulla piattaforma di caricamento automatico per puntali e provette Lettore di codice a barre montato sul piano dello strumento per le piastre Materiali monouso Puntali Puntali con filtro da 1 ml, 300 µl e 50 µl Piastre Provette Piastre di uscita MagNA Pure 96 Output Plates Piastre da 96 e 384 pozzetti LightCycler 480 Multiwell Plates (piastre specifiche con solo 4 codici a barre) Provette FLOW (2 ml) * Tutte le specifiche ivi contenute sono valide solo per la preparazione della PCR. Per le specifiche relative alla Gestione dei Campioni Primari, fare riferimento alle specifiche relative allo strumento FLOW Primary Sample Handling a pagina 4. 6
7 Strumento Roche per la qpcr Effettua 40 cicli in minuti Standard industriale consolidato con migliaia di strumenti installati nel mondo Eccellente accuratezza di temperatura e sensibilità Possibilità di connettere fino a 5 strumenti Roche per la qpcr da 96 o 384 pozzetti Fabbricato secondo le norme di buona fabbricazione Strumento Roche per la qpcr Utilizzo Tipologia Reazione di qpcr in piastre da 96 o 384 pozzetti Strumento da banco Dimensioni 57,4 58,8 49,7 cm (L P A) Peso Tempo di esecuzione 55 kg < 40 min. per 40 cicli con piastre da 384 pozzetti 40 cicli, con protocolli 2 step: < 40 min. (384) 40 cicli, con protocolli 2 step: < 60 min. (96) Numero di reazioni per corsa Fino a 96 o 384 reazioni per corsa (il blocco da 384 pozzetti è disponibile solo per LightCycler 480) Formato sonde/analisi Capacità di multiplex Intercalanti del DNA e Sonde a Idrolisi 6x Uniformità del CQ DS < 0,2 Accuratezza della temperatura ± 0,2 C della temperatura target Volumi di reazione FLOW 7 20 μl (384)/ μl (96) Tipologia di analisi Materiali monouso Quantificazione assoluta basata sul metodo del massimo della derivata seconda Piastre Piastre da 96/384 pozzetti LightCycler 480 Multiwell Plates (piastre specifiche con solo 4 codici a barre) 7
8 Software FLOW: Connetti il tuo laboratorio, come vuoi tu Software FLOW Applicazione Tempo di esecuzione PCR Analisi quantitative e qualitative Circa 4 ore, in funzione di: numero e tipologia di campioni; complessità della configurazione della PCR; profilo di PCR Produttività Fino a 256 estrazioni da campioni per corsa (con 3 strumenti MagNa Pure 96) Flessibilità Configurazioni Tempistica Rileva molteplici target per campione e per piastra; utilizza una o più piastre, per profili separati FLOW Classic, FLOW Flex, FLOW Fusion e FLOW Ultra (consultare le pagine 2 e 3 per ulteriori dettagli) sec. a campione per la Soluzione FLOW completa Manutenzione giornaliera e pulizia circa 15 min. (per l insieme degli strumenti) Software FLOW Configurazione FLOW Sedute in sovrapposizione Ripetizione test Gestisce l intero flusso di lavoro Gestisce lo scambio di informazioni tra tutti i moduli Comunica con il sistema LIS: download dal LIMS delle informazioni relative al campione download dal LIMS delle richieste dei test Creazione delle liste di lavoro Invio dei risultati al LIMS Possibilità di configurazione separata per tutti gli strumenti e per l unità di controllo FLOW (sistema a più stanze ) Al termine della purificazione della prima corsa, è possibile avviare una nuova corsa, ogni ora e mezzo circa. Di conseguenza, è possibile effettuare fino a 4 corse sovrapposte al giorno per FLOW Classic e 3 per FLOW Flex. Sì, con campioni e eluati Reflex test Sì, da eluati precedentemente testati Pianificazione delle sedute con il sistema FLOW Classic Una corsa completa con il FLOW richiede circa quattro ore. Quando la purificazione della prima seduta è terminata, può essere avviato un nuovo flusso di lavoro (ogni ora e mezzo, circa), il che implica che, ogni giorno, sono 4 le corse* che si possono sovrapporre, come da Figura 1. Quattro sedute con la Soluzione FLOW Classic ogni otto ore. PSH Preparaz. Campioni Config. PCR PCR 1 PSH Preparaz. Campioni Config. PCR PCR 2 PSH Preparaz. Campioni Config. PCR PCR 3 PSH Preparaz. Campioni Config. PCR PCR 4 8:00 9:00 10:00 11:00 12:00 13:00 14:00 15:00 16:00 GIORNO LAVORATIVO Fig. 1: Programmazione sedute con FLOW Classic * Ogni seduta dipende dal numero e dalla tipologia di campioni, dalla complessità della configurazione della PCR e dal profilo di PCR. 8
9 Applicazioni e dati di performance 1. Individuazione qualitativa di target multipli La Soluzione FLOW ha svariate applicazioni. Di seguito riportiamo un esempio di PCR multiplex per tre target e un controllo interno. Obiettivo dell esperimento: Rilevazione di tre target diversi e un controllo interno con una PCR quadruplex. Configurazione dell esperimento: È stata progettata un analisi multiplex con tre geni target e un controllo interno. Per convalidare il risultato si è fatto ricorso a controlli negativi e positivi. Materiali utilizzati: Il campione primario è risospeso in tampone S.T.A.R. L estrazione è stata effettuata con il MagNA Pure 96 DNA Viral NA Small Volume Kit, utilizzando il protocollo Pathogen Universal 200. La qpcr è stata effettuata con il kit di controllo RNA Process Control Kit che comprende la master mix LightCycler Multiplex RNA Master. Risultati e dati: Sono stati individuati campioni positivi (curve rosse, cerchi gialli) per tutti i target. I controlli sono segnalati in verde. Per ogni target, sono stati rilevati campioni positivi, il che dimostra che la soluzione FLOW può essere utilizzata in configurazione multiplex senza problemi di interferenza (crosstalk) (Fig. 2). Fig. 2: Schermata del software FLOW per i Target 1, 2 e 3 e per il controllo interno. I grafici mostrano i campioni di geni target (rosso) e i controlli (verde). 9
10 2. Rilevazione quantitativa di un unico target La quantificazione dei target avviene solitamente con una curva standard generata solo a livello della PCR. Per l esperimento seguente, è stata generata una curva estraendo individualmente ogni standard in triplicato. Con tale approccio, viene misurata la deviazione standard per tutto il flusso di lavoro e non solamente a livello della PCR. Obiettivo dell esperimento: Mostrare l efficienza della quantificazione della soluzione FLOW. Materiali impiegati: Campioni negativi: pool di plasma umano negativo K3-EDTA. Campioni positivi: pool di plasma negativo K3-EDTA con aggiunta di plasmidi pcp nelle concentrazioni illustrate in Tabella 1. L estrazione è stata effettuata con MagNA Pure 96 DNA Viral NA Small Volume Kit secondo il protocollo Pathogen Universal 200. La qpcr è stata effettuata con la miscela LightCycler 480 Probes Master. Configurazione dell esperimento: Tutti gli standard sono stati utilizzati in triplicato, con estrazioni separate per ognuno; un pool è stato suddiviso in cinque campioni (Tabella 2). I campioni e gli standard sono stati processati con la soluzione FLOW Classic. Risultati & Conclusione: È stato generato un profilo di curva standard con un margine di errore molto basso (0,0147) e con una grande efficienza (1,988) (Fig. 3, Grafico 1). Le deviazioni standard (media 0,11) sono state molto basse, il che conferma la grande precisione del processo (Tabella 1). I campioni estratti separatamente possono essere quantificati anche a un CQ tardivo grazie all elevata riproducibilità. In sintesi, il FLOW offre un sistema affidabile per quantificare i campioni. Fig. 3: Curva standard creata dal Software FLOW a partire dai dati gel Grafico 1. Grafico 1: Curva standard mostrata dallo strumento Roche per qpcr con una serie di 7 diluizioni con un fattore 10. Target Standard Dev Std Media Min Max Delta pcp-12,00e+04 0,37 33,69 33,36 34,09 0,73 2,00E+05 0,10 30,22 30,14 30,32 0,18 2,00E+06 0,05 26,63 26,58 26,66 0,08 2,00E+07 0,02 23,16 23,14 23,18 0,04 2,00E+08 0,13 19,86 19,77 20,01 0,24 2,00E+09 0,04 16,33 16,30 16,37 0,07 2,00E+10 0,06 13,32 13,25 13,38 0,13 Tabella 1: valori dei Cq per la curva standard mostrata in Fig. 3 e nel Grafico 1 generata con il sistema con FLOW Classic. I valori standard sono riportati in copie/ml. Ogni valore standard è stato misurato in triplicato. Target pcp-1 Campione PSU Repliche Estrazione Repliche Campione 1 28,77 28,77 Campione 2 28,93 29,01 Campione 3 28,57 28,44 Campione 4 28,80 28,86 Campione 5 28,70 28,78 Tabella 2: Campioni quantificati con la curva standard di Figura 3. Le righe sono repliche di pipettamento sul PSU, mentre le colonne sono repliche di campioni su una corsa di FLOW completa. 10
11 3. Riproducibilità delle operazioni (intra-saggio o inter-saggio) Fig. 4: Prima seduta con un controllo positivo in A1 e con il resto negativo. Fig. 5: Seconda seduta con controlli in A1 (pos) e B1 (neg). Fig. 6: Terza seduta con controlli in A1 (pos) e B1 (neg). Fig. 7: Quarta seduta con un controllo positivo in A1 e con il resto negativo. Risultati riproducibili e affidabili sono fondamentali per ogni applicazione nel flusso di lavoro. In questa serie di esperimenti, è stata valutata la riproducibilità dei dati generati dalla Soluzione FLOW. Obiettivo dell esperimento: Verificare la riproducibilità dei dati all interno di una stessa seduta e tra sedute differenti per i risultati positivi e negativi. Configurazione dell esperimento: I seguenti esperimenti sono stati effettuati con il sistema FLOW Flex. Per testare la riproducibilità delle performance del sistema FLOW sono state progettate quattro sedute consecutive sullo stesso strumento. La prima seduta è stata effettuata con 95 campioni negativi e un controllo positivo. Due sedute di verifica sono poi state effettuate con una configurazione a scacchiera con 48 campioni negativi e 48 positivi. Infine, è stata ripetuta la prima seduta. Materiali utilizzati: Campioni negativi: pool di plasma umano negativo K3-EDTA. Campioni positivi: pool di plasma umano negativo con aggiunta di plasmidi pcp. Estrazione effettuata con il MagNA Pure 96 DNA Viral NA Small Volume Kit secondo il Protocollo Universal Pathogen 200µl. La qpcr è stata effettuata con LightCycler 480 Probes Master. Risultati: I campioni negativi sono rimasti negativi (Fig. 4 e Fig. 7). Non sono state rilevate contaminazioni incrociate né nei dati relativi alla stessa corsa (intra-saggio) nè tra le diverse corse (inter-saggio). I campioni positivi hanno mostrato un tasso di riproducibilità molto elevato con, rispettivamente, deviazione standard di 0,20 e 0,18 (Fig. 5 e Fig. 6). La differenza tra una seduta e l altra è stata di 0,04 in media (Tabella 3). ID Piastra PCR N. Dev Std Media Min Max ,18 17,88 17,44 18, ,20 17,92 17,57 18,29 Tutte 96 0,19 17,9 17,44 18,29 Tabella 3: Risultati positivi delle due sedute con configurazione a scacchiera da Fig. 5 e Fig
12 Stampato il 20/09/2016 RD Impegnata per un ambiente migliore, Roche utilizza carta riciclata. Roche Diagnostics SpA Viale G.B. Stucchi, Monza (MB) Materiale destinato esclusivamente ai Professionisti Sanitari.
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