Convalida dei sanitizzanti. Barbara Chiara Cabras
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1 Convalida dei sanitizzanti Barbara Chiara Cabras
2 Convalida dei sanitizzanti Normative Panoramica sui sanitizzanti Convalida in vitro Convalida sulle superfici
3 Convalida dei sanitizzanti
4 NORMATIVE & LINEE GUIDA Annex # 1 to EU- GMP 2009 USP <1116> Microbiological EvaluaBon of Clean Rooms and other Controlled Environments USP <1072> Disinfectants and AnBsepBcs Guidance for Industry Sterile Drug Products Produced by AsepBc Processing cgmp 2004 PDA Technical Report No. 13 Fundamentals of an Environmental Monitoring Program 2001 ISO Cleanrooms and associated controlled environments ClassificaBon of air cleanliness ISO Cleanrooms and associated controlled environments BiocontaminaBon control General principles and methods 2003
5 CLEANING AND SANITIZATION PROGRAM The cleaning and sanibzabon program must achieve specified cleanliness standards, control microbial contaminabon of products, and be designed to prevent the chemical contaminabon of pharmaceubcal ingredients, product- contact equipment, packaging materials, and ulbmately the drug products. The suitability, efficacy, and limitabons of sanibzing agents and procedures should be assessed. The effecbveness of these sanibzing agents and procedures should be measured by their ability to ensure that potenbal contaminants are adequately removed from surfaces (i.e. via obtaining samples before and aeer sanibzabon). RouBnely used disinfectants should be effecbve against the normal microbial vegetabve flora recovered from the facility. Disinfectants and an:sep:cs <1072> USP 36-
6 Introduzione Ø La contaminazione microbica delle aree a contaminazione controllata è un aspetto fondamentale da tenere sotto controllo per garantire la purezza, la qualità e la sicurezza di una produzione farmaceutica. Ø Primo passo per impostare un corretto programma di convalida delle pulizie per aree a contaminazione controllata è la qualifica delle soluzioni sanitizzanti che verranno utilizzate per le varie operazioni di pulizia. Ø Da tali studi verrà estrapolato inoltre il tempo di contatto necessario da applicare sulle superfici durante le procedure di Cleaning. Ø La qualifica normalmente si basa sulla verifica dell attività di base, dell attività con sostanze interferenti e su test di superficie in cui viene valutata operativamente l efficacia del sanitizzante nelle condizioni di utilizzo.
7 Ø Ad oggi sono disponibili norme ISO/EN e USP a cui fare riferimento per una corretta impostazione del lavoro di qualifica, naturalmente alcune norme sono indirizzate a produttori di soluzioni sanitizzanti per cui per uno scopo prettamente farmaceutico queste devono essere interpretate al fine di ottenere il risultato atteso. E infatti un punto fondamentale la valutazione dell efficacia dei prodotti sanitizzanti sia sulla flora microbica isolata all interno delle aree a contaminazione controllata sia verso le superfici presenti nel reparto produttivo. Ø Obiettivo è quindi fornire agli utenti le corrette indicazioni per la scelta dei prodotti sanitizzanti, per programmare e gestire la loro qualifica e consentirne un utilizzo che sia in conformità ai requisiti GMP.
8 " " <1072> Disinfectants and Antiseptics, USP 36" Introduction Definitions Classification of disinfectants Selection of disinfectant for use in a Pharmaceutical Manufacturing Environment Mechanism of disinfectant activity Microbial resistance to disinfectants Disinfectant challenge testing Disinfectants in a cleaning and sanitization program
9 Definizioni Disinfettante/Sanitizzante: Un agente chimico che distrugge i microrganismi nella forma vegetativa e microrganismi patogeni, ma non necessariamente le loro spore, quando applicato ad una superficie. Riduzione della vitalità maggiore di 5 e 4 logaritmi nei test in vitro Norme «EN». Sporicida e gli antivirali possono essere considerati una speciale classe di disinfettanti. Sporicida: Prodotto che distrugge le spore di batteri e funghi quando ad una sufficiente concentrazione e con un determinato tempo contatto viene applicato su una superficie Riduzione della vitalità maggiore di 3 logaritmi nei test in vitro Norme «EN». Agente Sterilizzante: Un agente che distrugge tutte le forme di microrganismi e le loro spore. Riduzione della vitalità maggiore di 6 logaritmi.
10 Criteri di scelta per uso per ambito pharma Quando selezioniamo un disinfettante per aree di produzione farmaceutiche, dobbiamo tenere in considerazione i diversi aspetti: Meccanismo di azione ph Temperatura Concentrazione Tempo di contatto Qualità acqua Presenza di materiale organico Natura della superficie da trattare
11 Criteri di scelta per uso per ambito pharma Resistenza microbica (rotazione) Tossicità Possibilità di corrodere i materiali Facilità di applicazione Compatibilità con agenti di pulizia o con altri disinfettanti Sterilità Shelf-life Documentazione di supporto Validazione
12 Convalida efficacia " <1072> Disinfectants and Antiseptics, USP 36 Disinfectant Challenge testing use-dilution tests (screening disinfectants for their efficacy at various concentrations and contact times against a wide range of standard test organisms and environmental isolates) surface challenge tests (using standard test microorganisms and microorganisms that are typical environmental isolates, applying disinfectants to surfaces at the selected use concentration with a specified contact time, and determining the log reduction of the challenge microorganisms) and a statistical comparison of the frequency of isolation prior to and after the implementation of new disinfectant.
13 Test in vitro: Use- diluition test " A questa categoria appartengono tutti quei test che servono ad effettuare uno screening sui prodotti per verificarne l efficacia a varie concentrazioni e a diversi tempi di contatto. Questi test vogliono dimostrare la capacità di una soluzione disinfettante di svolgere attività battericida, fungicida, sporicida nelle condizioni di uso anche in presenza di sostanze interferenti. Per le verifiche delle attività di base è necessaria e sufficiente la documentazione del produttore.
14 " Efficacia in vitro Verificare l attività battericida in accordo con EN 1276 Criterio di accettazione: Riduzione di almeno 10^5 nella conta vitale Verificare l attività fungicida in accordo con EN 1650 Criterio di accettazione: Riduzione di almeno 10^4 nella conta vitale Verificare l attività sporicida in accordo con EN Criterio di accettazione: Riduzione di almeno 10^3 nella conta vitale
15 AOAC Official Method" Test qualitativi (test in vitro)" Battericida: Use diluition method # Fungicida: Fungicidal activity of disinfectants # Sporicida: Sporicidal Activity of disinfectants #
16 Surface challenge test (1)" Verificare l attività battericida, fungicida, sporicida dei disinfettanti nelle condizioni di uso Criterio di accettazione Una soluzione disinfettante può definirsi battericida e fungicida qualora si sia ottenuto, dopo il tempo di contatto tra disinfettante e batteri, una riduzione di almeno 10^3 nella conta vitale. Si può definire sporicida se la riduzione è di almeno 10^2 nella conta vitale. <1072> Disinfectants and Antiseptics, USP 36
17 Surface Challenge test (2)" Superfici presenti nelle aree di lavorazione
18 Microrganismi Per gli studi si utilizzano i seguenti microrganismi: Microrganismi richiesti dalle normative (EN o AOAC) Isolati ambientali Tutti i generi microbici riscontrati nell ambiente produttivo Gli isolati più frequenti I più resistenti da distruggere
19 Microrganismi Microrganismi ATCC Isolati ambientali Battericida: Escherichia coli Micrococcus luteus/lylae Sthapylococcus aureus 6538 S. epidermidis/hominis Pseudomonas aeruginosa Flavobacterium resinovorum Cellulomonas flavigena Fungicida Candida albicans Rhodotorula mucillaginosa P. chrysogenum Aspergillus niger A. niger Sporicida Bacillus subtilis 6633 B. sphaericus/thurengensis cereus/pumilus
20 Test di efficacia sulle superfici DESCRIZIONE DEL METODO La condizione d uso è una variabile che influenza l efficacia del disinfettante. Le altre due variabili, già validate nel test in vitro sono la concentrazione ed il tempo di contatto. La modalità di applicazione può essere solo nebulizzazione oppure nebulizzazione più azione meccanica. I test verranno eseguiti effettuando solo nebulizzazione, in quanto questa è la modalità worst-case. La prova simulerà le condizioni di utilizzo facendo uso di: Superfici dello stesso tipo di quelle presenti nei reparti di produzione: Acciaio 316L, PVC, vetro, alluminio, plexiglass, nobilitato. I batteri/miceti utilizzati per le prove descritte nel presente protocollo saranno Ceppi Standard ATCC e ceppo isolato Disinfettante alla concentrazione d uso ed al tempo di contatto di 15 minuti.
21 Test di efficacia sulle superfici CRITERIO DI ACCETTAZIONE L attività battericida/fungicida di un disinfettante su una superficie è caratterizzata dalla concentrazione del disinfettante e dal tempo di contatto che permette una riduzione di vitalità R 10 3, secondo quanto riportato nel capitolo <1072> di USP. Pertanto l obiettivo del protocollo verrà raggiunto se, ai parametri di concentrazione e tempo di contatto riportati al punto 6, il disinfettante riuscirà ad ottenere una riduzione di vitalità dei microrganismi test 10 3 su tutte le superfici per i batteri e miceti.
22 CONDUZIONE DEI TEST" Ø PROVA ATTIVITÀ BATTERICIDA/FUNGICIDA: TEST NELLE CONDIZIONI D USO Ø TEST DI CONTROLLO (SUPERFICI NON TRATTATE) Ø VALIDAZIONE DEL METODO DI FILTRAZIONE SU MEMBRANA
23 Prova attività battericida/fungicida Lavare ciascuna membrana con 50 ml di acqua sterile. Dopo la filtrazione rimuovere ciascuna unità filtrante e trasferirla su piastre Petri contenenti terreno TSA + neutralizzante per i batteri e SDA + neutralizzante per i miceti, in modo che non si formino bolle tra il filtro e il terreno di coltura. Chiudere le piastre con il coperchio. Incubare le piastre a C per 48 ore per i batteri e a C per 72 ore per i miceti. Calcolare il numero di UFC/0,1ml della sospensione test (Nc) ottenuto nel punto 2 e il numero di UFC/0,1ml ottenuto dopo il processo di filtrazione (C). Calcolare il recovery come segue: C (average) R = X 100 Nc (average)
24 Prova attività battericida/fungicida Prelevare 100µl della sospensione preparata al punto 1. Depositare all interno del quadrato 6 x 6 cm 100 µl della soluzione contenente il microrganismo da recuperare, facendo attenzione a ricoprire in modo uniforme tutta la superficie interna al quadrato. Lasciare asciugare la superficie così sporcata per 5 minuti sotto cappa a flusso laminare. Spruzzare la superficie, inquinata con il microrganismo, con il disinfettante (400µl) in modo da coprire tutta la superficie selezionata ed attendere il tempo minimo di contatto di 15 minuti. Trascorso il tempo di contatto recuperare i microrganismi inoculati usando la tecnica del tampone inumidito in soluzione fisiologica con Tween 80 al 2%. Il tampone, verrà immerso nel solvente da utilizzare e premuto contro la parete del contenitore per eliminare l eccesso di liquido. Successivamente il tampone verrà fatto muovere, facendo attenzione a fare aderire completamente una faccia sulla superficie da campionare, orizzontalmente da sinistra verso destra lungo l area di campionamento per un numero di volte sufficienti a coprire l intera area da campionare; l ultimo movimento deve essere fatto sulla destra dell area e perpendicolarmente ai precedenti per raccogliere l eventuale accumulo di prodotto. Le stesse operazioni dovranno essere ripetute utilizzando l altra faccia del tampone ed eseguendo i movimenti in senso verticale lungo l area di campionamento.
25 Prova attività battericida/fungicida" Recuperato il campione immergere il tampone in una provetta contenente 10 ml di soluzione fisiologica con Tween 80 al 2%. Vortexare la provetta per 2 minuti. Filtrare immediatamente il contenuto della provetta su membrana filtrante (0,45 µm); il tempo di filtrazione non deve superare 1 minuto. Lavare la membrana con 100 ml di diluente di lavaggio e con 50 ml di acqua sterile. Dopo la filtrazione rimuovere l unità filtrante e trasferirla su piastre Petri contenenti terreno TSA + neutralizzante per i batteri e su piastre Petri contenenti terreni SDA + neutralizzante per i miceti in modo che non si formino bolle tra il filtro e il terreno di coltura. Chiudere le piastre con il coperchio. Incubare le piastre a C per 48 ore per i batteri, a C per 72h per le muffe e il lievito. Per ciascuna piastra determinare il numero di colonie (Na) di UFC/36 cm2 della miscela sottoposta a prova.
26 Valutazione dei risultati Registrare per ciascun microrganismo testato il numero di UFC presenti sulla lastra di partenza: Test di controllo (Nv), ed il numero di UFC riscontrato dopo la verifica dell attività battericida/fungicida (Na). Calcolare la riduzione della vitalità del microrganismo utilizzato per il test su ciascuna superficie, applicando la seguente formula: R (riduzione di vitalità) = Nv Na In ogni prova il risultato deve essere conforme, non è accettato l approccio della media
27 Criterio d accettazione 1) L attività battericida/fungicida espressa come riduzione logaritmica della vitalità (R) deve essere ) I controlli in piastra devono confermare la carica degli inoculi. 3) I controlli negativi devono essere negativi. 4) La validazione del metodo deve essere compresa tra % oppure > 70%.
28 Contatti Eurofins CTP Laboratories Siena, Italy Via Reno 2, 53036, Poggibonsi Tel: Fax: Web: -
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