BOLOGNA 2007 ABSTRACTS

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1 CONGRESSO NAZIONALE BOLOGNA 2007 ABSTRACTS

2 ADIUVANTI BIOLOGICI PER STIMOLARE L OSTEOINTEGRAZIONE DEI BIOMATERIALI. STUDIO SPERIMENTALE. ¹Del Piccolo N,¹Dallari D, ²Fini M, ²Nicoli Aldini N, ²Torricelli P, ²Giavaresi G, Sartori M 2, ²Salamanna F,²Giardino R. ¹ VII Divisione di Chirurgia ortopedico-traumatologica, Istituti Ortopedici Rizzoli, Bologna ² Laboratorio di Chirurgia Sperimentale, Istituti Ortopedici Rizzoli, Bologna Obiettivo La superficie di un biomateriale può essere resa maggiormente osteoconduttiva e osteoinduttiva con metodi di natura fisico-chimica, morfologica e biochimica. In questa ricerca è stata valutata a tale scopo l efficacia di adiuvanti biologici quali: gel piastrinico (PRP) e cellule staminali (BMSC). Sono stati eseguiti due studi sperimentali in vivo: nel primo le proprietà osteoinducenti di PRP e BMSC sono state testate mediante impianto nel tessuto sottocutaneo e muscolare; nel secondo le capacità di favorire l osteointegrazione sono state valutate associando tali adiuvanti al rivestimento di idrossiapatite (HA) di cilindri di titanio (Ti) impiantati nell osso trabecolare. Materiali e metodi Lo studio in vivo è stato eseguito nel rispetto del D.L. 116/92 sulla sperimentazione animale impiegando conigli New Zealand maschi, adulti. Gli interventi sono stati condotti in anestesia generale. BMSC e PRP sono state ottenuti rispettivamente da prelievi di midollo osseo autologo e da prelievi di sangue. Nello studio di osteoinduzione è stato inoltre impiegato osso allogenico liofilizzato (FDBA). Gli impianti sono stati eseguiti a livello sottocutaneo ed intramuscolare in 20 animali, secondo lo schema della Tab.1. Tab1. Materiale impiantato al livello sottocutaneo e intramuscolare a 2-8 settimane Tempi sperimentali Materiale 2 settimane - 8 settimane FDBA 2 settimane - 8 settimane FDBA+BMSC 2 settimane - 8 settimane FDBA+PRP 2 settimane - 8 settimane FDBA+BMSC+PRP Per lo studio di osteointegrazione un difetto di 4 mm x10 mm di lunghezza in cui sono stati impiantati i cilindri di Ti-HA è stato creato bilateralmente a livello del condilo femorale in 10 conigli (Tab.2) Tab.2 Materiale impiantato in osso trasecolare di femore distale a 2 settimane Tempi di sperimentazione Materiale 2 settimane Ti-HA 2 settimane Ti-HA + PRP+BMSC 2 settimane Ti-HA +PRP 2 settimane Ti-HA +BMSC Ai tempi sperimentali stabiliti, sui campioni espiantati, sono state eseguite indagini istologiche ed istomorfometriche. Risultati Negli studi di osteoinduzione si è potuto osservare che gli impianti di FDBA erano circondati da tessuto connettivo e da vasi neoformati più evidenti nei casi in cui vi era l associazione FDBA+PRP. A 2 e a 8 settimane dall impianto nel tessuto sottocutaneo e nel tessuto muscolare l associazione FDBA+BMSC+PRP ha evidenziato una maggiore produzione di osso rispetto agli altri materiali impiantati. Per quanto riguarda l osteintegrazione a 15 gg la riparazione dell osso trabecolare appariva più evidente negli impianti HA+BMSC+PRP. Conclusioni L associazione PRP+BMSC sembra in grado di promuovere processi di osteoinduzione e osteoconduzione

3 ANALISI E CONSIDERAZIONI SUI DIFETTI DELLE SUPERFICI IMPLANTARI.NUOVE PROSPETTIVE: IMPIANTO BIMPLANT. Dott. Giuseppe Di Santi Libero Professionista Porto Ercole Roma Dott Massimo De Cesare Napoli Ricercatore Privato,Università Di Napoli Obiettivo Il corretto trattamento delle superfici implantare e prerogativa essenziale per ottenere una valida osteointegrazione. Materiali e metodi Sono stati prodotti volutamente dei difetti superficiali implantari al fine di verificare il danno di superficie attraverso analisi edx e microscopia a scansione. In questo contributo sono stati analizzati i principali difetti che, per una manipolazione errata od una elaborazione scorretta, si possono osservare a carico degli impianti dentali. Sono stati realizzati differenti trattamenti anomali al fine di poter osservare le conseguenze a carico della qualità della superficie, della microstruttura e delle proprietà meccaniche dei suddetti impianti. Si è proceduto alla loro evidenziazione tramite microscopia elettronica a scansione, microscopia di trasmissione e microanalisi per dispersione di energia a Raggi X.EDX: A seguito di tali analisi, vengono proposte alcune precauzioni ed alcune tecniche al fine di evitare eventuali possibili difetti a carico degli impianti dentali. Infine viene relazionato un innovativo trattamento superficiale denominato Microgrip, usato per la superficie del Bimplant. Tale trattamento produce una rugosità di circa 20 Microm atta a favorire la crescita degli osteoblasti ed una superficie omogenea. Conclusione Dall analisi dei danni superficiali indotti artificialmente e stata progettata una nuova superficie impiantare MICROGRIP parte integrante del sistema impiantare BIMPLANT.

4 1 Bioattivazione di Scaffolds di Poliesteri Biodegradabili con Peptidi Segnale: Funzionalizzazione mediante Amminolisi Battista Edmondo, Causa Filippo e Netti Paolo Antonio. Università degli Studi Magna Graecia di Catanzaro. Dipartimento di Medicina Clinica e Sperimentale G. Salvatore - Laboratorio Biomateriali. Centro di Ricerca Interdipartimentale sui Biomateriali (CRIB) Università Federico II di Napoli. Obiettivo Il controllo dell interazione cellula-materiale riveste un ruolo chiave per gli scaffold nell ingegneria dei tessuti. Molti eventi cellulari (riconoscimento, adesione, proliferazione, migrazione), in risposta alla presenza di biomateriali, sono guidati da segnali originati dalla matrice extracellulare e dalla loro disposizione spaziale nell ambiente pericellulare. È ben noto che la sequenza peptidica RGD rappresenta il motivo di riconoscimento cellulare, mediato dalla famiglia delle integrine, più diffuso all interno della matrice extracellulare. Una delle maggiori limitazioni nell impiego dei biomateriali sintetici è dovuta all assenza di specifici segnali di adesione e di guida cellulare. Obiettivo di questo lavoro è il controllo e la messa a punto di metodologie per la funzionalizzazione di matrici di poliesteri biodegradabili con sequenze peptidiche RGD-like. In particolare, lo studio mira all inserzione di ammine difunzionali sulle superfici polimeriche su cui verranno innestati i segnali di adesione. Materiali e Metodi L aggraffaggio delle sequenze RGD-like ai substrati polimerici avviene per inserzione di un linker omobifunzionale mediante amminolisi. L amminolisi è una reazione autolimitante in cui un legame estere viene scisso da una diammina primaria formando un legame ammidico col poliestere e lasciando un gruppo ammino-terminale disponibile per il legame col peptide via dicabonil-disuccinimide. Substrati di policaprolattone (MW 65 kd) sono sottoposti ad amminolisi in una soluzione al 10% (wt) di 1,7-diamminoeptano (MW 130) in isopropanolo alla temperatura di 25 C a tempi diversi. La caratterizzazione della superficie è effettuata mediante micro-raman; misure di DSC sono state eseguite utilizzando il range di temperature con una variazione di 10 C/min. Risultati Le immagini al microscopio ottico hanno mostrato zone a maggiore rugosità in corrispondenza dell inserzione della diammina, come confermato dall analisi Raman. L aumento del tempo di trattamento ha mostrato, inoltre, un conseguente incremento dell ammina legata alla superficie polimerica. L analisi DSC ha evidenziato picchi di fusione non sostanzialmente influenzati dal tempo e dalla temperatura di trattamento. Conclusioni La distribuzione di peptidi immobilizzati su superfici di poliestere può essere controllata attraverso l ottimizzazione del processo di amminolisi. Infatti, variando le condizioni di reazione (tempo, temperatura) si può ottenere una distribuzione controllata dei segnali sulla superficie dello scaffold polimerico. La metodica proposta non influenza considerevolmente le proprietà chimico-fisiche e risulta applicabile a sistemi tridimensionali altamente porosi.

5 BOLOGNA,, MAGGIO 2007 BIOCOMPATIBILITA DI NANOPARTICELLE OSTEOTROPICHE A BASE DI ACIDO poli(d,l-lattico-co-glicolico) E BIFOSFONATO M. Salerno 1, C. Fotia 1, E. Cenni 1, D. Granchi 1, S. Avnet 1, D. Micieli 3, M.G. Sarpietro 3, N. Baldini 1,2 1 Laboratorio di Fisiopatologia degli Impianti Ortopedici, Istituti Ortopedici Rizzoli, Bologna; 2 VII Divisione, Istituti Ortopedici Rizzoli e Università degli Studi di Bologna, Bologna; 3 Dipartimento di Scienze Chimiche, Università degli Studi di Catania, Catania; Obiettivo: sintesi di nanoparticelle (NP) osteotropiche e valutazione della loro emo- e citocompatibilità. Materiali e metodi: l acido poli(d,l-lattico-co-glicolico) (PLGA), è stato coniugato con alendronato, un composto appartenente al gruppo dei bifosfonati, i quali possiedono alta affinità per l idrossiapatite contenuta nella matrice ossea. Il coniugato è stato caratterizzato mediante analisi MALDI TOF e 1 H-NMR. Le NP sono state successivamente ottenute attraverso nanoprecipitazione del coniugato. La dimensione delle NP è stata calcolata mediante Dynamic Light Scattering. L emocompatibilità è stata esaminata in vitro tramite un saggio di emolisi e la valutazione degli effetti sull attivazione piastrinica, sulla fase plasmatica della coagulazione e sul consumo del complemento sia per la via classica che per quella alternativa. La citocompatibilità è stata valutata mediante il saggio del rosso neutro su cellule endoteliali umane isolate dalla vena ombelicale (HUVEC), su cellule stromali mesenchimali umane isolate da midollo osseo (MSC) e su osteoblasti umani isolati da osso trabecolare (HOB). E stato infine determinato l effetto delle NP sull attività di fosfatasi alcalina delle MSC. Risultati: la struttura chimica del coniugato è stata confermata dall analisi 1 H-NMR e MALDI TOF, che ha dimostrato una resa di coniugazione pari al 30-35%. Il diametro medio delle NP era di 198,7 nm, con un indice di polidispersione di 0,348. Le prove di emocompatibilità in vitro hanno dimostrato l assenza di emolisi e di attivazione piastrinica. E stata dimostrata una significativa riduzione dell attività protrombinica dopo incubazione con 56 μg/ml di NP e un significativo incremento con le diluzioni da 5,6 μg/ml a 0,56 ng/ml rispetto al controllo negativo (plasma incubato con PBS). I valori di attività protrombinica erano comunque sempre compresi nell ambito dei valori normali. Non sono state rilevate variazioni significative dell APTT. Anche il consumo di complemento attraverso le due vie non è risultato significativo. Infine, non sono stati evidenziati effetti citotossici sulle cellule umane: la vitalità delle HUVEC, delle MSC e degli HOB dopo incubazione con le NP è risultata superiore all 80%. Non sono state riscontrate differenze significative nell attività di fosfatasi alcalina delle MSC incubate con le NP e quelle incubate con il solo terreno. Conclusioni: le prove di biocompatibilità in vitro hanno dimostrato una variazione significativa dell attività protrombinica, che tuttavia si è sempre mantenuta nell ambito dei valori normali. Le NP non hanno indotto emolisi, attivazione piastrinica o consumo del complemento, e non hanno esercitato effetti citotossici sulle cellule endoteliali o sugli osteoblasti. In conclusione, le note proprietà di biocompatibilità del PLGA non sono state modificate dal legame con l alendronato e dalla realizzazione di NP derivate. Finanziato dalla Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro.

6 BOLOGNA,, MAGGIO 2007 BIOCOMPATIBILITA IN VITRO DI CEMENTI ENDODONTICI INNOVATIVI A BASE SILICATICA F. Perut 1, M.G.Gandolfi 2,, S. Pagani 1, G. Ciapetti 1, S. Marchionni 3, R. Mongiorgi 3, C. Prati 3, N. Baldini 1 1 Laboratorio di Fisiopatologia degli Impianti Ortopedici, Istituti Ortopedici Rizzoli, Bologna. 2 Centro di Biomineralogia, Cristallografia e Biomateriali, Università di Bologna. 3 Dip. di Scienze Odontostomatologiche, Università di Bologna. Obiettivo: scopo di questo lavoro è stato verificare la compatibilità cellulare in vitro di cementi endodontici innovativi a base silicatica. Materiale e metodo: quattro diverse formulazioni di cementi endodontici (TC, TC1%, TCf 1% e TCf) sono state preparate utilizzando cemento Portland e cloruro di calcio come accelerante. Nelle composizioni TC1% e TCf 1% è stato inserito un fillosilicato come plasticizzante. TC e TC1% sono stati preparati con H 2 O, mentre TCf e TCf1% sono stati preparati con un agente fluidificante (polimero di lattice). Due cementi canalari commerciali, Proroot MTA ed AH plus, sono stati utilizzati come riferimento. I materiali sono stati preparati, stratificati su vetro e fatti polimerizzare per 5 ore a 37 C in camera umida; sono stati quindi trattati con una soluzione di antibiotico/antimicotico in H 2 O per 2 ore e lavati in PBS. Il precondizionamento dei cementi e la preparazione degli estratti sono stati eseguiti incubando i materiali polimerizzati in DMEM al 10% FCS per 24 h a 37 C. La compatibilità cellulare è stata valutata utilizzando la linea cellulare similosteoblastica Saos-2, analizzandone la crescita (Alamar test) e la morfologia cellulare (SEM) dopo 72 ore di coltura sui cementi. Le cellule Saos-2 seminate su plastica per colture cellulari (TCPS) sono state messe a diretto contatto con gli estratti ottenuti dai cementi e, dopo 72 h, ne è stata valutata la vitalità. Risultati: l analisi al SEM ha evidenziato differenze morfologiche della superficie dei cementi sperimentali. Nessuna tossicità acuta è stata evidenziata per i cementi oggetto di studio. Le cellule Saos-2 hanno aderito e proliferato su tutti i cementi sperimentali solidi, anche se in misura minore rispetto al cemento di riferimento MTA e al controllo su plastica. AH plus non ha consentito la crescita cellulare. L analisi al SEM ha confermato questi dati, evidenziando cellule con morfologia similosteoblastica sui cementi a base silicatica e su MTA; rare cellule sono state osservate su AH plus. La vitalità delle cellule Saos-2 a contatto con gli estratti di TC, TC 1% e MTA è paragonabile al controllo su plastica. Gli estratti di TCf e TCf 1% riducono la vitalità delle cellule Saos-2 in modo significativo (p<0.05) rispetto al controllo su plastica ed agli estratti di MTA, TC e TC 1%. Tuttavia la successiva adesione e proliferazione delle cellule Saos- 2 sui cementi solidi TCf e TCf 1% hanno dimostrato una riduzione di questo effetto tossico nel tempo. L estratto di AH plus è risultato il più tossico, inducendo una mortalità cellulare molto alta, con valori significativamente diversi rispetto a tutti gli altri materiali (p=0.002). Conclusioni: i cementi endodontici sperimentali hanno dimostrato la capacità di supportare la crescita di cellule simil-osteoblastiche. Tali cementi possono quindi essere impiegati in endodonzia ortograda e retrograda.

7 6 BioDynamic Characterization of Biomaterial Viscoelastic Properties Werner Conrads,Jing Lu, Sandy Williams ElectroForce Systems Group, Bose Corporation, Eden Prairie, MN, USA. Statement of Purpose: The objective of this work was to employ the Dynamic Mechanical Analysis (DMA) software with the ElectroForce BioDynamic testing platform to evaluate the mechanical properties of hydrogels. The Wintest DMA software has been developed to determine the dynamic viscoelastic properties of biomaterials or tissues as a function of wide range of test conditions such as frequency, strain and temperature. The BioDynamic testing platform allows for continuous characterization and stimulation in a fully integrated and instrumented configuration by providing material characterization (viscoelastic properties, strength, creep and stress relaxation) within a physiological environment (sterile, nutrient flow, pressure loading, ph, dissolved oxygen, and temperature). Methods: The BioDynamic instrument was used along with DMA software to test the mechanical properties of hydrogels to demonstrate its ability to measure the dynamic mechanical properties of tissue and biomaterials (such as stress-strain relationship, stiffness, modulus, hysteresis, etc. with respect to loading frequency). The dynamic mechanical properties of polyvinyl alcohol hydrogels (Cambridge Polymer Group, Boston, MA) were evaluated with our unique computer-controlled moving magnet linear motor that provides load, displacement, and strain or pressure profiles (Figures 1-2). The hydrogel samples were 10 mm in diameter and 3-5 mm in height, and testing was performed in compression with a 5 mm displacement transducer and a 50lb force transducer. Figure 1. Biodynamic system setup for hydrogel DMA tests. demonstrate preconditioning at a rate 0.2Hz, and then it repeats the sample procedure at other frequencies (from 0.2Hz to 10Hz). The user-defined parameters allow the study of the samples dynamic viscoelastic properties as a function of a wide range of testing conditions. Results / Discussion: The relationship between the complex modulus and the loading frequency as well as the tan delta and the loading frequency are shown in Figure 3, where complex modulus is the measure of dynamic mechanical properties of a material, taking into account energy dissipated as heat during the deformation and recovery, and tan delta is the tangent of phase between the reference channel and feedback. The plotted data shows that the complex modulus value increases as loading frequency increases, while tan delta value decreases as loading frequency increases. Figure 4 shows four cycles of the sinusoidal compression waveform at the rate of 1Hz. Figure 3. Hydrogel modulus and tan delta as a function of frequency at 5% strain. Figure 2. Sterile hydrogel sample with porous perfusion platens. The DMA software applies a user-defined 0.5N compression load to the hydrogel sample as a contact load, and then it applies 5% cyclic sinusoidal strain on the specimen for automatic calculated cycles enough to Figure 4. Dynamic material properties of a polyvinyl alcohol hydrogel. Conclusions: This study showed that the BioDynamic system along with DMA software is a very powerful tool to study the dynamic mechanical properties of biomaterials in a sterile biological environment.

8 BOLOGNA,, MAGGIO 2007 Ca SPECIES AT THE SURFACE OF NANOSIZED HYDROXYAPATITE. A COMPUTATIONAL AB INITIO AND A MICROCALORIMETRIC/IR SPECTROSCOPIC STUDY. M. Corno 1, P. Ugliengo 1, L. Bertinetti 1, G. Martra 1, C. Busco 2 and V. Bolis 2. 1 Dip. di Chimica IFM, Università di Torino, via P. Giuria 7, Torino. Italy. 2 Dip.o DiSCAFF, Università del Piemonte Orientale, via G. Bovio 6, Novara. Italy. The hydroxyapatite mineral [HA, Ca 10 (PO 4 ) 6 (OH) 2, family of apatites is a very versatile material, widely applied in the field of biomedical applications, because it constitutes the main component of the mineral phase in mammalian bones and teeth. Recently, several experimental and computational studies have been devoted to investigating the properties of apatite and apatite-like materials in order to better understand the molecular details of the processes occurring at the interface between such inorganic materials and living matter. The present work aims at understanding physical and chemical properties of the (001) and (010) hydroxyapatite surfaces, by means of a combined experimental and theoretical study dealing with the adsorption of probe molecules, among which CO. This molecule is generally employed to get useful information on the Lewis acidic properties (i.e., the ability to accept pairs of electrons) of coordinatively unsaturated (cus) metal cations exposed at the surface of inorganic materials, such as Ca 2+ species of interest in the present work. Periodic ab initio B3LYP calculations using CRYSTAL06 code have been run to fully optimise the (001) and (010) bare surfaces for both hexagonal and monoclinic HA phases. On the geometrically relaxed surfaces the adsorption of CO has been simulated, from low to high coverage. Energies of adsorption and the vibrational features of CO have been computed both as a function of different surface adsorption sites and of coverage. In parallel, the adsorption of CO on a nanosized hydroxyapatite specimen has been studied by IR spectroscopy (at 77 K) in order to investigate the surface structure of the various kind of Ca species potentially active towards biomolecules. The energy of the CO-Ca sites interaction, as well as that of the CO-hydrated surface layer interaction, has been measured (at RT) by microcalorimetry. The main conclusions from the simulations are that CO adsorbs on the exposed cus Ca 2+ cations which are characterized by rather strong local electric fields. It is worth of noting that the (010) surface is more active towards CO than (001). Both computed and measured CO stretching frequencies confirm that the cus Ca 2+ cations behave as Lewis acidic sites, as witnessed by the presence of bathochromic shifts. In conclusion, the combined use of experimental and computational methods has proved to be useful to investigate such a complex system as an hydroxyapatite surface in interaction with molecules. Work is in progress in order to simulate and measure the interaction of the apatite surfaces with small (bio)molecules in order to better understand at nanometric level the chemical properties of these kind of biomaterials, in particular with respect to their biomedical applications.

9 7 CARATTERIZZAZIONE DI PRECURSORI OSTEOGENICI AD ADERENZA TARDIVA IN COLTURE DI MIDOLLO OSSEO E. Leonardi, D. Granchi, V. Devescovi, G. Ciapetti, N. Baldini. Laboratorio di Fisiopatologia degli Impianti Ortopedici, Istituti Ortopedici Rizzoli, Bologna. Obiettivo: analizzare il potenziale osteogenico di cellule mononucleate non aderenti (NA) che vengono solitamente scartate nella coltura di cellule stromali mesenchimali (MSC) derivate da midollo osseo. In pazienti di diverse età, due sottopopolazioni di NA sono state raccolte e caratterizzate per la loro capacità di differenziarsi in osteoblasti. Materiali e metodi: il midollo è stato raccolto dal canale femorale di 6 pazienti durante l intervento di artroprotesi d anca. Dopo 4 gg di coltura, le cellule mononucleate non aderenti (NA0) sono state raccolte e riseminate; analogamente, dopo altri 4 gg, sono state raccolte anche le cellule non aderenti della coltura NA0 (NA1). NA0 e NA1 sono state coltivate in terreno osteogenico e caratterizzate per l espressione di markers del differenziamento osteoblastico. I dati sono stati confrontati con quelli ottenuti nelle cellule aderenti precoci (AD); l espressione di antigeni di membrana caratteristici delle MSC (CD44, CD105, CD166, CD90) è stata determinata in citometria a flusso, mentre l attività della fosfatasi alcalina (ALP) è stata valutata con tecniche biochimiche e immunocitochimiche sulle Colony Forming Units (CFU). La mineralizzazione è stata verificata mediante quantificazione del calcio e colorazione di Von Kossa per le aree di deposizione di matrice; l espressione di geni associati al differenziamento osseo è stata quantificata mediante RealTime PCR. Risultati: la percentuale di cellule NA varia da 1% a 51% e non correla con l età dei pazienti. Dopo il trasferimento in una nuova fiasca di coltura, il 37-84% delle NA0 e il 17-87% delle NA1 acquisiscono la capacità di aderire alla plastica, e la confluenza è raggiunta mediamente in un tempo paragonabile a quello delle AD (rispettivamente14.8±3 e 15.0±3 giorni). Al quarto passaggio, l espressione degli antigeni di membrana delle MSC è maggiore dell 80% in tutte le popolazioni AD, NA0 e NA1. In AD, c è una correlazione diretta tra età del paziente ed espressione di CD44 (R=0.90, P=0.012), CD105 (R=0.90, P=0.012) e CD166 (R=0.83, P=0.04), mentre nelle NA1, la correlazione è stata osservata solo per CD105 (R=0.99, P<0.0001). Le dimensioni e il numero delle CFU variano sensibilmente tra gli individui, e l espressione di ALP diminuisce progressivamente da AD a NA0 a NA1. L espressione di ALP nelle NA è risultata significativamente ridotta, sia a livello trascrizionale (NA0 vs AD p=0.05; NA1 vs AD p=0.01) che a livello proteico (NA0 vs AD p=0.05). In tutte le popolazioni, la deposizione di calcio raddoppia dopo 2 settimane in terreno mineralizzante ed è simile in AD e NA. L espressione dei geni associati al differenziamento osseo è inferiore nelle NA rispetto alle AD: nessuna differenza significativa è stata osservata per i geni precoci Runx2 e Osterix e per il collagene di tipo 1, mentre l espressione di osteocalcina è quasi sempre inferiore al limite di sensibilità del metodo. Conclusioni: le cellule mononucleate del midollo osseo contengono precursori osteogenici ad aderenza tardiva che mostrano un fenotipo più indifferenziato rispetto alle cellule che aderiscono precocemente. Il numero dei precursori osteogenici ad aderenza tardiva è indipendente dall età del paziente, ed è ipotizzabile che essi abbiano un ruolo nella rigenerazione e nel mantenimento della omeostasi del tessuto osseo.

10 BOLOGNA,, MAGGIO 2007 CARATTERIZZAZIONE INFRAROSSA E RAMAN DI OLIGOPEPTIDI AUTOASSEMBLANTI M. Di Foggia, C. Fagnano, P. Taddei, A. Torreggiani (1), M. Dettin (2), A. Tinti. Dipartimento di Biochimica "G. Moruzzi", Università di Bologna, via Belmeloro 8/2, Bologna (Italy). (1) ISOF, Consiglio Nazionale delle Ricerche, via P. Gobetti 101, Bologna (Italy). (2) Dipartimento di Processi Chimici dell'ingegneria, Università di Padova, via Marzolo 9, Padova (Italy). Obiettivo: caratterizzazione della struttura secondaria di nuovi oligopeptidi autoassemblanti, derivanti da EAK-16 [1] e caratterizzati dall alternanza di amminoacidi apolari (alanina) e ionici (lisina, ornitina, acido glutammico, acido aspartico, acido amminobutirrico). Gli oligopeptidi analizzati erano costituiti da 16 amminoacidi, con eventuale aggiunta di una sequenza RGD (arginina-glicina-acido aspartico), per favorire la rigenerazione ossea a contatto con biomateriali di supporto. Materiali e metodi: i peptidi sono stati sintetizzati in fase solida utilizzando un apparecchio automatico per la sintesi dei peptidi (Applied Biosystem Model 431 ) e purificati in colonna semipreparativa Delta Pak C 18. Gli spettri Raman sono stati ottenuti con uno spettrometro FT-Raman Bruker FRA 106 (risoluzione 4 cm -1 ) mentre quelli IR sono stati ottenuti utilizzando uno spettrometro Nicolet 5700 (risoluzione 4 cm -1 ). La struttura secondaria degli oligopeptidi è stata determinata tramite fitting delle bande ammide I sia IR che Raman. Risultati: I risultati ottenuti dal fitting in IR e in Raman per ciascun peptide erano molto simili. Per quanto riguarda i peptidi appena sintetizzati, quelli contenenti solo 16 residui amminoacidici ionici/non polari hanno mostrato una prevalente struttura a foglietto beta indipendentemente dalla lunghezza e dall ingombro sterico della catena R dell amminoacido carico o di quello apolare. Infatti le bande tipiche di questa struttura secondaria sono state osservate sia in Raman a cm -1 che in infrarosso a cm -1 e a cm -1. I peptidi contenenti la sequenza RGD avevano invece una struttura secondaria prevalente di tipo alfa-elica o mista, caratterizzata da una banda Raman a 1659 cm -1 e componenti IR a 1663 e 1640 cm -1. Dopo trattamento per 6 ore in soluzione di NaCl e tampone fosfato e liofilizzazione, i peptidi che avevano una struttura a foglietto beta non hanno mostrato variazioni significative di struttura secondaria mentre si è osservato uno spostamento significativo delle bande Raman e IR dei peptidi contenenti la sequenza RGD. Infatti anche in questo caso la struttura prevalente diventa di tipo betafoglietto. Conclusioni: anche i due peptidi contenenti la sequenza RGD e che subito dopo la sintesi non presentavano, o presentavano solo in parte, struttura a foglietto beta, dopo il trattamento in soluzione di NaCl e tampone fosfato assumono prevalente struttura beta. La spettroscopia vibrazionale si è confermata una tecnica valida per valutare le variazioni conformazionali dei peptidi. [1] Zhang S., Holmes T., Lockshin C., Rich A. PNAS 90, 1993, 3334

11 8 Caratterizzazione meccanica e microstrutturale di componenti biomediche in lega Ti-6Al-4V prodotte per electron beam sintering L. Facchini, E. Magalini, P. Robotti, A. Molinari. Dipartimento di Ingegneria dei Materiali e delle Tecnologie Industriali, Università di Trento, via Mesiano 77, Trento, Italia. Eurocoating s.p.a., via al Dos de la Roda 60, Ciré di Pergine, Italia. Obiettivo: L electron beam sintering è una tecnica di rapid manufacturing che permette di produrre componenti metallici a geometria complessa con annessa struttura superficiale porosa direttamente da modelli 3D, senza l utilizzo di spacers, attraverso la deposizione di strati di polvere e la loro fusione localizzata. Tale tecnologia permette di ottenere manufatti funzionali complessi in breve tempo. L applicazione di questa tecnologia alla produzione di componenti protesici ortopedici consente l ottenimento di pezzi unici, con poche limitazioni geometriche e con pori di dimensioni e distribuzione progettate nell ottica dell osteointegrazione. Il presente lavoro consiste nella caratterizzazione preliminare meccanica, microstrutturale e composizionale di provini prodotti in lega Ti-6Al-4V biocompatibile a partire da polvere. Materiali e metodi: La polvere di lega Ti-6Al-4V utilizzata è una polvere commerciale specifica: la sua morfologia appare sferica, mentre la dimensione dichiarata delle sue particelle è compresa tra 45 μm e 100 μm. Sui provini prodotti a partire da tale polvere sono state effettuate prove di trazione, fatica e microdurezza; i manufatti sono altresì stati caratterizzati attraverso misure di densità, microscopia ottica, ESEM e diffrazione ai raggi X. Risultati: La caratterizzazione meccanica dei componenti prodotti attraverso electron beam sintering ha fornito i dati sotto esposti. La densità relativa dei provini prodotti è risultata essere superiore al 99%. Le prove di trazione, effettuate secondo le condizioni della normativa ASTM E8M, hanno indicato un modulo elastico di 111±4 GPa, un carico di snervamento di 855±25 MPa, un carico di rottura di 935±25 ed un allungamento a rottura del 13,3±2,1%. La microdurezza misurata, pari a 355±5 HV 0.05, è in linea con tali proprietà meccaniche. Il limite di fatica ottenuto mediante staircase method, inoltre, è pari a 400±77 MPa. L osservazione della sezione dei provini meccanici dopo lappatura e attacco acido con Kroll ha evidenziato una microstruttura caratteristica di titanio α+β. La presenza delle due fasi (hcp e bcc) è stata confermata dalla diffrattometria a raggi X. Conclusioni: Le prove condotte su manufatti in lega Ti-6Al-4V ottenuti attraverso electron beam sintering hanno fornito valori di proprietà meccaniche incoraggianti; questi possono essere legati ad una microstruttura tipica per la lega utilizzata e alla piena densità dei componenti. Lo spettro di informazioni ottenuto verrà completato con prove di corrosione. Sono inoltre previsti, in caso di successo nella qualificazione chimico-fisica dei manufatti così ottenuti, test in vitro ed in vivo.

12 BOLOGNA,, MAGGIO CARATTERIZZAZIONE MOLECOLARE DELLE STRUTTURE COINVOLTE NELLA RIGENERAZIONE DEL LEGAMENTO CROCIATO ANTERIORE. Carola Cavallo*, Livia Roseti*, Giovanna Desando*, Roberto Buda #, Sandro Giannini #, Andrea Facchini*, Brunella Grigolo*. * Laboratorio di Immunologia e Genetica, Bologna, Istituti Ortopedici Rizzoli. # VI Divisione di Ortopedia, Istituti Ortopedici Rizzoli. Dipartimento di Medicina Interna e Gastroenterologia, Università degli Studi di Bologna. Il legamento crociato anteriore (LCA) è responsabile della stabilità del ginocchio evitando il movimento di traslazione anteriore della tibia sul femore. La lesione dell LCA si riscontra con frequenza nel soggetto sportivo ed è dovuta a movimenti di torsione sull asse verticale con dislocazione anteriore. La lesione che è quasi sempre completa, può talvolta coinvolgere la spina tibiale intercondiloidea. Il trattamento della lesione all LCA è solitamente un trattamento chirurgico dal momento che i risultati che si ottengono con metodi non invasivi sono poco rilevanti sia a causa dello scarso potere autorigenerativo del tessuto stesso che dell ambiente intra-articolare caratterizzato dalla mancanza di supporto ematico e da una serie di processi infiammatori successivi all evento traumatico. Numerosi trattamenti chirurgici sono stati quindi effettuati sia nell animale che nell uomo allo scopo di ricostruire l LCA con varie tecniche quali l utilizzo di trapianto allogenico o autologo, i quali presentano comunque rischi e benefici riguardo la resistenza, la fissazione, la biocompatibilità e morbilità dovuta all atto chirurgico. Finora uno dei metodi più utilizzati per la ricostruzione è stato quello del trapianto con il tendine rotuleo (TR) o il semitendinoso e gracile (ST), con una serie di vantaggi e svantaggi e scarse differenze riguardo i risultati clinici a distanza. Molti studi hanno riportato come entrambi i tendini posti nell ambiente sinoviale e soggetti a forze fisiche siano progressivamente trasformati in una struttura simile a quella dell LCA, processo chiamato legamentizzazione. L analisi istologica dei vari tessuti utilizzati per il trapianto non ha mostrato delle grandi differenze, si tratta di tessuti di tipo connettivo nei quali le cellule sono circondate da una matrice ricca di collagene e povera in proteoglicani. L ingegneria dei tessuti ha aperto nuove frontiere offrendo la possibilità di trattare lesioni all LCA mediante utilizzo di nuovi materiali sintetici da soli o in combinazione con cellule. Una approfondita conoscenza biomolecolare delle strutture utilizzate al momento attuale per il trapianto dell LCA potrebbe rivelarsi molto utile nella scelta della componente cellulare più idonea. Scopo dello studio è stato quello di valutare mediante Real-Time PCR l espressione di alcune proteine della matrice in cellule umane ottenute dall LCA, dal TR, dall ST, e dall LCA ricostruito con il TR (rlca-tr) o l ST (rlca- ST). Un analisi immunoistochimica ha permesso di evidenziare la presenza di alcune componenti anche a livello proteico. Come evidenziato sia il TR che l ST esprimono gli stessi geni a livello molecolare con l unica eccezione del collagene di tipo X, che è rilevabile solo nell ST e nell LCA ricostruito con quest ultimo. In entrambi l LCA-TR e l LCA-ST si evidenzia una aumentata espressione di catepsina B e metalloproteinasi, indice di un processo di rimodellamento del tessuto. In generale comunque l ST presenta una più elevata espressione genica di tutte le molecole analizzate rispetto al TR, e questa condizione è evidenziabile anche nell LCA ricostruito con l ST. Ulteriori studi sono ovviamente necessari per meglio caratterizzare la componente cellulare dei due tendini al fine di poterne ipotizzare l uso in combinazione con strutture biocompatibili in grado di consentirne la vitalità e la proliferazione. Fine ultimo è la possibilità di ricreare un tessuto dotato delle caratteristiche bio-meccaniche tipiche del legamento originale.

13 1 ADSORPTION-INDUCED CONFORMATIONAL CHANGES OF SERUM ALBUMINS ONTO BIOMIMETIC HYDROXYAPATITE NANOCRYSTALS Piera Sabatino*, Luigi Casella, Elisabetta Foresti*, Michele Iafisco*, Enrico Monzani, Barbara Palazzo, Lia Rimondini^, Norberto Roveri*. *Dipartimento di Chimica G. Ciamician, Alma Mater Studiorum, via Selmi 2, I Bologna. Dipartimento di Chimica Generale, via Taramelli 12, Università di Pavia,I Pavia. ^Dipartimento di Scienze Mediche,via Solaroli 17,Università del Piemonte Orientale,I Novara. Aim of this study is to quantify conformational changes induced on serum albumins upon adsorption and after desorption from biomimetic hydroxyapatite nanocrystals surface, in order to define blood proteins role in mediation of biomaterial/bone tissue interactions. Synthetic biomimetic hydroxyapatite nanocrystals emulate the properties of natural HA, such as non-toxicity and lack of inflammatory and immunitary response[1,2]. FTIR spectroscopy, X-Ray diffraction, BET surface area, water contact angle, far UV and near UV CD spectroscopy have been employed both to characterize morphology and structure of apatitic substrates and to investigate structural changes in bovine and human serum albumin induced by adsorption. Experimental investigations have been carried out on two nanosized HA samples, a plateshaped (HAps) and needle-shaped (HAns) one (Fig.1) provided with different physicochemical properties. Both of them have been interacted with bovine (BSA) and human (HSA) serum albumin, showing different affinity between the two morphologies and towards BSA and HSA (Fig 2). Γ (mg/m 2 ) 1,8 1,7 1,6 1,5 1,4 1,3 1,2 1,1 1,0 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 HSA 0,4 BSA 0,3 0,2 0,1 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 C (mg/ml) Fig 1 HAns nanocrystals BSA Fig 2 Adsorption isotherm on HAps Fig 3 FTIR and Gaussian curve fitting FTIR spectroscopy has been used to quantify conformational changes in both BSA and HSA adsorbed onto the HA nanocrystals, showing, after spectra deconvolution, a different protein unfolding according to the relative surface properties (Fig. 3). CD spectroscopy has been applied to investigate structural changes in the protein solutions eluted from the solid matrix, showing the lack of regaining native structure even after desorption especially for low protein concentrations. Apparently, HSA exhibits a greater aggregation ability in the eluted solutions with respect to BSA in vitro. Our results show that between the biomaterial surface and the bone tissue a serum albumin layer, irreversibly modified in vitro, must be taken into account when considering osteoconducibility, osteoinductivity and osteocompatibility of bone substitute implants because cells initially respond to the adsorbed protein layer rather than the surface itself. [1] N. Roveri and B. Palazzo Hydroxyapatite nanocrystals as bone substitutes Nanotechnologies for the Lifesciences Vol. 8 Nanomaterials and Technologies for Tissue Engineering Kumar (ed.) Wiley 2006 [2] B. Palazzo, M. Iafisco, M. Laforgia, N. Margiotta, G. Natile, C. L. Bianchi, D. Walsh, S. Mann, N. Roveri Biomimetic hydroxyapatite nanocrystals as bone substitutes with anti-tumour drugs delivery function in press on Advanced Functional Material

14 2 COLTURA DI OSTEOBLASTI UMANI SAOS-2 SU SUPERFICIE DI TITANIO SABBIATO E DEFORMATO PLASTICAMENTE Lorenzo Fassina (1), Enrica Saino (2), Livia Visai (2), Maria Gabriella Cusella De Angelis (3), Francesco Benazzo (4), Giovanni Magenes (1). (1) Dip. Informatica e Sistemistica, (2) Dip. Biochimica, (3) Dip. Medicina Sperimentale, (4) Dip. SMEC dell Università di Pavia. Obiettivo: Le superfici di titanio sabbiato sono state studiate al fine di migliorare l osteointegrazione in vivo degli impianti dentali e delle protesi ortopediche. Per ottenere una migliore osteointegrazione, la superficie sabbiata è stata sottoposta a deformazione plastica mediante punzonatura. Lo scopo di tale procedura è quello di creare sulla superficie del biomateriale un microambiente atto a favorire la proliferazione cellulare e la sintesi di matrice extracellulare ossea. Materiali e metodi: Sono stati utilizzati dischi in lega di titanio Ti6Al4V con diametro 14 mm e altezza 4 mm. La sabbiatura del titanio è stata ottenuta mediante polvere di Al 2 O 3 (granulometria 16 mesh). La rugosità Rz del titanio sabbiato è pari a 26 μm. La successiva punzonatura ha permesso di ottenere crateri tronco-conici equidistanziati con le seguenti dimensioni: diametro maggiore pari a 500 μm, diametro minore pari a 300 μm e profondità pari a 170 μm. Gli osteoblasti umani SAOS-2 di linea sono stati coltivati in terreno di McCoy 5A (con 15% di siero fetale bovino, 2% di sodio piruvato, 1% di antibiotici, 10-8 M desametasone, 10 mm β-glicerofosfato), seminati sui dischi di titanio (4x10 5 cellule per ogni disco) e quindi coltivati per 22 giorni a 37 C e 5% CO 2. Al termine della coltura sono stati valutati: la morfologia superficiale del materiale mediante SEM, il contenuto di DNA, la quantità totale di matrice proteica sintetizzata mediante estrazione con sample buffer specifico ed, infine, la distribuzione del collagene di tipo I mediante immunofluorescenza. Risultati: La modifica plastica della superficie del biomateriale ha provocato, rispetto alla sola sabbiatura, un raddoppio della proliferazione (in media 1.5x10 6 vs. 3.1x10 6 cellule per disco) ed un aumento ancora maggiore della sintesi di matrice proteica (in media 870 vs μg/disco). Le osservazioni al SEM ed al microscopio ad immunofluorescenza hanno dimostrato che la deformazione plastica provoca la formazione di estesi cluster di cellule e matrice ossea, cluster che tendono a ricoprire la superficie disponibile. Al contrario, la sola sabbiatura non è in grado di supportare una simile estensione della coltura. Conclusioni: La punzonatura del titanio sabbiato crea un microambiente atto a favorire la proliferazione cellulare e la sintesi di matrice extracellulare. Partendo da cellule autologhe di un paziente, il titanio punzonato, coltivato in vitro e ricoperto di cellule e matrice ossea, potrebbe essere successivamente utilizzato in vivo al fine di ottenere una migliore osteointegrazione dell impianto.

15 DESIGN di MATRICI BIOCOMPATIBILI TRIDIMENSIONALI PER APPLICAZIONI NEL CAMPO DELL INGEGNERIA TISSUTALE CARDIACA E. Traversa, B. Mecheri, C. Mandoli, S. Soliman, A. Rinaldi, S. Licoccia, G. Forte*, F. Pagliari*, P. Di Nardo* Dip. di Scienze e Tecnologie Chimiche, Università di Roma Tor Vergata, Roma *Dip. di Medicina Interna, Università di Roma Tor Vergata, Roma Alcune patologie cardiache possono attualmente essere trattate solo mediante trapianto cardiaco. Tuttavia, la disponibilità di organi donati è del tutto insufficiente rispetto alla richiesta. Una possibile alternativa per riparare i danni provocati dall infarto al miocardio è costituita dalla medicina rigenerativa, mediante ricostruzione di tessuti. Per questo scopo, la progettazione e realizzazione di materiali biocompatibili e bioriassorbibili come sostegno per la crescita dei tessuti rivestono un ruolo di primaria importanza. Nel ingegneria tissutale è fondamentale anche la scelta delle cellule da far proliferare e il loro interazione con i materiali di sostegno. L uso delle cellule staminali è estremamente promettente per questi scopi. Lo scopo di questo lavoro consiste nella progettazione e fabbricazione controllata con metodi a basso costo di scaffold polimerici tridimensionali che promuovano la rigenerazione tissutale cardiaca mediante l attecchimento, la crescita e la differenziazione di cellule staminali. Le matrici polimeriche selezionate per questo obiettivo sono essenzialmente poliesteri biocompatibili, quali acido polilattico, acido poliglicolico, policaprolattone e loro miscele. Il design e la costruzione di scaffold tridimensionali sono stati condotti mediante l uso di tecniche di fabbricazione che consentano la messa a punto di materiali con composizione e morfologia controllate, nonché con proprietà meccaniche che ne permettano l integrazione e l impianto nel corpo umano. In particolare, le metodologie di fabbricazione utilizzate in questo lavoro comprendono tecniche di casting e di produzione di fibre polimeriche con la tecnica di elettrospinning. Il controllo sul grado di porosità del sistema e sulle sue proprietà meccaniche è stato ottenuto sia con la scelta di opportuni agenti porogeni, diversificati in base alla loro composizione chimica e concentrazione, forma e dimensioni, sia mediante l induzione di separazioni di fase all interno della matrice, controllando i parametri chimico-fisici che governano il processo. La caratterizzazione morfologica delle matrici polimeriche, condotta mediante microscopia elettronica a scansione, ha evidenziato l ottenimento di matrici a porosità controllata, in cui la forma, le dimensioni e l interconnettività dei pori sono regolabili in base ai parametri del processo di fabbricazione. Tali parametri di processo consentono inoltre di regolare e controllare anche le proprietà meccaniche delle matrici come è stato evidenziato dalla caratterizzazione micromeccanica, effettuata mediante nanoindentazione. La biocompatibilità e la bioattività delle matrici è stata valutata tramite l impianto di cellule staminali adulte (mesenchymal stem cell, MSC e resident cardiac stem cell, CSC). L adesione, la proliferazione e la differenziazione delle cellule è stata studiata mediante test MTT, immunofluorescenza e analisi RT-PCR. L insieme dei risultati ottenuti ha mostrato che è possibile ottenere matrici biopolimeriche aventi struttura e proprietà modulabili in base al processo di fabbricazione. Tali matrici risultano essere citocompatibili e funzionano inoltre come templato per la crescita e la proliferazione cellulare diretta alla riparazione di tessuti cardiaci.

16 CONDOTTI RIASSORBIBILI IN ACIDO POLILATTICO CONTENENTI FATTORI CHE PROMUOVONO LA RIGENERAZIONE OSSEA Nicoli Aldini N. 1, Sartori M. 1, Fini M. 1, Giavaresi G. 1, Veronesi F 1., Torricelli P 1., Tschon M. 1, Tanzi M.C. 2, Farè S. 2,Draghi L. 2, Giardino R 1. 1 Laboratorio di Chirurgia Sperimentale, Istituti Ortopedici Rizzoli, Bologna 2 Laboratorio di Biomateriali, Dipartimento di Bioingegneria, Politecnico di Milano Obiettivo Gli ampi difetti ossei diafisari rappresentano ancora un problema clinico in ortopedia e traumatologia: la maggior parte delle metodiche attuali prevede il trasferimento di osso autologo o allogenico, innesti ossei vascolarizzati e tecniche di distrazione osteogenetica. Nessuno di questi procedimenti è tuttavia privo di inconvenienti e limitazioni. In precedenti studi sperimentali è stato dimostrato che una camera tubulare riassorbibile di acido poli-dl-lattico consente la neoformazione di tessuto osseo in difetti critici diafisari e che le cellule staminali del midollo osseo (BMSC) e la matrice ossea demineralizzata (DBM) separatamente aggiunte nel lume della camera aumentano la velocità di deposizione dell osso. Questo nuovo studio ha lo scopo di valutare se si verifichi un effetto sinergico quando BMSC e DBM siano inserite insieme all interno della camera. Materiali e Metodi Lo studio è stato condotto nel rispetto del D.L. 116/92 sulla sperimentazione animale. La DBM è stata ottenuta da osso corticale di conigli New Zealand, mentre le BMSC mediante centrifugazione isopicnica di midollo osseo autologo. Per lo studio sono stati utilizzati 10 conigli New Zealand adulti dal peso di 3250±250g. Le procedure chirurgiche sono state condotte in anestesia generale. A livello del radio è stato creato bilateralmente un difetto osseo di 10 mm. Nel lato destro il difetto è stato riparato posizionando fra i due monconi ossei la camera contenente DBM+BMSC; nel lato sinistro (controllo) è stata posizionata nel difetto un uguale quantità di DBM e BMSC senza la camera. Sono stati eseguiti controlli radiologici immediatamente dopo l intervento, ed a 30, 60, 90 e 120 giorni. Indagini istologiche ed istomorfometriche dopo l espianto hanno permesso una valutazione quantitativa dell osso rigenerato all interno del condotto, espresso come percentuale rispetto allo spessore normale dell osso corticale del radio. Risultati In assenza della camera lo studio istologico ha messo in evidenza in tutti i casi una sinostosi fra radio e ulna e la penetrazione nel difetto di tessuto muscolare e connettivo. A livello dei due monconi erano presenti modesti segni di ricrescita ossea, con uno spessore medio del 46,7±10,7% della corticale normale, senza alcun ristabilimento della continuità. In presenza della camera deposizione di osso neoformato era evidente a 2-3 mesi; a 4 mesi i due monconi erano riuniti da un sottile strato di osso corticale con uno spessore medio pari al 58,7±3,74% della corticale normale. Confrontando questi risultati con quelli di precedenti studi in cui DBM e BMSC erano aggiunte separatamente alla camera, si è osservato come la differenza nello spessore della corticale fra i radii trattati con DBM e BMSC in combinazione all interno della camera, e i radii trattati con camera contenente solo DBM o solo BMSC sia risultata altamente significativa (p<0,0005). Conclusioni In conclusione questi risultati sono a favore dell ipotesi che la camera agisca sia come scaffold, sia per la sua impermeabilità, come contenitore di fattori osteogenetici. Poiché tuttavia anche i fattori di crescita che derivano dai tessuti molli hanno un ruolo nei processi di formazione dell osso, lo studio di camere con caratteristiche di porosità tali da consentire un interazione con l ambiente esterno sarà oggetto di future ricerche..

17 FUNZIONALIZZAZIONE SUPERFICIALE DI BIOMATERIALI MEDIANTE ANCORAGGIO DI FOSFATASI ALCALINA Enrica Vernè*, Sara Ferraris*, Silvia Spriano*, Chiara Vitale Brovarone*, Claudia Letizia Bianchi**, Marco Morra***, Clara Cassinelli*** * Dip. Scienza dei Materiali e Ingegneria Chimica, Politecnico di Torino, Torino, Italia ** Dip. Fisica, Chimica, Elettrochimica, Università di Milano, Milano, Italia *** Nobil Bio Ricerche, Villafranca d Asti - Italia Obiettivo: Il successo di un intervento di chirurgia protesica è strettamente legato all integrazione tra osso ed impianto ed alla rapida guarigione di un tessuto osseo, in alcuni casi, seriamente compromesso. Una prospettiva interessante, in questa direzione, è la realizzazione di superfici biomimetiche, che trasmettano segnali atti a promuovere la rigenerazione tissutale. Lo scopo di questo lavoro di ricerca è la funzionalizzazione di differenti biomateriali, utilizzati in chirurgia protesica, attraverso l ancoraggio di biomolecole coinvolte nei processi di osteointegrazione. La fosfatasi alcalina (ALP) è stata utilizzata come proteina modello, in quanto è legata ai processi di mineralizzazione dei tessuti duri. I dispositivi di interesse di questa ricerca sono impianti ortopedici o dentali e piccoli sostitutivi ossei di sintesi. I materiali trattati risulteranno bioattivi sia da un punto di vista fisico-chimico (osteoconduzione e precipitazione di apatite), che biochimico (osteoinduzione). Materiali e Metodi: Sono stati studiati vetri bioattivi di diverse composizioni. Le superfici di questi materiali, opportunamente trattate, espongono ossidrili, che possono essere sfruttati per la funzionalizzazione e l ancoraggio di biomolecole. Questa ricerca ha analizzato in un primo momento le metodologie per lo sviluppo di tali siti attivi sulla superficie dei materiali. La superficie è stata prima di tutto lavata per eliminare ogni contaminazione e promuovere l esposizione degli ossidrili.. Quindi è stata valutata la possibilità di silanizzare la superficie, al fine di promuovere e stabilizzare il legame tra biomolecola e substrato. L ultima fase del processo è stata l ancoraggio della fosfatasi alcalina, realizzato tramite incubazione dei campioni in una soluzione dell enzima. Le superfici sono state quindi analizzate con XPS, per verificare l avvenuto ancoraggio della molecola e mediante UV-VIS, per valutarne l attività (dopo l aggiunta di un opportuno substrato 4-nitrofenilfosfato). I campioni sono stati studiati anche a seguito di differenti lavaggi, per analizzare la stabilità del legame. Risultati: Gli spettri XPS evidenziano la presenza dell enzima, attraverso un arricchimento in carbonio e azoto e una diminuzione nei costituenti caratteristici del substrato. Lo studio in dettaglio della regione del carbonio mostra picchi caratteristici per l enzima. Le misure di assorbanza dopo la reazione con il 4-nitrofenilfosfato indicano che la molecola è legata alla superficie in forma attiva. Questa attività viene ridotta, ma mantenuta a seguito di differenti lavaggi. Conclusioni: La fosfatasi alcalina è stata legata alla superficie di vetri e vetroceramici bioattivi con e senza l impiego di un ulteriore molecola di attivazione. Su tutti i campioni è stata osservata la presenza della molecola in forma attiva. Sono in corso test di adesione e proliferazione cellulare.

18 HISTOLOGICAL ANALYSIS ON DENTAL BIOPSIES AFTER ENLARGEMENT OF ATROPHIC DENTAL RIDGES A. Cacchioli,. B. Spaggiari, F. Ravanetti, P. Borghetti and C. Gabbi. Department of Animal Health, Faculty of Veterinary Medicine, University of Parma. AIM: The work aims at analyzing, by means of different histological techniques, dental biopsies after atrophic dental ridges enlargement and titanium screws insertion, to evaluate the osteointegration dynamics of different testing materials. INTRODUCTION: Among the different alternatives to reconstruct atrophic dental ridges, the use of grafting materials meets the clinical need to optimize the subsequent prostethic treatment. Autologous bone, collected from the same individual, has good osteogenic and osteoinductive properties (1), while among heterologous grafting materials, deriving from a species different from recipient, inorganic bovine apatite presents osteoconductive properties and provides a steady bone volume due to its low reabsorbability (2). Here the osteointegrative response of autologous bone grafts from iliac crest, alone or associated to heterologous bone grafts (natural bovine apatite) was analysed. MATERIALS AND METHODS: The following specimens were harvested: 1 dental biopsy with autologous graft from iliac crest, 12 months after grafting; 5 biopsies with autologous graft from iliac crest mixed with granular heterologous graft (natural bovine apatite), 4 months after grafting; 1 biopsy with threaded Ti screw inserted after an autologous bone grafting, 6 months after screw insertion. After harvesting, undecalcified specimens were embedded in methyl methacrylate (MMA) and cut with a diamond-edged blade in a rotating saw. Sections were observed by polarizing light microscopy (PL), then they were stained by fast green-toluidine blue-basic fuchsin and observed by light microscopy (LM). Specimens devoid of implants were also decalcified, embedded in paraffin and cut to obtain 5 µm sections. The latter were stained by hematoxylin/eosin (E/E) and processed by immunoperoxidase to detect the endothelial marker CD31, and observed by LM. RESULTS: The different employed techniques showed how an autologous graft alone provides an excellent osteointegrative response after a long period (12 months). In particular, the presence of lamellar bone tissue organized in thick trabeculae, containing osteonic and interstitial systems, was detected by PL and LM on undecalcified sections. Biopsies containing autologous and heterologous grafts were decalcified and embedded in paraffin or embedded in MMA. 4 months after grafting the mixture appeared to induce a partial bone regeneration undergoing an active remodelling by macrophagic cells, further to a marked highly vascularized fibrous proliferation, referred to as granulation tissue. The latter aspects were detectable in E/E-stained and CD31-marked sections. The undecalcified implant-containing specimen was analysed by PL and LM and revealed the good osteointegration of a Ti screw after autologous grafting. 6 months after the screw insertion, wide bone trabeculae appeared to adhere to the screw threads without fibrous encapsulation. CONCLUSIONS: The use of different histological techniques allowed to perform a complete analysis of osteointegration mechanisms of several dental materials. Studying undecalcified tissues enable to evaluate bone tissue morphology and collagen fibres orientation, without interfering with tissue-implant interface. Also, analysing decalcified sections one can observe to a higher detail the bone deposition and remodelling processes, eventual phlogistic phenomena and related cell populations. REFERENCES: (1) Urist et al. Science (1983): (2) Quiñones et al. Clin Oral Implan Res 8.6 (1997):

19 BOLOGNA MAGGIO IDROGELI A BASE DI GUAR COME SCAFFOLD CELLULARI a G. Panariello, a,c R.Barbucci, a L.Campana, a E. Caputo, c G. Leone b A. Spreafico, b F. Chiellini, b R. Marcolongo. a BioSuMa s.r.l. b Dip. Medicina Clinica e Scienze Immunologiche Sez. Rreumatologia Università degli studi di Siena. c C.R.I.S.M.A. - Università degli studi di Siena. Obiettivo: La sintesi di idrogeli, ottenuti reticolando differenti polisaccaridi con differenti reticolanti, è volta alla ricerca di nuovi materiali che presentino determinate proprietà meccaniche, tissotropiche e biologiche, consentendo il loro utilizzo in settori quali l ingegneria tissutale, per la creazione di biomateriali tridimensionali impiantabili, l industria farmaceutica, per la creazione di sistemi transdermici per il rilascio controllato di farmaci. Materiali e metodi: La gomma di Guar è un polisaccaride che si estrae dai semi della pianta Cyamopsis Tetragonaloba. Appartiene alla famiglia dei Galattomannani ed ha un peso molecolare di circa KDa. Gli agenti reticolanti utilizzati in questo studio sono il Poly ethylene glycol diglycidyl ether (PEGDGE) ed l 1,2,7,8-diepoxyoctane (DEO). La reticolazione viene effettuata in ambiente basico: i due gruppi alcolici, presenti sull unità monomerica del Guar, si comportano da nucleofili ed attaccano l anello epossidico, presente in testa ed in coda ad entrambi i reticolanti. Sull idrogel è possibile creare una microstruttura porosa, con una dimensione dei pori controllata. Le analisi, per la caratterizzazione chimico-fisica, effettuate sul prodotto ottenuto sono: -Spettro IR, nel quale si osserva l aumento del picco relativo allo stretching del legame etere, che si forma a seguito della reticolazione. -Reologia, confermano la formazione del gel e la sua tissotropia. -Prove di rigonfiamento. -Viscosità. -Porometro, valuta la percentuale della porosità e le dimensioni dei pori. -SEM, per osservare la morfologia delle cellule seminate sull idrogelo. Risultati: Gli idrogeli sono risultati non essere citotossici, ne per contatto, ne per rilascio una volta sottoposti ad un ciclo di pressione da 1 a 5 MPa ad andamento sinusoidale, della durata di 3 ore. Sono state effettuate prove anche con i condrociti. Dischi di idrogeli a base di Guar hanno superato prove dinamiche di resistenza: l analisi reometrica non ha riscontrato differenze nel gel prima e dopo la prova dinamica. Conclusioni: La sintesi di idrogel, impiegando il Guar come polimero, ha permesso di ottenere dei materiali che possono essere impiegati nel settore della rigenerazione tissutale, come scaffold per i vari tipi di cellule.

20 8 IDROGELI FOSFATATI PER LA RIGENERAZIONE DEL TESSUTO OSSEO a P. Torricelli, b S. Maramai, b G. Leone, b R. Barbucci, c A. Facchini. b Dip. Scienze e Tecnologie Chimiche e dei Biosistemi - Università degli studi di Siena. a I.O.R. - Via di Barbiano 1/10, Bologna. c Lima-LTO s.p.a. Obiettivo: ottenimento di polisaccaridi con spiccate proprietà osteoinduttive /osteoconduttive. Materiali e Metodi: Materiali: Il sale sodico della CMC (grado di carbossimetilazione 0.95, PM = Da) fornito della Hercules Italia S.p.A (Italy). Gli altri reagenti sono stati acquistati dalla Fulka Chemie AG (Svizzera). Metodi: fosfatazione dei polisaccaridi: Il polimero di partenza è stato disciolto in acqua per farne una soluzione all 1% w/v e la soluzione è stata portata a ph=12 con NaOH 2M; in seguito è stato aggiunto il reattivo fosfatante sodiotrimetossi-fosfato (STMP) e la reazione è stata lasciata sotto agitazione magnetica a temperatura ambiente per 2h. La soluzione del polimero è stata infine dializzata in acqua distillata per 24-48h. In seguito, il polimero fosfatato è stato anche ammidato. Tutti i polimeri in esame sono stati in seguito sottoposti a reticolazione usando come agente reticolante l 1,3-diaminopropano. Risultati e discussioni: Polisaccaridi: La procedura di fosfatazione ha permesso l introduzione di un gruppo fosfato per ogni unità ripetitiva, sia sulla CMC che sulla CMCA, come confermato dall analisi infrarossa, in seguito alla comparsa di tre bande nello spettro, una a 1280 cm -1 circa (P=O stretching), una intorno a 1090 cm -1 e l altra attorno a 980 cm -1 (relative ai gruppi P-O-R e P-O-P). Idrogeli: L indagine morfologica tramite SEM ha evidenziato che i gel ottenuti dai polimeri fosfatati presentano una superficie più compatta e frastagliata, da attribuire a cross-link intercatena tra i gruppi fosfato. La presenza dei gruppi fosfato induce un significativo aumento delle proprietà reologiche del materiale (i valori di G (Pa) vanno da a nella CMCP rispetto alla CMC ( ) e in modo più spiccato nella CMCAP, da a rispetto alla CMCA ( ). Questo fenomeno è accompagnato da una diminuzione del water up-take. Inoltre, le prove reologiche, hanno evidenziato che i geli di CMCP e CMCAP mostrano proprietà tissotropiche, ovvero mostrano una temporanea riduzione della viscosità se sottoposti a sforzi di taglio. La valutazione della proliferazione cellulare (WST-1) e della bioattività sui quattro idrogeli si è concentrata sull analisi di ALP (fosfatasi alcalina), CICP (Collagene di tipo 1) e OC (Osteocalcina) a 3 e 7 giorni. È stato evidenziato che la presenza di gruppi fosfato stimola la proliferazione e la bioattività delle cellule (linea MG 63). Conclusioni: Gli idrogeli a base di polimeri fosfatati risultano essere materiali idonei per la rigenerazione del tessuto osseo e per la proliferazione delle cellule.

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