Nucleotidi e Acidi Nucleici

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1 I Nucleotidi Hanno Tre Componenti Nucleotidi e Acidi Nucleici Biotec _ 2011 Nucleotidi (1) Ribosio Vs. Desossirbosio Un Nucleotide è una molecola costituita da un composto ad anello contenente azoto (N) legato ad uno zucchero con 5 atomi di carbono. Lo zucchero può essere o un riboso o un desossiribosio ed è a sua volta collegato ad uno o più gruppi fosfato. Il 2 Desossi Ribosio del DNA viene sostituito dal Ribosio nel RNA. ll gruppo OH extra del ribosio è molto reattivo ed impedisce la formazione di una doppia elica stabile. 1

2 Nucleotidi (2) I nucleotidi che contengono deossiribosio sono i deossiribonucleotidi e sono i monomeri del DNA. I nucleotidi che contengono ribosio, ribonucleotidi, sono i monomeri del RNA. Gli anelli che contengono N sono chiamati basi per ragioni storiche: in condizioni acide ciascuno di essi può legare un protone (H + ) e quindi aumentare la concentrazione di ioni OH in soluzione acquosa. Vi è una forte somiglianza chimica fra le diverse basi azotate: La Citosina (C), la Timina (T) e l Uracile (U) sono chiamate pirimidine in quanto tutte derivano da un anello a sei atomi detto anello pirimidinico. La Guanina (G) e l Adenina (A) sono composti purinici ed hanno un secondo anello a 5 atomi fuso con l anello a 6 atomi. Basi azotate presenti negli acidi nucleici Negli acidi nucleici e nei nucleotidi, l azoto in posizione 9 delle purine e l azoto in posizione 1 delle pirimidine (rosso) sono legati al carbono 1 del ribosio o del desossiribosio. DNA RNA =objectonly 2

3 Le pirimidine hanno un anello con 6 atomi di carbono Le purine hanno due anelli collegati con 5 e 6 atomi di carbonio Nucleotidi (3) I nucleosidi e i loro mono, di e tri fosfati L insieme zucchero + base azotata è detto NUCLEOSIDE. Il nucleoside può legarsi ad uno, due o tre gruppi fosfato. I gruppi fosfato possono legarsi all atomo di carbonio 5 oppure al carbonio 3 del pentoso. La base azotata è legata al carbonio 1 dello zucchero. DNA RNA Base Nucleoside Nucleotidi Adenina (A) Deossiadenosina damp dadp datp Guanina (G) Deossiguanosina dgmp dgdp dgtp Citosina (C) Deossicitidina dcmp dcdp dctp Timina (T) Deossitimidina dtmp dtdp dttp Adenina (A) Adenosina AMP ADP ATP Guanina (G) Guanosina GMP GDP GTP Citosina (C) Citosina CMP CDP CTP Uracile (U) Uridina UMP UDP UTP 3

4 A seconda dei casi, i nucleotidi posono avere il loro gruppo fosfato legato sia alla posizione 5 oppure 3 del pentoso. Quando un acido nucleico è degradato possono quindi venire rilasciati i nucleoside 3 monofosfato e i nucleosidi 3 monofosfati Tutti i nucleotidi possono esistere in composti in cui vi è più di un gruppo fosfato legato alla posizione 5. I legami fra il primo (α) e il secondo (β), e fra il seondo (β) e il terzo (γ) gruppi fosfato sono ricchi di energia e sono usati per fornire energia per numerose attività cellulari. Lewin, Genes Lewin, Genes Nucleotidi (4) Oltre ad essere componenti degli acidi nucleici (DNA e RNA) i nucleotidi possono svolgere altre importanti funzioni. Es. La maggior parte dell energia utilizzata dagli esseri viventi deriva dall adenosina trifosfato (ATP) La guanosina trifosfato (GTP) è un nucleotide si lega d un gran numero di proteine ( proteine G ) e agisce da interrutore per attivarle. Proteine G monomeriche Proteine G trimeriche 4

5 ATP 3 Nucleotidi : Altre funzioni I nucleotidi possono giocare altri ruoli importanti: Il ribonucleotide ATP funge da trasduttore di energia in molte reazioni biochimiche. Il ribonucleotide GTP fornisce l energia per la sintesi proteica. Il camp (AMP ciclico) è un ribonucleotide speciale que è essenziale per l azione ormonale e per il trasferimento di informazione nel sistema nervoso. Proteine G Funzionano da interrutori molecolari. Quando legano la guanosina trifosfato (GTP) si attivano ( on ) e quando legano la guanosina difosfato si disattivano ( off ). Le proteine G regolano enzimi metabolici, canali ionici, trasportatori di membrana, e altre componenti delle attività cellulari, controllando la trascrizione, motilità, contrattilità e secrezione che, a loro volta, regolano funzioni sistemiche quali lo sviluppo embrionale, l apprendimento e la memoria e l omeostasi. GTP 5

6 Caratteristiche Distintive del DNA e del RNA Nucleotidfi ACIDI NUCLEICI 3 DNA RNA Proteina Il DNA è una molecola informativa. L informazione è immagazzinata nell ordine in cui sono disposte le sue quattro basi differenti. Questo ordine è trasferito alle molecole di RNA, che sono usate per dirigere l ordine degli amminoacidi delle proteine. 3 Acidi Nucleici : Il RNA può essere catalitico Alcune molecole di RNA dette ribozimi possono fungere da catalizzatori. La scoperta dei ribozimi ha fornito una soluzione per la questione su chi è comparso prima quando la vita è iniziata, le proteine o gli acidi nucleici? Dato che il RNA può essere sia informazionale che catalitico, esso potrebbe avere funzionato come catalizzatore sia per la sua stessa replicazione che per quella delle proteine. 6

7 Le cellule contengono istruzioni che: Specificano STRUTTURA Dettano FUNZIONE Regolano ATTIVITA Le istruzioni vengono trasmesse fedelmente alle cellule figlie L informazione ereditaria é trasmessa sotto forma di unità distinte, i GENI costituiti da DNA. L informazione del DNA passa: fra generazioni di cellule: REPLICAZIONE DEL DNA all interno di ogni cellula: TRASCRIZIONE + TRADUZIONE Nucleotidi (4) Sia il DNA che l RNA vengono sintetizzati a partire da nucleosidi trifosfati: Per il DNA: datp, dctp, dgtp e dttp Per il RNA: ATP, CTP, GTP e UTP. In entrambi i casi, dal momento in cui ogni nucleoside viene legato, i secondo e terzo gruppi fosfato vengono rimossi (idrolizzati). Molecola riferimento Molecola risultante Nome processo Codice Trascrizione & Traduzione DNA DNA REPLICAZIONE basi azotate: A,T,G,C DNA RNA TRASCRIZIONE basi azotate: A,U,G,C RNA Proteine TRADUZIONE amino acidi: 20 tipi 7

8 I 5 trifosfati sono i precursori per la sintesi degli acidi nucleici. L estremità 5 di un trifosfato reagisce con il gruppo 3 OH che si trova alla fine della catena polipeptidfica in crescita. Si forma un legame fra il fosfato α con il gruppo 3 OH dello zucchero all estremità della catena polipeptidica e i due gruppi fosfato terminali (βe (γ) del trifosfato sono rilasciati (sotto forma di una singola molecola detta pirofosfato). In una molecola di DNA da migliaia a milioni di nucleotidi si susseguono in una catena mediante collegamento del gruppo fosfato collegato al carbono 5 di una molecola di desossiribosio al carbono 3 di una seconda molecola di desossirbosio (in questo processo viene rilasciata una molecola di acqua). Poichè i nucleotidi sono collegati da legami fra le loro componenti zucchero e fosfato, si dice che il DNA ha una impalcatura («backbone») di zucchero fosfato. Il legame (covalente) si chiama fosfodiesterico DNA (1) Kreuzer & Massey, Biology and Biotechnology DNA DNA 8

9 RNA Da un punto di vista chimico, l RNA è molto simile al DNA. Tuttavia, ci sono alcune differenze principali: o L RNA usa lo zucchero RIBOSIO invece del Desossiribosio nel suo scheletro ( backbone ). o L RNA usa la base URACILE (U) invece della Timina (T). Anche U è complementare ad A. o L RNA tende ad essere a singolo filamento ( single strand ), ma alcune regioni possono ripiegarsi formando zone a doppio filamento. Differenze funzionali tra RNA e DNA o Il DNA ha una singola funzione; l RNA ha molteplici funzioni Esempi di tipi di RNA: trna, mrna, rrna. Differenze Chimiche fra DNA e RNA (1) SiailRNAcheilDNAsonocomposti da unità che si ripetono: Nel RNA, queste unità sono ribonucleotidi monofosfati Nel DNA, le unità sono 2 deossiribonucleotidi monofosfati. Differenze Chimiche fra DNA e RNA (2) Sia il RNA che il DNA formano lunghe catene polinucleotidiche, non ramificate, in cui diverse basi puriniche o pirimidiniche sono riunite mediante legami N glicosidici ad un impalcatura strutturale di zuccheri fosfato. Le catene hanno una polarità. La sequenza di un acido nucleico viene per convenzione letta da 5 a 3. Ad esempio, la sequenza della molecola di RNA qui rappresentata é AUGC, mentre quella della molecola di DNA é ATGC. La sequenza di basi porta in se l informazione, ossia, la sequenza ATGC comporta un informazione diversa di quella di AGCT nonostante le stesse basi siano coinvolte. Conseguenze della struttura chimica del RNA/DNA L impalcatura strutturale del DNA é più stabile, specialmente in condizione alcalina. Il gruppo OH nella posizione 2 del RNA può formare intermediari 2 3 fosfodiestere in condizioni basiche, che si rompono, dando una miscela di nucleosidi 2 e 3 monofosfati. Perciò il polinucleotide RNA é instabile. Il 2 desossiribosio permette allo zucchero di assumere una conformazione a minore energia nell impalcatura del DNA. Ciò aiuta ad aumentare la stabilità dei polinucleotidi. La deaminazione della Citidina a Uridina può essere identificata nel DNA, ma non nel RNA, perchè la deaminazione della citidina nel DNA porta a Uridina non a Timidina. Le basi Uridina nel DNA vengono rimosse da un sottogruppo di enzimi di riparo e sostituita con basi citidina. 9

10 Acidi nucleici DNA La fotografia di diffrazione (di raggi X) della forma B del DNA fatta da Rosalind Franklin nel Maggio del 1952 é stata di lunga la migliore fotografia di questo tipo. Dati ricavati da questa foto furono decisivi per permettere a James Watson e Francis Crick di costruire il modello del DNA che ha fatto vincere ad essi il premio Nobel. (Norman Collection on the History of Molecular Biology in Novato, Calif.) 10

11 Regola di Chargaff James Watson & Francis Crick /photocredit/achievers/wat

12 Coppie di basi complementari riempiono il centro della doppia elica proposta da Watson ecrick Coppie di basi complementari nella doppia elica del DNA La forma e la struttura chimica delle basi permettono che si formino legami di idrogeno efficacientemente soltanto fra A e T e fra G e C, dove gli atomi in grado di formare legami di idrogeno possono essere portati sufficientemente vicini senza dirtorcere la doppia elica. Come indicato, fra A e T si formano due ponti di idrogeno mentre fra G e C se ne formano tre. Le basi si possono appaiare in questo modo soltanto se le catene polinucleotidiche che le contengono sono antiparallele una all altra. 12

13 Conclusioni di Watson & Crick sulla struttura del DNA (1953) Tratte dai dati cristallografici di Rosalind Franklin e Maurice Wilkins Due catene polinucleotidiche elicoidali si avvolgono attorno ad un asse centrale con un diametro di 20 angstroms (10 10 m). Le due catene sono antiparallele (scorrono in direzioni opposte). Le impalcature di zucchero fosfato rimangono all esterno della struttura. Le basi azotate sono perpendicolari all asse dell elica e separate da 3.4 angstroms. La struttura elicoidale si ripete ogni 34 angstroms, e quindi ci sono 10 basi per giro dell elica. A. Modello di tipo space filling di un giro e mezzo della doppia elica del DNA. Ogni giro di DNA è fatto da 10.4 paia di nucleotidi e la distanza da centro a centro fra le coppie adiacenti di nucleotidi è 3.4 nm. L avvolgimento dei due filamenti uno attorno all altro crea due solchi nella doppia elica. Il solco più ampio è detto solco maggiore ( major groove ) e quello meno profondo il solco minore ( minor groove ). B. Una piccola sezione della doppia elica vista lateralmente, che mostra 4 paia di basi. I nucleotidi sono legati uno all altro covamentemente mediante legami fosfodiesterici tramite il gruppo 3 idrossile ( OH) di uno zucchero e il 5 fosfato (P) del successivo. Quindi, ogni filamento polinucleotidico ha una polarità chimica; ossia le loro due estremità sono diverse chimicamente. L estremità 3 porta un gruppo OH non legato collegato alla posizione 3 dell anello di zucchero; l estremità 5 porta un gruppo fosfato libero legato alla posizione 5 dell anello dello zucchero. Solco minore Solco maggiore 13

14 ... una modesta proposta... It has not escaped our notice that the specific pairing we have postulated immediately suggests a possible copying mechanism for the genetic material. Watson & Crick, A Structure for Deoxyribose Nucleic Acid, Nature Non è sfuggito alla nostra attenzione che l appaiamento specifico che abbiamo postulato suggerisce immediatamente un possibile meccanismo di copiatura per il materiale genetico Replicazione semiconservativa del DNA. I due filamenti parentali del DNA si separano e ognuno serve come stampo per la sintesi di un nuovo filamento figlio mediante accoppiamento di basi complementari. 14

15 Reazione catalizzata dalle DNA polimerasi Tutte le DNA polimerasi aggiungono un desossiribonucleotide 5 trifosfato al gruppo 3 idrossilico ( OH) di una catena in crescita del DNA ((filamento guida). DNA polimerasi Tutti le DNA polimerasi note condividono due proprietà fondamentali che hanno implicazioni critiche per la replicazione del DNA: Tutte le polimerasi sintetizzano il DNA soltanto nel verso 5 a 3, aggiungendo un dntp al gruppo idrossilico della catena in crescita. Le DNA polimerasi possono aggiungere un nuovo desorriribonucleotide soltanto ad un primer (innesco) preformato che è legato mediante ponti di idrogeno al templato; non sono in grado di iniziare la sintesi del DNA de novo catalizzando la polimerizzazione di dntps liberi. Da questo punto di vista, le DNA polimerasi differiscono dalle RNA polimerasi, che possono inziare la sintesi di un nuovo filamento di RNA in assenza di un primer. Replicazione del DNA 15

16 DNA polimerasi Enzimi responsabili dalla costruzione di nuovi filamenti di DNA durante la replicazione e il riparo del DNA. Rappresentazione schematica del meccanismo di duplicazione del DNA a livello della forcella di replicazione. a,. Polimerizzazione di un nucleotide all estremità 3 di un filamento primer. L enzima seleziona i nucleotidi in base alla loro abilità di appai con i nucleotid presenti sul filamento stampo. Ad entrambi i filamenti in allungamento, i nucleotidi vengono addizionati dalla DNA polimerasi in direzione 5 > 3 (indicata dalle frecce). La sintesi del filamento guida avviene in modo continuo, a partire da un unico innesco a RNA legato alla sua estremità 5 (non mostrato). La sintesi dell altro filamento figlio (il filamento lento), procede in modo discontinuo; all inizio si formano i frammenti di Okazaki, che si allungano a partire da numerosi inneschi a RNA, che vengono formati, sul filamento parentale man mano che, a livello della forcella di replicazione, viene esposta una nuova porzione di DNA. Gli inneschi a RNA vengono allungati dalla DNA polimerasi. Man mano che ogni frammento si avvicina ad un innesco che lo precede lungo il filamento parentale, l innesco viene rimosso, da un enzima e i frammenti di DNA vengono uniti dalla DNA ligasi per formare un filamento continuo. La sintesi dell intero filamento lento viene compiuta attraverso numerose ripetizioni di questo processo. Ad ogni forcella di replicazione, uno dei due filamenti è sintetizzato mediante più inneschi. (a) La struttura completa della forcella di replicazione. La sintesi del filamento guida, catalizzata dalla DNA polimerasi III, si sttua per aggiunta sequenziale di deossiribonucleotidi nella stressa direzione di spostamento della forcella di replicazione. (b) Passaggi della sintesi discontinua del filamento tardivo. Questo processo richiede numerosi inneschi, due DNA polimerasi e una ligasi, che unisce l estremità 3 idrossile di un frammento (frammento di Okazaki) con l estremità 5 fosfato del frammento adiacente. (c) Giunzione fra i frammenti di DNA. Durante questa reazione, la ligasi si lega momentaneamente ed in modo covalente all estremità 5 fosfato di un filamento di DNA, attivandone così il gruppo fosfato. La DNA ligasi di E. coli usa come cofattore il NAD+, generando NMN e AMP, mentre la ligasi del batteriofago T4, normalmente usata nel clonaggio del DNA, usa ATP, generando PPi e AMP. Molecular Cell Biology 12. DNA Replication, Repair, and Recombination The DNA Replication Machinery 16

17 Replicazione del DNA (a) Replicazione del DNA (b) As depicted in the following drawing, the DNA of a cell is tightly packed into chromosomes. First, the DNA is wrapped around small proteins called histones (colored pink below). These bead-like structures are then further organized and folded into chromatin aggregates that make up the chromosomes. An overall packing efficiency of 7,000 or more is thus achieved. Clearly a sequence of unfolding events must take place before the information encoded in the DNA can be used or replicated. Once the double stranded DNA is exposed, a group of enzymes act to accomplish its replication. These are described briefly here: Topoisomerase: This enzyme initiates unwinding of the double helix by cutting one of the strands. Helicase: This enzyme assists the unwinding. Note that many hydrogen bonds must be broken if the strands are to be separated.. SSB: A single strand binding protein stabilizes the separated strands, and prevents them from recombining, so that the polymerization chemistry can function on the individual strands. DNA Polymerase: This family of enzymes link together nucleotide triphosphate monomers as they hydrogen bond to complementary bases. These enzymes also check for errors (roughly ten per billion), and make corrections. Ligase: Small unattached DNA segments on a strand are united by this enzyme. Replicazione del DNA (c) 17

18 Differenze tra RNA e DNA Acidi nucleici RNA Trascrizione: Sintesi dell RNA a partire dal DNA. I due filamenti di DNA si svolgono ed uno é usato come stampo ( template ) per la sintesi di un filamento complementare di RNA. TIPI PRINCIPALI DI RNA PRODOTTI NELLE CELLULE Tipo di RNA mrna rrna trna snrna snorna Altri RNA non codificanti Funzione RNA messaggeri, codificano per proteine RNA ribosomiali, formano la struttura di base dei ribosomi e catalizzano la sintesi proteica RNA transfer, fondamentali per la sintesi proteica come adattatori fra mrna e aminoacidi piccoli RNA nucleari, agiscono in una varietà di processi nucleari, compreso lo splicing del pre-mrna piccoli RNA nucleolari, usati per processare e modificare chimicamente gli rrna Agiscono in diversi processi cellulari, compreso sintesi dei telomeri, disattivazione del cromosoma X, trasporto di proteine nell ER, regolazione genica (microrna)*. 18

19 Funzione e struttura del RNA La struttura terziaria del RNA é simile a quella del DNA, ma ci sono diverse differenze importanti: Il RNA di solito forma coppie di basi intramolecolari L informazione trasportata dal RNA non é ridondante perchè queste coppie di basi sono intramolecolari. I solchi maggiore e minore sono molto meno pronunciati. Tutti i ruoli svolti dal RNA (strutturale, adattatore informazionale, trasferimento di informazione) sono coinvolti nella decodificazione trasportata dal DNA. Trascrizione: Sintesi del RNA La reazione di allungamento della catena catalizzata dall enzima RNA polimerasi. Ad ogni passo viene selezionato un ribonucleotide trifosfato dalla sua capacità di accoppiarsi con il filamento della doppia elica del DNA esposto che funge da stampo ( template ); viene quindi aggiunto un ribonucleotide monofosfato all estremità 3 OH della catena di RNA (freccia rossa), e viene rilasciato il pirofosfato (Pi Pi; atomi rossi). Quindi, la nuova catena di RNA cresce un nucleotide alla volta, in direzione 5 3, ed é complementare alla sequenza del filamento stampo del DNA. La reazione é resa energeticamente favorevole dai cambiamenti di energia libera che accompagnano il rilascio di pirofosfato e dall ulteriore idrolisi del pirofosfato a fosfato inorganico. Trascrizione e maturazione del RNA negli eucarioti (1) Nelle cellule eucarioti ci sono tre distinti enzimi di trascrizione, ognuno dei quali é responsabile della sintesi di gruppi diversi di RNA: RNA polimerasi I: sintetizza i grandi RNA ribosomali (28 S, 18S e 5,8 S) RNA polimerasi II: sintetizza gli RNA messaggeri e la maggior parte dei piccoli RNA nucleari RNA polimerasi III: sintetizza gli RNA a basso peso molecolare, compresi gli RNA di transferimento e l RNA ribosomico 5S. Nessun procariote possiede più di una RNA polimerasi, mentre gli eucarioti più semplici (lieviti) hanno gli stessi tipi di polimerasi che sono presenti nelle cellule dei mammiferi. Ulteriore distinzione fra procarioti ed eucarioti. 19

20 Trascrizione e maturazione del RNA negli eucarioti (cont.) Le polimerasi degli eucarioti sono enzimi estremamente complessi, che contengono da 8 a 14 polipeptidi distinti (subunità) e sono abbastanza grandi da essere visualizzati al microscopio elettronico: Oltre alle subunità, che costituiscono gli enzimi, ciascuna delle polimerasi é coadiuvata nelle sue funzioni da proteine ausiliarie: fattori di trascrizione: Fattori generali di trascrizione: necessari alla polimerasi per iniziare la trascrizione; Fattori specifici di trascrizione ( proteine regolatrici dei geni ): determinano la velocità alla quale un particolare gene o gruppo di geni viene trascritto RNA POLIMERASI I geni possono essere espressi con efficienza diversa. Il gene A é trascritto e tradotto in modo molto più efficiente del gene B. Ciò fa sì che la quantità di proteina A nella cellula sia molto maggiore di quella della proteina B. Le RNA polimerasi sono enzimi che catalizzano la formazione del RNA usando uno stampo ( template ) sul DNA I substrati della reazione sono i nucleotidi trifosfato L accesso della RNA polimerasi allo stampo è regolato, sia nei procarioti che negli eucarioti I procarioti hanno una singola RNA polimerasi Gli eucarioti hanno tre RNA polimerasi 20

21 RNA polimerasi nelle cellule eucariotiche Tipo di polimerasi RNA polimerasi I RNA polimerasi II Geni trascritti geni degli rrna 5.8S, 18S e 28S tutti i geni che codificano proteine, più geni di snorna e alcuni geni di snrna RNA polimerasi III geni dei trna, geni di rrna 5S, alcuni geni di snrna e geni per altri piccoli RNA RNA polimerasi mitocondriale* RNA polimerasi dei cloroplasti* geni mitocondriali geni dei cloroplasti *Le RNA polimerasi mitocondriale e dei cloroplasti sono simili agli enzimi batterici TERMINOLOGIA DEL PROCESSAMENTO DEL DNA E DEL RNA Termine Replicazione Trascrizione Traduzione Significato letterale Fare un duplicato identico Copiare informazione da un supporto ad un altro, come avviene ad es. quando si passa da un nastro audio ad un testo scritto Prendere informazione da una lingua e convertirla in un altra lingua Processo in cui sono coinvolti gli acidi nucleici Usare una molecola di DNA come riferimento per ottenere due copie di molecole figlie identiche Copiare la sequenza di basi di una molecola di DNA sotto forma di sequenza di basi di una molecola di RNA Prendere la sequenza di codoni del mrna e convertirla in una catena di aminoacidi di una proteina Maturazione del RNA TRASCRITTO primario: molecola di RNA appena prodotta per trascrizione del DNA. MATURAZIONE: Modificazioni chimiche necessarie per produrre un mrna funzionale a partire dal trascritto primario (precursore): RIMOZIONE DI REGIONI DEL TRASCRITTO PRIMARIO (es. splicing del mrna). AGGIUNTA DI MODIFICAZIONI DI SPECIFICI NUCLEOTIDI (particolarmente negli trna). Associazione con proteine. Passaggio dal nucleo al citoplasma I tre ruoli dell RNA nella sintesi proteica. L RNA messaggero (mrna) viene tradotto in una proteina mediante l azione concertata dell RNA di trasferimento (trna) e del ribosoma, che è composto da numerose proteine e da due principali molecule di RNA ribosomale (rrna). 21

22 STRUTTURA DEI GENI DEGLI EUCARIOTI La maggior parte dei geni degli eucarioti contiene segmenti di sequenze codificanti (esoni) interrotte da sequenze noncodificanti (introni). Le sequenze di spaziatura ( spacers ) sono lunghe sequenze di DNA non codificanti che rimangono fra i geni. RNA RNA MESSAGGERO (mrna) Cooper The Cell, a Molecular Approach (2 nd ed.) mrna (1) Il RNA messaggero o mrna é una copia dell informazione trasportata da un gene sul DNA. Il ruolo del mrna é quello di trasportare l informazione contenuta nel DNA fino all apparato di traduzione. Il mrna é eterogeneo in dimensioni e sequenza. mrna (2) Ha sempre un cappello 5 composto da un legame trifosfato 5 a 5 fra due nucleotidi modificati: una 7 metilguanosina e una 2 O metil purina. Il cappello serve per segnalare questa molecola di RNA come un mrna all apparato di traduzione. Inoltre, la maggior parte delle molecole di mrna contengono una coda di poli Adenosina all estremità 3. Siailcappello5 chelacoda3 vengonoaggiuntedopocheilrnaétrascrittoe contribuiscono alla stabilità del mrna nella cellula. 22

23 mrna (3) Il mrna non viene sintetizzato direttamente nella cellula eucariotica. Esso é trascritto nel nucleo sotto forma di RNA nucleare eterogeneo ( heterogeneous nuclear RNA, hnrna). Il hnrna contiene introni ed esoni. Gl introni sono rimossi mediante splicing del RNA, lasciando gli esoni, che contengono l informazione, riuniti fra di loro. In alcuni casi, singoli nucleotidi possono venire aggiunti nel mezzo di una sequenza di mrna mediante un processo detto di editting del RNA. Cappello del mrna Quadri complessi di splicing del mrna Quadri complessi dello splicing del mrna negli eucarioti. Il pre RNA trascritto del gene dell alfa tropomiosina viene spliced in modo alternativo in tipi cellulari diversi. Le caselle verde chiaro rappresentano gli introni, gli altri colori gli esoni. I segnali di poliadenilazione sono indicati da una A. Le linee tratteggiate nei mrna maturi indicano regioni che sono state rimosse dallo splicing. TM: tropomyosin. Griffiths et al., An Introduction to Genetic Analysis, W.H. Freeman & Co. 23

24 Schema generale della maturazione degli mrna negli eucarioti. Poco dopo che la RNA polimerasi II ha ha iniziato la trascrizone del primo nucleotide del primo esone di un gene, l estremità 5 dell RNA in formazione viene protetta con una 7 metilguanina. La trascrizione effettuata dalla RNA polimerasi II ha termine ad uno qualsiasi degli svariati siti di terminazione a valle del sito poli(a), che è localizzato all estremità 3 dell ultimo esone. Dopo che il trascritto primario é stato tagliato in corrispondenza del sito poli(a), viene aggiunta una serie di residui di adenina. La coda poli(a) contiene circa 250 residui di adenina nei mammiferi, circa 1250 negli insetti, e circa 100 nei lieviti. Per trascritti primari brevi, con pochi introni, la poliadenilazione e lo splicing generalmente seguono la terminazione, come mostrato nella figura. Per geni lunghi, con molti introni, gli introni sono spesso recisi dall RNA in formazione, prima che la trascrizione del gene sia completata. Si noti che il cap 5 permane negli mrna maturi.. I tre ruoli dell RNA nella sintesi proteica. L RNA messaggero (mrna) viene tradotto in una proteina mediante l azione concertata dell RNA di trasferimento (trna) e del ribosoma, che è composto da numerose proteine e da due principali molecule di RNA ribosomale (rrna). 24

25 rrna (RNA ribosomiale) Un ribosoma consiste di due sub unità I ribosomi sono organelli presente nel citoplasma oppure ancorati al reticolo endoplasmatico ruvido. Sono particelle responsabili della sintesi proteica, leggendo le informazioni contenute in una catena di RNA messaggero (mrna). Lewis, Genes 25

26 Subunità dei ribosomi In tutte le cellule, ogni ribosoma consiste di una subunità grande e una piccola. Le due subunità contengono rrnas di diversa lunghezza e un insieme diverso di proteine. Tutti i ribosomi contengono due molecole principali di rrna (rosso scuro) 23S e 16S rrna nei batteri, 28S e 18S rrna negli eucarioti e uno o due piccoli rrna (rosso chiaro). Le proteine sono disegnate L1, L2, ecc e S1, S2, ecc., a seconda che siano presenti nella subunità grande ( large ) o piccola ( small»). PROCARIOTI EUCARIOTI 26

27 Struttura di un rrna batterico Lewis, Genes Geni dell RNA ribosomale Processamento della molecola del precursore rrna 45S in tre separati RNA ribosomali Ciascun gene dell rrna è una singola unità di trascrizione contenente gli rrnas 18S, 5.8S, e 28S e sequenze spaziatrici trascritte. I geni degli rrna sono organizzati in serie in tandem, separate da DNA spaziatore non trascritto. Ciascun gene dell rrna è una singola unità di trascrizione contenente gli rrnas 18S, 5.8S, e 28S e sequenze spaziatrici trascritte. I geni degli rrna sono organizzati in serie in tandem, separate da DNA spaziatore non trascritto. Cooper: The Cell III. Cell Structure and Function 8. The Nucleus The Nucleolus Quasi la metà delle sequenze di nucleotidi dell RNA trascritto primario sono degradate nel nucleo. Molecular Biology of the Cell 3rd ed. Alberts, Bruce; Johnson, Alexander; Lewis, Julian; Raff, Martin; Roberts, Keith; Walter, Peter. New York 27

28 Processazione del pre rrna Processamento del pre rrna ed assemblaggio dei ribosomi negli eucarioti. Il trascritto 45S del pre rrna contiene spaziatori esterni trascritti (ETS) ad entrambe le estremità e spaziatori interni trascritti (ITS) fra le sequenze degli rrna 18S, 5.8S e 28S. Il pre rrna è processato mediante una serie di tagli (illustrati per il pre rrna umano) che producono le specie mature di rrna. highlight=ribosomes,rrna&rid=mcb.figgrp (a) Principali intermediari e tempi richiesti per i vari passi del processamento del pre rrna negli eucarioti superiori. Le proteine ribosomali e nucleolari si associano con il 45S pre rrna quasi subito dopo la sua trascrizione, formando un 80S pre rrnp. La sintesi del 5S rrna ha luogo fuori dal nucleolo. In questo schema non viene illustrata la complessa struttura secondaria degli rrna. Notare che il RNA costituisce circa il 2/3 della massa delle subunità ribosomiali, e le proteine circa 1/3. (b) Via di processamento del trascritto primario per il 6.6 kb (35S) pre rrna nella S. cerevisiae. Le regioni di spaziatura trascritte (tan), che vengono scartate durante il processamento, separano le regioni corrispondenti agli rrna maturi 18S, 5.8S, and 25S rrnas. Tutti gli intermediari diagrammati sono stati identificati; le loro dimensioni sono indicate in rosso. RNA I tre ruoli dell RNA nella sintesi proteica. L RNA messaggero (mrna) viene tradotto in una proteina mediante l azione concertata dell RNA di trasferimento (trna) e del ribosoma, che è composto da numerose proteine e da due principali molecule di RNA ribosomale (rrna). RNA TRANSFER (trna) 28

29 Legami di idrogeno nell RNA (1) Aminoacil trna sintasi Enzima che catalizza l esterificazione di un specifico aminoacido o del suo precurosore ad uno dei suoi trna specifici per formare un aminoacil trna. Questo processo viene talvolta chiamato caricamento del trna con l amminaocido. Una volta che il trnaè carico, un ribosoma può trasferire l AA dal trna ad un polipeptide in crescita, secondo il codice genetico

30 La molecola di trna viene sintetizzata in due parti, Il corpo del trna é trascritto da un gene trna. Il braccio accettore ( acceptor stem ) é lo stesso per tutte le molecole di trna ed é aggiunto dopo che il corpo é stato sintetizzato. Esso viene sostituito spesso durante il tempo di vita di una molecola di trna. Il braccio accettore è il sito che trasporta uno specifico aminoacido, che é stato attaccato da una amino aciltrna sintasi. L anticodone legge l informazione in una sequenza del mrna mediante accoppiamento di basi. Strutture degli trnas E illustrata la struttura del fenilalanina trna del lievito nella forma aperta a foglia di trigoglio (A) per mostrare accoppiamenti fra basi complementari. Le basi modificate sono indicate come mg (metilguanosina), mc (metilcitosina), DHU (diidrouridina), T (ribotimidina), Y (una purina modificata, di solito adenosina) e y ( pseudouridina). (B) Forma ripiegata della molecola. N.B. Gli RNA contengono spesso basi modificate chimicamente rispetto al DNA STRUTTURA DEGLI RNA A FORMA TRIDIMENSIONALE COMPLESSA (es. rrna, trna) (1) Sia gli rrna che i trna devono la loro attività alle loro complesse strutture secondaria e terziaria. Diversamente dal DNA che ha struttura a doppia elica relativamente definita indipendentemente dalla sua origine, gli RNA si ripiegano in complesse forme tridimensionali, notoriamente diverse da un tipo di RNA all altro. Perciò, come le proteine, gli RNA sono in grado di svolgere molte funzioni, perchè possono assumere un gran varietà di forme. Come per le proteine, il ripiegamento degli RNA segue certe regole. Durante il ripiegamento delle catene proteiche che lavorano in ambiente acquoso i residui idrofobici vengono portati all interno Nell RNA il ripiegamento dipende dalla formazione di regioni che hanno coppie di basi complementari. Le regioni di basi appaiate formano tipicamente degli steli a doppio filamento (e a doppia elica), connessi ad anse a filamento singolo. 30

31 STRUTTURA DEGLI RNA A FORMA TRIDIMENSIONALE COMPLESSA (es. rrna, trna) (2) A differenze del DNA, costituito unicamente dalle coppie di basi A T e G C, il RNA contiene spesso coppie di basi non convenzionali e basi azotate modificate. Queste regioni peculiari spesso fungono da siti di riconoscimento per proteine ed altri RNA Promuovono il ripiegamento del RNA Aiutano a stabilizzare la struttura della molecola. L appaiamento delle basi fra le diverse molecole di RNA svolge un ruolo cruciale nella gran parte delle attività in cui sono coinvolti gli RNA. L RNA si può ripiegare in strutture specifiche. L RNA è in gran parte a singolo filamento, ma spesso contiene brevi tratti di nucleotidi che possono formare coppie di basi convenzionali con sequenza complementari presenti altrove sulla stessa molecola. Queste interazioni, insieme ad ulteriori interazioni di appaiamento non convenzionale di basi, permettono ad una molecola di RNA di ripiegarsi in una struttura tridimensionale che è determinata dalla sua sequenza di nucleotidi. (A) Diagramma di una struttura ripiegata di RNA che mostra soltanto interazioni di appaiamento convenzionale; (B) struttura con interazioni di accoppiamento convenzionale (rosso) e non convenzionale (verde); (C) struttura di un RNA reale, una porzione di un introne di gruppo 1. Ciascuna interazione di accoppiamento convenzionale é indicata da un piolo nella doppia elica. Le basi in altre configurazioni sono indicate da pioli spezzati. RNA transfer (trna) Il trna é la molecola portatrice di informazione con funzione di adattatore. Rappresenta l interfaccia diretta fra la sequenza di aminoacidi di una proteina e l informazione sul DNA. Perciò essa decodifica l informazione sul DNA. Ci sono più di 20 diverse molecole di trna. Tutte hanno da 75 a 95 nucleotidi. Tutti i trna di tutti gli organismi hanno una struttura similare: in verità, un trna umano può funzionare in un lievito. Nelle molecole di trna ci sono 4 braccia (accettore, braccio D, braccio T pseudouridina C, braccio anticodone) e 3 loops. (loop D, loop T e loop anticodone). Talvolta le molecole di trna hannno un loop extra o variabile (uno é illustrato in giallo nella figura). Struttura dei trna Struttura primaria e secondaria (1) Tutti i trna hanno una sequenza simile di 73 a 93 nucleotidi. L estremità 3 finisce sempre con la sequenza CCA, in cui il gruppo idrossilico 3 del ribosio della A terminale é il punto di legame covalente per l aminoacido. Essi contengono un certo numero (7 15%) di basi uniche/ o modificate. Queste vengono modificate post trascrizionalmente dopo la sintesi, mediante l enzima RNA polimerasi. 31

32 Struttura dei trna Struttura primaria e secondaria (2) In particolare, l adenosina (A) nella prima o 5 posizione dell anticodone (corrispondente alla terza o posizione 3 del codone) é sempre modificata in inosina (I) che manca del gruppo aminico ( NH 2 ) nell anello purinico. L inosina può appaiarsi con A, U o C e perciò spiega molta della degenerazione del Codice Genetico (Teoria di Wobble). Adenosina Struttura dei trna Struttura primaria e secondaria (2) Il trna ha una struttura secondaria a forma di trifoglio a causa due gambi ( stems ) in cui vi é appaiamento intramolecolare tra basi. Il trifoglio contiene tre loops senza appaiamento di basi: il loop D, l anticodone e il loop TpsiC. Struttura dei trna Struttura Terziaria del trna (1) La struttura terziaria del trna é meglio descritta come una forma compatta a L. L anticodone é un loop a singola elica all estremità della Figura, che ulteriormente si appaierà con la tripletta codone. L aminoacido é legato alla A terminale sulla parte superiore destra. I siti attivi (anticodone e aminoacido) sono separati al massimo. 32

33 Struttura dei trna Struttura Terziaria del trna (2) RUOLO DEI LEGAMI DI IDROGENO NELLA TRASCRIZIONE DEL RNA STRUTTURA DEGLI RNA & INTERAZIONE trna/mrna Come succede con le proteine, la struttura terziaria é dettata dalla sequenza primaria. La struttura terziaria é stabilizzata da appaiamento tra basi e accatastamento di basi. Due aree (braccio anticodone e braccio accettore) formano una doppia elica. CODICE GENETICO Codice mediante il quale la sequenza nucleotidica di una molecola di DNA o di RNA specifica la sequenza amminoacidica di un polipeptide. Consiste di codoni a tre nucleotidi che specificano un particolare amminoacido oppure dicono al ribosoma di fermare la traduzione e rilasciare il polipeptide. Con poche eccezioni, tutti gli organismi viventi utilizzano lo stesso codice. (Mathews et al., Biochimica) Codiced Genetico (segue) Un gene una catena polipeptidica Corrispondenza lineare solo nei PROCARIOTI. EUCARIOTI: sequenze codificanti (esoni) + sequenza non codificanti (introni) ATTENZIONE: alcuni geni NON codificano per proteine (mediante un mrna), codificano per gli altri RNA: trna, rrna, snrna, snorna, ecc. 33

34 Codiced Genetico (segue) CODICE GENETICO detto «DEGENERATO» O «RIDONDANTE»: Un singolo amminoacido può essere specificato da più di una tripletta di nucleotidi. Non significa malfunzionalità (ambiguità). Aumenta l adattabilità del sistema di codificazione. Il codice genetico non è sovrapposto: Ogni nucleotide è parte di una sola tripletta. Decodificazione di una molecola di mrna Ogni aminoacido addizionato all estremità crescente della catena polipeptidica viene selezionato mediante appaiamento complementare di basi fra l anticodone nel trna a cui é legato e il codone successivo nella catena del mrna 34

35 One gene > one protein Genetic code Triplet code Same language/monomers Three basepairs specify one amino acid = codon Different language/monomers Genetic code Triplet code DNA Template strand = complementary to mrna Coding strand = nontemplate strand = similar sequence to mrna Genetic code Triplet code DNA Template strand = complementary to mrna Coding strand = nontemplate strand = similar sequence to mrna Uracil used instead of Thymine 35

36 Triplet code Nonoverlapping Genetic code Genetic code Triplet code Nonoverlapping Degenerate 4 nucleotides > 20 amino acids doublet code > 4 2 > 16 combinations triplet code > 4 3 > 64 combinations Triplet code Nonoverlapping Degenerate Genetic code 61 codons code for amino acids triplet code > 4 3 > 64 combinations Each amino acid specified by more than one nucleotide triplet (codon) 36

37 61 codons code for amino acids Genetic code AUG = Met = start UAG UAA Stop UGA Genetic code L uracile forma coppie di basi con adenina. L assenza di un gruppo metilico in U non ha effetto sull accoppiamento delle basi; così, le coppie di basi U A assomigliano molto alle coppie di basi T A. 37

38 Aminoacil trna sintetasi ectonly Aminoacylation of trna. Amino acids are covalently linked to trnas by aminoacyl trna synthetases Each of these enzymes recognizes one kind of amino acid and all the cognate trnas that recognize codons for that amino acid. The two step aminoacylation reaction requires energy from the hydrolysis of ATP. The equilibrium of the overall reaction favors the indicated products because the pyrophosphate (PP i ) released in step 1 is converted to inorganic phosphate (P i ) by a pyrophosphatase. The 3 end of all trnas, to which the amino acid attaches, has the sequence CCA. Class I synthetases (purple) attach the amino acid to the 2 hydroxyl of the terminal adenylate in trna; class II synthetases (green) attach the amino acid to the 3 hydroxyl. (Ad = adenine; Cyt = cytosine.) «WOBBLE» NEL CODICE GENETICO (TENTENAMENTO) (1) D accordo con il codice genetico, una cellula avrebbe bisogno di trna con 61 diversi anticodoni per complementare i 61 codoni disponibili. Tuttavia, dovuto alla degenerazione del codice genetico, la terza base è meno discriminatoria per l aminoacido delle altre due basi. «WOBBLE» NEL CODICE GENETICO (TENTENAMENTO) (2) Questa terza posizione del codone viene detta posizione di wobble (tentenamento). In questa posizione, gli U e le C possono essere letti come G nell anticodone. Allo stesso modo, le A e le G possono essere lette come U o Y (pseudouridina) nell anticodone. 38

39 «WOBBLE» NEL CODICE GENETICO (TENTENAMENTO) (3) I trna inoltre contengono una serie nucleotidi modificati. Uno di questi nucleotidi è l inosina (I). Se il trna contiene una Inosina nell anticodone in posizione wobble, questo trna può leggere codoni che hanno A, U oppure C nella terza posizione. Appaiamento non-standard codoneanticodone ( woobling ; tentenamento). L accoppiamento delle basi nella 3 posizione del codone è rilassata, permettendo a G di appaiarsi con U, e all inosina (I) dell anticodone di appaiarsi con U, C oppure A. Sono illustrati due esempi di appaiamentp tra basi anomali, che permettono alla PhetRNA (trna che trasporta la fenilalanina) di riconoscere sia i codoni UUC che UUU, e al Ala-tRNA (trna che trasporta l alanina) di riconoscere GCU, GCC e GCA. 39