Caratterizzazione chimica della farina ottenuta dopo la spremitura a freddo dei semi di Cannabis sativa L.

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1 Caratterizzazione chimica della farina ottenuta dopo la spremitura a freddo dei semi di Cannabis sativa L. L. Folegatti P. Rovellini* D. Baglio S. De Cesarei P. Fusari S. Venturini A. Cavalieri 1 INNOVHUB-SSI Azienda Speciale della Camera di Commercio di Milano Divisione SSOG - Milano 1 ATI Consulting - Milano (*) CORRISPONDENZA AUTORE: Dr.ssa Pierangela Rovellini Tel Fax pierangela.rovellini@mi.camcom.it Il presente lavoro riporta i risultati dello studio sulla caratterizzazione chimica della farina ottenuta dopo la spremitura a freddo dei semi di canapa (Cannabis sativa L.). Questa pianta è coltivata da anni per la produzione di fibre e di semi da cui si estrae un olio le cui proprietà nutrizionali sono state ampiamente studiate per i loro effetti benefici sulla salute. Un sottoprodotto dell estrazione dell olio dai semi è rappresentato dalla farina, la quale trova impieghi in campo alimentare e mangimistico. La caratterizzazione chimica della farina è stata eseguita analizzando i principali parametri nutrizionali (proteine, sostanza grassa, umidità, ceneri, fibre totali e carboidrati), il profilo amminoacidico e il contenuto in vitamine, fenoli e pigmenti (clorofille e carotenoidi). In particolare si è osservato come la farina sia ricca di sostanze proteiche (29.4%), abbia un residuo di olio del 10.1%, un contenuto elevato di fibra grezza (30.8%), costituita da cellulosa e in parte da emicellulose e lignina e una discreta quantità di carboidrati totali (13.3%). Gli zuccheri totali riducenti dopo inversione rappresentano il 3.4%, espressi come glucosio. Le ceneri costituiscono il 7.1% e rappresentano i sali minerali presenti. La fibra NDF (36.9%) rappresenta una quota elevata nella farina di canapa, così come la fibra ADF (21.6%), il contenuto di emicellulose (15.3%) e di cellulosa (20.6%), mentre è basso il contenuto di lignina (1.0%). La farina di canapa contiene un elevata quantità di proteine facilmente digeribili che forniscono quasi tutti gli amminoacidi essenziali per l alimentazione umana ed animale, con eccezione della lisina, la quale è l amminoacido limitante anche nel caso di altri semi oleaginosi. Inoltre la farina di canapa, rispetto ad altre proteine vegetali, è un ottima fonte di arginina (108.1 mg/100 g proteine), la cui elevata presenza favorisce la canapa come supplemento di questo amminoacido per bambini di età inferiore a 1 anno e non contiene glutine. Nel campione in analisi è stata riscontrata la presenza di luteina (9 mg/kg) ma non di beta-carotene e di un buon contenuto di pigmenti clorofilliani (352.8 mg/kg). Il contenuto di vitamina E nella farina, senza procedura di saponificazione, è risultato essere notevolmente ridotto rispetto a quanto riscontrato nell olio: 138 mg/kg contro un valore di 928 mg/kg. La farina è risultata essere ricca in composti fenolici (256 mg/kg) e sono stati individuati alcuni acidi fenolici quali il caffeico, il ferulico, il diidrossibenzoico e i loro derivati. Nella farina di canapa è stata riscontrata e quantificata la presenza delle vitamine A, D2 (ergocalciferolo), K1, coenzima Q10, ubichinolo Q10, coenzima Q9, ubichinolo Q9, e vitamina B3 (acido nicotinico e nicotinammide), B1, B2 (quest ultima in quantità elevata), B5, B6, C (in quantità elevata) e acido citrico. Chemical characterization of the flour obtained after cold pressing of Cannabis sativa L. seed This paper reports the results of the study on the chemical characterization of the flour 3

2 4 obtained after cold pressing of hemp seeds (Cannabis sativa L.). This plant has been cultivated for years for the production of fibers and seeds from which oil is extracted whose nutritional properties have been extensively studied for their beneficial health effects. A by-product of the extraction of the oil from the seeds is represented by the flour, which has several food and feed applications. The chemical characterization of the flour was performed by analyzing the main nutritional parameters (protein, fat, moisture, ash, fiber and total carbohydrates), the amino acid profile and the content of vitamins, phenols and pigments (chlorophylls and carotenoids). In particular, it is observed that the flour is rich in protein (29.4%), has a residual oil content of 10.1%, a high content of crude fiber (30.8%), made by cellulose and in part by hemicelluloses and lignin, and a fair amount of total carbohydrates (13.3%). The total reducing sugars after inversion represent 3.4%, expressed as glucose. The ashes are 7.1% and represent the mineral contents. The fiber NDF (36.9%) represents a high proportion in the hemp flour, as well as the fiber ADF (21.6%), the hemicellulose (15.3%) and cellulose (20.6%), while the lignin is low (1.0%). The hemp flour contains a large amount of easily digestible proteins that provide almost all the amino acids essential for human and animal nutrition, with the exception of lysine, which is the limiting amino acid even in the case of other oilseeds. In addition, hemp flour, compared to other vegetable protein, is an excellent source of arginine (108.1 mg/100 g protein), whose high presence promotes hemp as a supplement of this amino acid for children less than 1-year-old and it does not contain gluten. In the hemp flour there was found the presence of lutein (9 mg/kg) but not beta -carotene and a good amount of chlorophyll pigments (352.8 mg/kg). The content of vitamin E in the flour, without the saponification procedure, was found to be significantly reduced compared to that found in the oil: 138 mg/kg against a value of 928 mg/kg. The flour was rich in phenolic compounds (256 mg/kg) and phenolic acids such as caffeic, ferulic and the dihydroxybenzoic acid, together with their derivatives were identified. In the hemp flour there were observed and quantified the presence of vitamins A, D2 (ergocalciferol), K1, coenzyme Q10, ubiquinol Q10, coenzyme Q9, ubiquinol Q9 and vitamin B3 (nicotinic acid and nicotinammide), B1, B2 (in high amount), B5, B6, C (in high amount) and citric acid.

3 INTRODUZIONE La Cannabis sativa è una delle piante più antiche conosciute nella medicina e una di quelle più studiate dal punto di vista fitochimico e fornisce da millenni un ottima fibra tessile [1-9]. La coltura della canapa per usi tessili ha un antica tradizione in Italia, veniva usata fin dall antichità per tessuti resistenti e cordame, oltre che per la produzione di carta. In passato la coltivazione agricola della canapa era comune nelle zone mediterranee e centro europee. Anzitutto perché questa pianta cresceva su terreni difficili da coltivare con altre piante industriali (terreni sabbiosi e zone paludose nelle pianure dei fiumi), inoltre perché vi era una forte richiesta di piante così polivalenti e a buon mercato; infatti la canapa era utile per produrre sostanze oleose (per l illuminazione), fibrose (fibre tessili, carta, corda) e mangime per il bestiame produttivo. I semi costituiscono un importante prodotto impiegato per l estrazione di olio mediante processi di spremitura a freddo, e possono essere utilizzati, una volta decorticati, nel campo alimentare sia ad uso umano che animale. I semi di canapa contengono il 20-25% di proteine che forniscono i nove amminoacidi essenziali per l alimentazione umana, 20-30% di carboidrati, 25-35% di olio e 10-15% di fibre insolubili e sono particolarmente ricchi in minerali. L olio di canapa trova svariati utilizzi nel settore degli inchiostri, delle vernici, della detergenza e dei saponi, mentre nel campo cosmetico la presenza di acido γ-linolenico lo rende ideale quale olio per il corpo e come ingrediente di creme cosmetiche con alta capacità penetrante nella pelle. Inoltre gli oli ottenuti per pressatura a freddo possono ritenere molti componenti benefici dei semi compresi gli antiossidanti naturali [10]. Dal punto di vista nutrizionale una delle sue caratteristiche peculiari è il rapporto ideale di 3:1 tra gli acidi grassi polinsaturi linoleico (ω 6) e linolenico (ω 3). La farina di canapa è il prodotto ottenuto dopo la spremitura dell olio dai semi ed è un'eccezionale materia prima per la preparazione di prodotti ad elevato profilo nutrizionale. Il motivo per cui questa farina è così pregiata risiede nella sua composizione nutritiva che è determinata da un contenuto elevato di proteine, fibre e grassi. Contiene inoltre vitamine E, B1 e B2, sali minerali e fitosteroli e non contiene glutine. Quest ultima peculiarità rende la farina di canapa ideale per la preparazione di prodotti adatti a soggetti celiaci. Essa trova impieghi anche nell alimentazione animale come fonte proteica in sostituzione alle farine ottenute dai più comuni semi oleaginosi (soia, colza e girasole). La canapa è conosciuta per il suo contenuto di composti psicoattivi quali i cannabinoidi ed in particolare il tetraidrocannabinolo (δ 9-THC) [5], la cui presenza ha provocato il divieto della sua coltivazione in Europa e nel Nord America a partire dal In Italia la coltivazione industriale è consentita dalla circolare ministeriale del MIPAF n. 1 prot. 200 del 8 maggio 2002, limitata a varietà di canapa certificata, appositamente selezionate per avere un contenuto trascurabile di THC (inferiore allo 0.2%) [11-12]. Il presente articolo riassume gli ultimi risultati ottenuti nell ambito di un progetto di ricerca avente lo scopo di caratterizzare chimicamente sia l olio che la farina ottenuti dalla spremitura a freddo dei semi di canapa. La caratterizzazione chimica dell olio di canapa è stata oggetto di una precedente pubblicazione [13], come anche le analisi dei principali contaminanti (micotossine, ftalati, idrocarburi policiclici aromatici, metalli e residui di fitofarmaci) ricercati sia sull olio che sulla farina di canapa [14]. In questo studio, la farina ottenuta dopo la spremitura a freddo dei semi di canapa è stata caratterizzata 5 Tabella I - Parametri e metodi utilizzati per la caratterizzazione della farina di canapa Parametri chimici Metodo di analisi Sostanza grassa previa idrolisi acida UNI 22605:1992 Umidità e sostanze volatili UNI 22601:1992 Protidi grezzi UNI 22604:1992 Ceneri totali UNI 22602:1992 Fibra grezza (metodo Weende) UNI 22606:1992 Fibra al detergente neutro (NDF) Secondo Van Soest [26-28] Fibra al detergente acido (ADF) Secondo Van Soest [26-28] Lignina al detergente acido (ADL) Secondo Van Soest [26-28] Zuccheri totali riducenti dopo inversione UNI 22608:1992 Amminoacidi totali dopo idrolisi acida UNI 22614: UNI 22615:1992 Amminoacidi Solforati (Cisteina e Metionina) UNI 22619: UNI22621:2000 Triptofano UNI 22618: UNI 22620:2000 Clorofille e Pirofeofitine HPLC-PDA / DGF C-VI-15 Carotenoidi Metodo interno per HPLC-PDA Screening multivitaminico Metodo interno per HPLC-PDA-MS Tocoferoli, Tocotrienoli e Tocoferoli ossidati HPLC-PDA [15] Screening Fenoli/Acidi Fenolici/Flavonoidi/Antocianine HPLC-PDA [16]

4 6 chimicamente analizzando i principali parametri nutrizionali (proteine, sostanza grassa, umidità, ceneri, fibre totali e carboidrati). Inoltre è stato determinato il profilo amminoacidico e il contenuto in vitamine, fenoli e pigmenti (clorofille e carotenoidi). PARTE SPERIMENTALE CAMPIONI Il campione costituito dai semi di canapa è stato decorticato e pressato a freddo, ottenendo da una parte l olio e dall altra un panello da cui poi è stato ottenuto per macinazione un campione di farina. La resa di estrazione dell olio è risultata essere di 10.1%. La farina ottenuta dal panello proteico oggetto dello studio aveva un colore grigio-verdastro, un odore tipico della pianta, una granulometria omogenea e una consistenza fine. METODI DI ANALISI Nella Tabella I sono elencati i parametri ed i metodi utilizzati per la caratterizzazione della farina di canapa. RISULTATI E DISCUSSIONE SOSTANZA GRASSA, PROTEINE, UMIDITÀ, CENERI, FIBRA TOTALE E CARBOIDRATI Dai dati riportati in letteratura i semi di canapa contengono circa il 36% di olio, il 25% di proteine, il 6% di ceneri e il 30% di carboidrati totali compresi del valore della fibra [2]. In Tabella II vengono riportati i valori relativi alla composizione nutrizionale della farina di canapa in confronto con i valori riportati dalla letteratura. I dati relativi alla farina di canapa si riferiscono alla media di due determinazioni indipendenti. Come si può notare dai dati riportati nella Tabella II i valori della composizione nutrizionale della farina di canapa oggetto dello studio sono in linea con i dati medi forniti dalla letteratura riferiti ad altre cultivar. In particolare si osserva come la farina sia abbastanza ricca di sostanze proteiche (29.4%), abbia un residuo di olio del 10.1%, un contenuto elevato di fibra grezza (30.8%), costituita da cellulosa e in parte da emicellulose e lignina, e una discreta quantità di carboidrati totali. Le ceneri costituiscono il 7.1% e rappresentano i sali minerali presenti. I carboidrati totali sono stati calcolati per differenza tra tutti i componenti (100 - % umidità - % proteine - % grassi - % ceneri - % fibra grezza) e sono costituiti da amido e da altri zuccheri. Essi sono assimilabili agli estrattivi inazotati come normalmente vengono definiti. In alcuni casi in letteratura i carboidrati totali si ritrovano come somma della fibra, dell amido e degli zuccheri e sono determinati dalla differenza (100 - % umidità - % ceneri - % proteine - % sostanza grassa) [17]. Nella farina di canapa i carboidrati totali sono risultati pari a 13.3% e costituiscono circa il 30% della fibra totale calcolata come somma dei carboidrati totali e della fibra grezza. Rispetto al valore trovato (13.3%) gli zuccheri totali riducenti dopo inversione rappresentano il 3.4%, espressi come glucosio. Nella canapa la composizione dei polisaccaridi diversi dall amido comprende principalmente glucosio e xilosio, che rappresentano ciascuno il 40% della frazione totale, più altri zuccheri presenti in minore percentuale, come l arabinosio, il mannosio, il galattosio e il ramnosio. In genere nei prodotti alimentari viene calcolato il valore della fibra definita come fibra totale dietetica o alimentare derivante dalla somma di una fibra insolubile e di una solubile, come nel panello di canapa della varietà Finola [2]. I costituenti della fibra insolubile sono rappresentati da cellulosa, emicellulose e lignina in grado di assorbire acqua, mentre i costituenti solubili sono formati da oligosaccaridi e polisaccaridi, in maggior misura fermentabili, che si differenziano per la lunghezza delle loro catene, delle loro ramificazioni e per la presenza di gruppi funzionali diversi. La fibra alimentare pur non potendosi considerare un nutriente in quanto priva di valore nutrizionale per l uomo, svolge una serie di funzioni che comprendono l aumento del senso di sazietà, il miglioramento della funzionalità intestinale, la riduzione del rischio per importanti malattie cronico-degenerative (quali i tumori al colon-retto) che la rendono un importante componente della dieta umana. In base alla sua composizione nutrizionale la farina di canapa trova impiego in ambito alimentare sia per la quantità e qualità delle proteine vegetali, sia per il suo Tabella II Composizione nutrizionale della farina di canapa Parametro (in studio) vc Finola [2] * Calcolati per differenza tra tutti i componenti, ** Nel calcolo sono incluse le fibre, *** Fibra totale dietetica vc Crag,Finola [17] Sostanza grassa % Proteine (% N x 6.25) Umidità % Ceneri totali % Fibra grezza % Carboidrati totali % 13.3 * 42.6 *** 37.5 **

5 Tabella III Composizione fibrosa dei panelli di diverse varietà di canapa Parametro vc Finola [17] vc Crag [17] vc USO 31 [17] vc USO 14 [17] NDF % NDS (100-NDF) % ADF % NDF-ADF % (Emicellulose) ADL % (Lignina) ADF-ADL % (Cellulosa) Silice + ceneri insolubili % contenuto di carboidrati e di fibra. Il contenuto di acqua è molto importante ai fini della conservabilità della farina, soprattutto quando contiene una percentuale abbastanza significativa di sostanza grassa residua. L umidità rilevata nella farina oggetto del nostro studio è pari al 9.3%, maggiore di quella riscontrata nella letteratura in farine della stessa natura. Per una buona conservabilità il contenuto di umidità non dovrebbe superare l 11%. Infatti la farina di canapa tende ad ammuffire facilmente a causa della sua struttura costellata di piccole cavità e di bolle d aria all interno delle quali si sviluppano le muffe [3]. Anche la presenza di una discreta quantità di olio residuo (10.1%) nella farina pregiudica lo stato di conservazione del prodotto in quanto l olio, per l elevato contenuto in acidi grassi polinsaturi, irrancidisce facilmente e, se non conservato in condizioni ambientali protette, potrebbe generare un odore forte e sgradevole ed una consistenza molle e collosa del prodotto. FIBRE Vi sono vari modi di valutare la fibra vegetale che rappresenta la parte meno digeribile di un alimento ed è costituita dai carboidrati complessi che compongono il materiale fibroso e non fibroso della cellula vegetale. La fibra nella farina di canapa è stata valutata con due differenti metodologie. Il metodo ufficiale è quello di Weende che determina la fibra grezza nelle sostanze proteiche vegetali per solubilizzazione dei composti non cellulosici per trattamenti successivi con soluzioni di acido solforico e idrossido di potassio. Il residuo è costituito in prevalenza da cellulosa e lignina. Il metodo non fornisce un reale contenuto della fibra nel prodotto, in quanto sottostima alcune componenti (emicellulose). Il metodo di Van Soest [26-28] o sistema delle frazioni fibrose consente una migliore classificazione dei componenti delle pareti cellulari nelle sostanze proteiche vegetali. La fibra viene determinata nelle tre componenti come: fibra al detergente neutro (NDF), fibra al detergente acido (ADF) e lignina al detergente acido (ADL). In Tabella III sono riportati i valori delle componenti fibrose della farina di canapa confrontati con i valori ricavati dalla letteratura su farine di canapa di alcune cultivar quali Crag e Finola utilizzate principalmente per la produzione di semi e USO 31 e USO 14 impiegate per la produzione sia di semi che di fibre. Come si può notare le varie componenti fibrose variano in funzione delle diverse cultivar e del tipo di utilizzo al quale la coltivazione è destinata. In particolare i valori di NDF, ADF e di emicellulose trovati nella farina di canapa sono in accordo sia con le varietà impiegate principalmente per la produzione di semi sia con quelle impiegate per la produzione di fibre e semi. La fibra NDF (36.9%) rappresenta una quota elevata nella farina di canapa, così come la fibra ADF (21.6%), il contenuto di emicellulose (15.3%) e di cellulosa (20.6%), mentre è basso il contenuto di lignina (1.0%). Ai fini dell alimentazione animale l elevato contenuto di fibra grezza fornisce alla farina una quantità di principi digeribili non superiore al 40% e quindi una digeribilità ridotta. Nonostante la scarsa digeribilità le farine di canapa hanno un discreto contenuto di proteina digeribile (circa 80%) che li rende adatti all alimentazione di alcune specie animali come le pecore, le capre e i cavalli e meno adatti all alimentazione dei suini [3]. Alcuni studi riportano benefici dell impiego del panello di canapa per l alimentazione delle galline ovaiole per la presenza degli acidi grassi omega 3 e 6 nelle uova prodotte e dei mangimi per i pesci d allevamento [2]. PROTEINE E AMMINOACIDI I semi di canapa contengono dal 25 al 30% di proteine grezze, con valori variabili a seconda del tipo di cultivar. In Tabella IV sono riportati i contenuti delle Tabella IV Proteine grezze nei semi di canapa di diverse varietà Campione % Proteine (g/100 g di campione) Canapa (campione di studio) 29.4 Canapa vc Finola (farina) [2] 33.5 Canapa vc Finola (seme intero) [2] 24.8 Canapa vc Unika-b (seme intero) [17] 24.9 Canapa vc Uso 31 (seme intero) [17] 23.7 Canapa vc Uso 14 (seme intero) [17] 22.7 Canapa vc Finola (seme intero) [17] 23.0 Canapa vc. Crag (seme intero) [17]

6 8 proteine nel campione in esame e come paragone alcuni valori riportati in letteratura per le differenti cultivar. Come si può notare, il contenuto di proteine del campione da noi analizzato è comparabile con quello riportato in letteratura per la farina di canapa. Esso è maggiore rispetto al contenuto di proteine nei semi interi e ciò è dovuto al fatto che il seme contiene ancora l olio che agisce da fattore diluente per il calcolo delle proteine, abbassandone quindi il valore. Al fine di classificare il contenuto proteico della canapa, esso è messo a confronto con le proteine contenute nei vari panelli di semi oleaginosi. I dati mostrano come la canapa abbia un contenuto di proteine maggiore rispetto a semi quali la colza (26.7%) e il girasole (23.3%) ma inferiore rispetto alla soia (42.1%). Infatti la soia è ritenuta la principale fonte di proteine vegetali, la cui composizione è molto vicina a quella degli alimenti di origine animale. C è da notare che mentre la soia contiene fattori anti-nutrizionali, quali gli inibitori della tripsina che richiedono trattamenti termici del prodotto per la loro eliminazione, la canapa ne contiene una quantità inferiore, rendendo quindi le sue proteine più digeribili. Tutte le proteine contengono approssimativamente 20 amminoacidi. Il metodo di analisi per la determinazione degli amminoacidi totali prevede un trattamento del campione con acido cloridrico concentrato in stufa a 110 C per 24 ore. Durante questa reazione, la glutammina è convertita in acido glutammico e l asparagina in acido aspartico, riducendo quindi il numero totale di amminoacidi determinabili a 18. Inoltre gli amminoacidi solforati (metionina e cisteina) sono prima sottoposti ad ossidazione con acido performico in quanto l idrolisi acida provoca una degradazione degli stessi. Per lo stesso motivo, il triptofano è stato determinato mediante idrolisi basica con una soluzione concentrata di idrossido di sodio, in stufa a 110 C per 20 ore. In Tabella V sono riportati i valori di amminoacidi determinati sul campione in esame, espressi come g di amminoacido/100 g di campione, e una composizione amminoacidica di un seme di canapa riportata in letteratura, come confronto. Come si può notare, il contenuto di amminoacidi nel campione di canapa analizzato è in perfetta corrispondenza con i dati riportati in letteratura. Gli amminoacidi si possono classificare in essenziali e non-essenziali sulla base della capacità del corpo umano di sintetizzarli. Gli amminoacidi essenziali sono quelli che il corpo non è in grado di sintetizzare autonomamente e quindi devono essere introdotti con la dieta. Essi sono: istidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina+cisteina (amminoacidi solforati), fenilalanina+tirosina (amminoacidi aromatici), treonina, triptofano e valina. Come si può notare dai dati della Tabella V, la canapa contiene tutti gli amminoacidi essenziali richiesti per l alimentazione umana. A tale riguardo, la FAO e l organizzazione mondiale della sanità (WHO) hanno predisposto delle tabelle in cui sono riportati i fabbisogni degli amminoacidi essenziali per fasce di età della popolazione. In particolare, i bambini di età inferiore a 1 anno hanno requisiti nutrizionali critici dovuti alla loro rapida crescita e all immaturità del loro apparato gastrointestinale e Tabella V Contenuto di amminoacidi nella farina di canapa Amminoacido Canapa (in studio) % Canapa [2] % Acido aspartico Treonina Serina Acido glutammico Glicina Alanina Cisteina Valina Metionina Isoleucina Leucina Tirosina Fenilalanina Istidina Lisina Arginina Prolina Triptofano Tabella VI Comparazione degli amminoacidi essenziali di alcuni semi oleaginosi con i valori raccomandati dalla FAO/WHO Amminoacido (Valori espressi in mg/100 g di proteine) Canapa Colza Girasole Soia Bambini 1 anno Valori raccomandati dalla FAO/WHO Bambini 2-5 anni Ragazzi anni Cisteina + Metionina Fenilalanina + Tirosina Isoleucina Leucina Valina Triptofano Lisina Treonina Istidina Adulti

7 per questo, oltre agli amminoacidi essenziali elencati sopra, si aggiunge anche l arginina. La fascia di età prescolare, da 2-5 anni, è solitamente quella presa come riferimento per la valutazione della qualità di una proteina in funzione del contenuto degli amminoacidi essenziali. In Tabella VI sono riportati i valori degli amminoacidi essenziali della farina di canapa e delle farine degli altri semi oleaginosi in confronto con i requisiti della FAO/WHO/UNU [18] per le varie fasce di età. Considerando la fascia di età prescolare, da 2 a 5 anni come riferimento, la canapa fornisce quasi tutti gli amminoacidi essenziali ad eccezione della lisina, che viene definito amminoacido limitante in quanto l alimento in questione non è in grado di fornire la quantità raccomandata di quello specifico amminoacido. Una possibile valutazione della qualità delle proteine contenute in un alimento è eseguita sulla base del rapporto tra gli amminoacidi essenziali di cui la proteina è composta e il valore raccomandato dalla FAO/ WHO; tale rapporto è definito Amino acid score. Valori uguali o superiori a 1 indicano che la quantità dell amminoacido in esame presente nell alimento è sufficiente a coprire le dosi raccomandate, al contrario valori inferiori a 1 sono indicativi del fatto che l amminoacido in esame non è presente in quantità sufficiente e che quindi è un fattore limitante. Il valore inferiore di Amino acid score è preso come rappresentativo per l intera proteina dell alimento. Nel caso della canapa e degli altri semi oleaginosi i valori degli Amino acid score sono riportati in Tabella VII. Essi sono stati calcolati prendendo la fascia di età prescolare come riferimento. Dai dati riportati si nota come la lisina è l amminoacido limitante per la canapa e per tutti gli altri semi oleaginosi, risultato confermato anche dai dati presenti in letteratura [17]. In generale, gli alimenti di origine animale hanno un Amino acid score elevato (ad esempio valori di circa 1.2 per le uova e la caseina), comportamento atteso dato il ruolo che hanno questi alimenti nella dieta. Per quanto riguarda le fonti di proteine vegetali, il valore di Amino acid score della canapa lo posiziona sopra i cereali (fiocchi d avena = 0.6 e frumento integrale = 0.45), mentre i semi oleaginosi hanno valori leggermente più elevati, come riscontrato anche dalle nostre analisi. Il calcolo dell Amino acid score può essere effettuato anche basandosi sui valori amminoacidici raccomandati per l alimentazione animale. In letteratura studi indirizzati a questo scopo hanno evidenziato come la farina di canapa può essere favorevolmente impiegata nell alimentazione di ruminanti e pollame in quanto fornisce tutti gli amminoacidi essenziali e proteine facilmente digeribili. La carenza di lisina può essere facilmente compensata con miscele contenenti ad esempio leguminose, migliorando così il valore dell Amino acid score della miscela. Tabella VII Amino acid score per i semi oleaginosi Amminoacido Canapa Colza Girasole Soia Cisteina + Metionina Fenilalanina + Tirosina Isoleucina Leucina Valina Triptofano Lisina Treonina Istidina Tabella VIII - Composizione in carotenoidi e clorofille della farina di canapa Caroteni Concentrazione Luteina 9 Caroteni totali 26 Clorofilla e derivati Concentrazione Clorofilla A 5.3 Feofitina B+B Feofitina A+A Pirofeofitina A 15.9 Totale Clorofilla A e derivati La farina di canapa contiene un elevata quantità di arginina rispetto agli altri semi oleaginosi. L arginina è un amminoacido limitante per i bambini di età inferiore a 1 anno in quanto essi non sono ancora in grado di sintetizzarla autonomamente e devono quindi assumerla con la dieta; negli adulti è un prodotto del ciclo dell urea. Inoltre, l arginina migliora anche alcune funzioni del sistema immunitario e muscolare. CAROTENOIDI E CLOROFILLE I carotenoidi sono sostanze naturali con numerosi ruoli biochimici, comprese le funzioni di recettori della luce e di fotoprotezione durante il processo della fotosintesi. A livello umano numerosi studi hanno relazionato il contenuto dei carotenoidi e l effetto protettivo contro lo sviluppo di alcune forme di cancro, la loro attività antiossidante e di quenching durante il meccanismo ossidativo. L analisi è stata condotta pesando 0.5 g di farina in un matraccio tarato da 10 ml, portando a volume con acetone e trattando in bagno ultrasuoni per 5 minuti. Un aliquota è stata filtrata su Nylon 0.45 µm prima di essere iniettata nel sistema HPLC-PDA, monitorando il profilo cromatografico a 455 nm. Il contenuto è stato espresso utilizzando il beta-carotene come standard esterno. Nella Tabella VIII vengono riportati i valori dei caroteni ottenuti espressi in mg/kg. Dall analisi del cromatogramma non è stata rivelata la presenza di beta-carotene ma solo di luteina. Vista l elevata intensità del colore verde della farina di canapa si è proceduto alla determinazione del contenuto in clorofilla, feofitine e pirofeofitina secondo un metodo interno di cromatografia liquida e rivelatore PDA registrando il cromatogramma a 410 nm. 9

8 10 Tabella IX - Composizione in tocoferoli della farina di canapa Composto Delta Tocoferolo 25 Beta + Gamma Tocoferolo 103 Alfa Tocoferolo 10 Totale tocoferoli 138 Alfa Tocoferilchinone 14 La farina (0.5 g) è stata estratta con acetone in bagno ad ultrasuoni e un aliquota è stata filtrata su filtri a siringa di tipo Nylon 0.45 µm ed iniettata nel sistema cromatografico. Il contenuto dei pigmenti rivelati è stato espresso in mg/kg utilizzando la clorofilla A come standard esterno. Nella Tabella VIII vengono riportati i valori ottenuti dalla media di due determinazioni indipendenti. E possibile osservare come il contenuto di queste sostanze sia di molto superiore nella farina (352.8 mg/kg) rispetto all olio (51.8 mg/kg) [13] e che in entrambe le tipologie la forma prevalente è costituita dalle Feofitine A+A1. Non sono stati trovati lavori bibliografici in letteratura che riportino i valori relativi a questi composti nella canapa, per poter effettuare dei confronti. TOCOFEROLI E TOCOTRIENOLI Questa classe di composti, ad alto valore antiossidante e vitaminico è composta da 8 forme naturali: delta, gamma, beta ed alfa-tocoferolo e dalle rispettive forme tocotrienoliche. Esse differiscono nella loro struttura chimica e nel grado di attività vitaminica. L alfa-tocoferolo è la sostanza con maggiore attività vitaminica e ad esso viene attribuito il valore di 1.0 [19]. Le forme tocoferoliche vengono comunemente indicate con il termine di Vitamina E e si tratta di sostanze labili e sensibili alla luce e all esposizione all aria. La presente analisi è stata condotta sulla farina di canapa pesando 0.5 g di quest ultima ed estraendoli con acetone in bagno ad ultrasuoni a temperatura ambiente e al buio. Il surnatante è stato filtrato su Nylon 0.45 µm prima dell iniezione cromatografica con rilevazione a 292 nm [15]. Nelle condizioni analitiche utilizzate, la forma beta non si separa dalla forma gamma, e quindi tali forme sono state considerate insieme; tutte le forme sono state espresse come alfa-tocoferolo. Il contenuto di vitamina E nella farina, senza procedura di saponificazione, è risultato essere notevolmente ridotto rispetto a quanto riscontrato nell olio: 138 mg/kg contro un valore di 928 mg/kg. Nella Tabella IX sono riportati i quantitativi ottenuti. In aggiunta, con la medesima metodologia è possibile quantificare anche l alfa-tocoferilchinone, un prodotto di ossidazione dell alfa-tocoferolo [20], monitorato a 268 nm. Esso è presente in piccole quantità nella farina di canapa (14 mg/kg). VITAMINE È stato eseguito uno screening relativo alla determinazione di altre vitamine oltre alla Vitamina E, alcune di natura idrofila (Vitamina B1, B2, B3 o PP, B5, B6, C, H, acido citrico, acido folico e acido lipoico), altre di natura lipofila (Vitamina A, D2, K1, Q10, Q9) mediante HPLC-MS/MS con interfaccia APCI e spettrometro di massa a trappola ionica. Per ciascuna vitamina sono state ottimizzate le condizioni di ionizzazione e di acquisizione in SRM (selective reaction monitoring), determinando i valori di LOD e di LOQ strumentali. Non abbiamo individuato materiale bibliografico relativo al contenuto vitaminico nella canapa, solo alcuni autori hanno rilevato la presenza di vitamina K nella Cannabis sativa [1]. Nella Tabella X sono elencate le vitamine analizzate nella farina di canapa estratta con acetone o con acqua a seconda della solubilità della vitamina in esame. Si riportano inoltre i valori dei livelli giornalieri raccomandati per i bambini da 0-12 mesi degli standard americani per la nutrizione [21]. Dalle analisi è risultato un valore di vitamina A nella farina pari a 0.8 mg/kg, di vitamina K1 pari a 0.9 mg/ kg e di vitamina D2 pari a 2.0 mg/kg, quest ultima in accordo con il valore di bibliografia di 0.9 mg/kg. Il coenzima Q10, conosciuto come ubichinone, è risultato essere presente in quantità di 3.9 mg/kg, con prevalenza della forma ridotta, cioè l ubichinolo 10, derivante dal meccanismo di attività antiossidante del primo [22]. Il coenzima Q9 è la forma prevalente di ubichinone presente nei cereali e si localizza solitamente nel germe. Nella farina è stato ritrovato un contenuto pari a 5.6 mg/kg, ed è stata riscontrata anche la sua forma ridotta ubichinolo 9 con un contenuto pari a 2.8 mg/ kg. Per quanto riguarda le vitamine idrosolubili, i contenuti presenti nella farina in esame sono i seguenti: la Vitamina B1 con un valore di 2.4 mg/kg, mentre la Vitamina B2 (riboflavina) è stata riscontrata in quantità molto elevata pari a 69.9 mg/kg. La Vitamina B3 (niacina) o Vitamina PP, comprendente l acido nicotinico e la nicotinammide, è presente in concentrazione di 8.5 mg/kg, oltre a una buona quantità di nicotinammide pari a 6.2 mg/kg. La Vitamina B5 (acido pantotenico) è presente in quantità abbastanza elevata (180.1 mg/kg), mentre la Vitamina B6 (piridossina) ha una concentrazione di 7.7 mg/kg. La Vitamina C (acido ascorbico) è presente nella farina di canapa in buone quantità, pari allo 0.32%. Tale contenuto è superiore a quello trovato solitamente nei limoni ( %), e simile a quello riscontrato nel frutto guava appartenente alla famiglia delle mirtacee (0.3%). L acido citrico è uno degli acidi più diffusi negli organismi vegetali ed è un prodotto del metabolismo aerobico. Dalle analisi effettuate abbiamo riscontrato un valore abbastanza significativo nella farina di canapa

9 Tabella X - Composizione in vitamine ottenuta mediante HPLC-MS/MS della farina di canapa Vitamina LOD LOQ * Vitamina D totale, **somma di acido nicotinico e nicotinammide, ***determinazione UV a 335 nm, mg/d = mg/giorno Livelli raccomandati giornalieri bambini 0-12 mesi [21] Lipofile Vitamina A µg/d Vitamina D g/d* Vitamina K µg/d Coenzima Q Ubichinolo Coenzima Q Ubichinolo Idrofile Vitamina B mg/d Vitamina B mg/d Vitamina B3 o PP (Acido Nicotinico) mg/d** Vitamina B3 o PP (Nicotinammide) Vitamina B mg/d Vitamina B mg/d Vitamina C (%) (%) (%) mg/d Acido citrico (%) (%) (%) Vitamina H (biotina) < LOQ Acido folico < LOQ µg/d Acido lipoico *** < LOQ Tabella XI - Composizione in fenoli: comparazione tra farina di canapa, the verde e the nero. Valori espressi in acido cinnamico Fenoli The verde The essiccato Acido gallico e derivati Catechine Acido caffeico e ferulico derivati Acido diidrossi benzoico derivati Farina di 55 canapa The verde -- The essiccato -- Acido p-coumarico Fenoli Acido Miricetina gallico e derivati Catechine Fenoli non identificati Acido Fenoli caffeico totali e ferulico derivati Acido diidrossi benzoico derivati Acido p-coumarico pari Miricetina a 0.02%, in ogni caso inferiore a quello dell acido noidi 5 comprensivi dei -- loro derivati glucosidici. -- ascorbico. Fenoli non identificati 85 La farina (2 g) è stata -- estratta con una -- soluzione di L acido Fenoli totali lipoico, l acido folico e la biotina (vitamina H) sono assenti nella farina di canapa [23-25]. 256 metanolo/acqua 80/ v/v (6 ml), dopo agitazione su Vortex per 1 minuto ed estrazione in bagno ad ultrasuoni per 15 minuti. L estratto è stato centrifugato a FENOLI Per quanto riguarda questa classe di composti, da un indagine bibliografica risulta che negli estratti naturali di canapa non sono stati riportati flavonoidi liberi, ma solo nella forma glucosidica [1]. In tale lavoro non viene citato in quale parte anatomica della pianta sono stati riscontrati, ma vengono riportati dei derivati dell apigenina, quali la vitexina e l isovitexina, della luteolina, in particolare l orientina, e alcuni derivati della quercetina e del kaempferolo. Per questo tipo di analisi abbiamo applicato il metodo messo a punto per i biofenoli degli oli di oliva nel nostro istituto [16] diventato norma NGD e COI, con il quale è possibile identificare i principali fenoli e flavo rpm per 25 minuti e un aliquota è stata estratta su filtri a siringa in PVDF 0.45 µm, prima dell iniezione nel sistema HPLC-PDA. Il monitoraggio è stato eseguito a 280 nm, con la possibilità di registrare gli spettri di assorbimento. I contenuti trovati sono stati espressi in mg/kg di acido cinnamico come standard esterno. Nella Tabella XI vengono riportati i valori riscontrati. In base alle nostre conoscenze e agli standard di riferimento presenti nella nostra libreria non abbiamo evidenziato le forme libere di apigenina, luteolina, quercetina e kaempferolo, nè quelle glucosidiche. La farina è risultata essere ricca in composti fenolici tra i quali sono stati individuati alcuni acidi fenolici 11

10 12 come il caffeico, il ferulico, il diidrossibenzoico e i loro derivati. Un picco potrebbe corrispondere al flavonoide miricetina sulla base dei dati in letteratura, ma non avendo uno standard a disposizione non abbiamo potuto avere una conferma certa. In parallelo vengono riportati i valori ottenuti in fenoli totali dall estratto metabolico acquoso del the verde e del the nero. I valori in fenoli della farina di canapa rappresentano circa l 1% dei fenoli contenuti nell estratto metabolico/acquoso del the verde. CONCLUSIONI La farina di canapa ottenuta dopo spremitura a freddo dei semi decorticati è stata caratterizzata chimicamente analizzando i principali parametri nutrizionali, quali proteine, sostanza grassa, umidità, ceneri, fibre totali e carboidrati, il profilo amminoacidico e il contenuto in vitamine, fenoli e pigmenti (clorofille e carotenoidi). In particolare, la farina contiene un elevata quantità di proteine facilmente digeribili (29.4%) che forniscono quasi tutti gli amminoacidi essenziali per l alimentazione umana ed animale, con eccezione della lisina, la quale è l amminoacido limitante anche nel caso di altri semi oleaginosi. Inoltre, rispetto ad altre proteine vegetali, è un ottima fonte di arginina (108.1 mg/100 g proteine). Il residuo di olio del campione in esame è del 10.1%, il contenuto di fibra grezza del 30.8%, e i carboidrati totali rappresentano il 13.3%, calcolati come differenza. Gli zuccheri totali riducenti dopo inversione sono il 3.4%, espressi come glucosio e le ceneri costituiscono il 7.1%. La fibra NDF (36.9%) rappresenta una quota elevata nella farina di canapa, così come la fibra ADF (21.6%), il contenuto di emicellulose (15.3%) e di cellulosa (20.6%), mentre è basso il contenuto di lignina (1.0%). E ricca di pigmenti clorofilliani (352.8 mg/kg) e composti fenolici (256 mg/kg) e sono stati individuati alcuni acidi fenolici quali il caffeico, il ferulico, il diidrossibenzoico e i loro derivati. Contiene inoltre vitamina E, B1, B2 e C, sali minerali, fitosteroli e non contiene glutine. In conclusione la farina di canapa può essere considerata un alimento completo sia dal punto di vista nutrizionale che del contenuto di aminoacidi e benefico per l apporto di vitamine e di minerali all interno dell alimentazione umana e/o animale. BIBLIOGRAFIA [1] C.E. Turner, M.A. Elsohly, E.G. Boeren, Constituents of Cannabis sativa L. XVII. A review of the natural constituents, J. Nat. Prod. 43, (1980). [2] J.C. Callaway, Hempseed as a nutritional resource: an overview, Euphytica 140, (2004). [3] M. Piccioni, Dizionario degli alimenti per il bestiame, Ed. EDAGRICOLE 5^ Edizione (1989). [4] F.V. Dulf, C. Bele, S. Spinean, V.S. Chedea, G. Zegrean, C. 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