Caratterizzazione chimica dell olio ottenuto dalla spremitura a freddo dei semi di Cannabis sativa L.

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1 Caratterizzazione chimica dell olio ottenuto dalla spremitura a freddo dei semi di Cannabis sativa L. P. Rovellini* L. Folegatti D. Baglio S. De Cesarei P. Fusari S. Venturini A. Cavalieri 1 INNOVHUB - SSI Azienda Speciale della Camera di Commercio di Milano Divisione SSOG - Milano 1 ATI Consulting - Milano *CORRISPONDENZA AUTORE: Dr.ssa Pierangela Rovellini Tel Fax angela.rovellini@mi.camcom.it Il presente lavoro ha focalizzato l attenzione sulla caratterizzazione chimica dell olio ottenuto dalla spremitura a freddo dei semi decorticati di Cannabis Sativa L. La Cannabis sativa è una pianta della famiglia delle Cannabinacee, annuale, erbacea, molto rustica, poco esigente, adattabile a tutti i tipi di terreno e fa parte delle piante più antiche conosciute nella medicina tradizionale e di quelle più studiate dal punto di vista fitochimico. I semi di canapa e i prodotti da essi derivati, in aggiunta al loro valore nutrizionale, hanno dimostrato effetti benefici riguardanti l abbassamento del colesterolo ematico, dei trigliceridi, della pressione sanguigna, nella cura delle dermatiti, delle malattie degenerative del sistema immunitario, dell apparato respiratorio e hanno trovato impieghi in campo alimentare sia come integratori che nelle preparazioni della medicina tradizionale. La caratterizzazione chimica ha riguardato i principali parametri di qualità, il contenuto e la composizione di acidi grassi, di steroli e trigliceridi, di acidi grassi ossidati, di tocoferoli ossidati e di composti carbonilici volatili. Inoltre sono stati determinati i contenuti delle principali vitamine, dei pigmenti (clorofille e carotenoidi) ed è stata effettuata la caratterizzazione di alcuni composti fenolici. I valori di alcuni parametri rientrano nei limiti proposti dalla normativa Codex per un olio vergine ottenuto da semi per pressione, quali umidità (0.08%), impurità (0.01%) e acidità (0.49% in acido oleico); mentre si è evidenziato un certo stato di ossidazione in base ai valori del numero di perossidi (28.2 meq O2/kg), del K232 (5.13), del contenuto in acidi grassi ossidati (13.92 mg/100 mg) e del contenuto in composti carbonilici volatili (465 mg/kg). E stata riscontrata la presenza di luteina (5 mg/kg) e non di beta-carotene e di un buon contenuto in pigmenti clorofilliani (51.8 mg/kg). Per quanto concerne la composizione in acidi grassi, l alto tenore in PUFA (79.25%) e il rapporto ω6/ω3 pari a 3.20 confermano l ottimale apporto nutrizionale dell olio di canapa. La composizione sterolica ha messo in risalto il beta-sitosterolo quale componente principale e un buon livello di steroli totali (4393 mg/kg). Dall analisi del profilo trigliceridico il picco della LLL (16.78%) è risultato essere quello prevalente in un range di classi ECN da 30 a 52. Il contenuto in tocoferoli totali è risultato essere pari a 928 mg/kg con un rapporto tra i vari isomeri simile a quello di un olio di soia. Dal punto di vista dei composti fenolici è stata messa in evidenza la presenza di acido cinnamico. Infine dall analisi multi-screening delle vitamine si è evidenziata la presenza di vitamina A, D2, K1, B3 (PP) coenzima Q10 e Q9, Ubichinolo 9. Chemical characterization of oil obtained by the cold pressing of Cannabis sativa L. seeds The present paper has focused its attention on the chemical characterization of the oil obtained from cold pressed hulled Cannabis Sativa L. seeds. 139

2 The Cannabis Sativa L. is a plant belonging to the Cannabinacee family, and it is annual, herbaceous, very rustic, not very demanding, adaptable to all soil types. It is also one of the most well-known plants in traditional medicine and one of the most studied from a phytochemical point of view. The hemp seeds and the products derived from it are important not only for their nutritional values but have also shown beneficial effects regarding haematic cholesterol, triglycerides, in lowering blood pressure, in dermatitis care, in the degenerative illnesses of the immune apparatus and of the breathing apparatus. Also there have been found in them uses in the field of food as integrator for traditional medicine preparation. The chemical characterization has regarded the principal quality parameters, the content and the fatty acids, sterols and triglycerides composition, oxidized fatty acids, oxidized tocopherols and carbonylic volatile compounds. Moreover, we have determined the principal vitamins contents, pigments contents (chlorophylls and carotenoids) and characterized phenolic compounds profile. The values of some parameters are within the Codex limits for virgin olive oils obtained from pressed seeds, for instance humidity (0.08%), impurity (0.01%) and acidity (0.49% as oleic acid); while it has been evidenced a sure oxidized status on the basis of peroxide number (28.2 meqo2/kg), of K232 (5.13), oxidized fatty acids (13.92 mg/100 mg) and of the carbonylic volatile compounds content (465 mg/kg). Lutein presence was checked (5 mg/kg), there was an absence of beta-carotene but a presence of a good chlorophyllian pigment content (51.8 mg/kg). Concerning the fatty acids composition the high content of PUFAs (79.25%) and the ratio of ω6/ω3 of 3.20 confirms the good nutritional contribution of hemp oil. The sterolic composition has evidenced β-sitosterol as a principal component and a good level of total sterols (4393 mg/kg). From a profile of the triglycerides analysis the peak of LLL (16.78%) resulted in the prevailing of a range of ECN classes from 30 to 52. The total tocopherols content resulted to be of 928 mg/kg with a ratio between the different isomers similar to that of soybean oil. From the point of view of phenolic compounds it has been pointed out the presence of cinnamic acid. At last from the multi-screening analysis of vitamins it has been evidenced the presence of vitamin A, D2, K1, B3 (PP), coenzyme Q10, Q9 and Ubichinol

3 INTRODUZIONE L olio ottenuto dai semi di Cannabis sativa è una fonte eccezionalmente ricca in acidi grassi insaturi, in particolare dell acido grasso essenziale acido linoleico (18:2, ω6), dell acido alfa linolenico (18:3, ω3) e dei loro metaboliti quali l acido γ- linolenico (18:3, ω6) e l acido stearidonico (18:4, ω3), che l uomo non può assolutamente sintetizzare ma deve approvvigionarsi con la dieta [1-9]. A differenza degli acidi grassi a corta catena, gli acidi grassi a lunga catena intervengono nella formazione delle membrane cellulari e sono precursori per la sintesi di importanti regolatori biochimici del corpo umano (prostaglandine). Dal punto di vista nutrizionale, una sua caratteristica importante è il rapporto ideale tra gli acidi grassi essenziali ω6/ω3 di 3:1, valore attualmente raccomandato dall Organizzazione Mondiale della Sanità che rende questo olio perfettamente equilibrato per la sua assunzione. I semi di canapa presentano un contenuto in olio compreso tra il 10-15%, contengono il 20-25% di proteine, il 20-30% di carboidrati, il 10-15% di fibre insolubili e sono ricchi in minerali. I semi di canapa, in aggiunta al loro valore nutrizionale, hanno dimostrato effetti benefici riguardanti l abbassamento del colesterolo, della pressione sanguigna e hanno mostrato impieghi nel campo alimentare e nelle preparazioni della medicina tradizionale. Visto l alto grado di insaturazione questo olio può essere anche usato nel settore degli inchiostri, delle vernici, della detergenza e dei saponi, mentre nel campo cosmetico la presenza di acido γ- linolenico lo rende ideale quale olio per il corpo e come ingrediente di creme cosmetiche con alta capacità penetrante nella pelle. Inoltre gli oli ottenuti per pressatura a freddo possono ritenere molti componenti benefici dei semi compresi gli antiossidanti naturali [31]. In questo lavoro l olio ottenuto dai semi di canapa è stato caratterizzato chimicamente analizzando i principali parametri di qualità, il contenuto e la composizione in acidi grassi, steroli e trigliceridi, e lo stato ossidativo mediante l analisi degli acidi grassi ossidati, dei tocoferoli ossidati e dei composti carbonilici volatili. Inoltre sono stati determinati i contenuti delle principali vitamine, dei pigmenti (clorofille e carotenoidi) e dei composti fenolici. Visto l elevato grado di insaturazione, come per tutti gli altri oli da semi è necessario conservarlo in ambienti freschi e bui per evitare l ossidazione e l irrancidimento. Lo stesso olio di canapa qui caratterizzato era stato in precedenza sottoposto ad analisi multiscreening dei principali contaminanti, quali micotossine, ftalati, idrocarburi policiclici aromatici, metalli e residui di fitofarmaci ed i risultati ottenuti sono stati recentemente pubblicati [10]. PARTE SPERIMENTALE CAMPIONI Il campione era costituito da un olio di canapa ottenuto mediante un procedimento di spremitura a freddo dei semi di canapa previamente decorticati. La resa di estrazione dell olio è risultata 141

4 142 essere del 10.1%. Esso mostrava un caratteristico colore verde-giallo e un odore di noce tostata, nocciola e frutta immatura. METODI DI ANALISI Nella Tabella I vengono elencati i parametri ed i metodi utilizzati per la caratterizzazione dell olio di canapa. RISULTATI E DISCUSSIONE UMIDITÀ, IMPURITÀ, ACIDITÀ LIBERA, NUMERO DI PEROSSIDI E ANALISI SPETTROFOTOMETRICA NELL UL- TRAVIOLETTO In Tabella II sono riportati i risultati ottenuti per alcuni dei parametri di qualità dell olio di canapa analizzato. I risultati si riferiscono alla media di due determinazioni indipendenti. I valori di umidità e sostanze volatili, delle impurità insolubili e dell acidità sono in accordo con gli standard di qualità previsti dal Codex Alimentarius per gli oli vegetali ad uso alimentare, dove per gli oli vergini ottenuti con procedimenti meccanici a freddo il valore dell umidità è max 0.2% m/m, delle impurità insolubili max 0.05% m/m e dell acidità max 4.0 mg KOH/g olio che corrisponde ad un acidità max 2.0% espressa come acido oleico. Il valore del numero di perossidi trovato nell olio di canapa (28.2 meqo2/kg olio) è invece più elevato rispetto a quello previsto dagli standard del Codex Alimentarius per un olio pressato a freddo, dove il valore è max 15 meqo2/kg olio (Codex Stan ) [11]. Il numero di perossidi pari a 28.2 meqo2/kg olio indica la presenza di uno stato di ossidazione significativo, trattandosi di un olio ad alto grado di insaturazione in cui gli acidi grassi polinsaturi costituiscono circa l 80% del totale. Infatti è noto che l olio di canapa, per la sua caratteristica composizione in acidi grassi, irrancidisce facilmente, producendo un odore sgradevole e portando ad una consistenza collosa del prodotto per le reazioni di polimerizzazione a carico dei suoi componenti. Il valore trovato per l acidità (0.49%) indica una buona qualità della materia prima impiegata, un buono stato di conservazione del seme e una corretta procedura nel processo di estrazione meccanica dell olio. Nella medesima tabella sono inoltre riportati i valori degli indici spettrofotometrici nella regione dell UV, misurati mediante uno spettrofotometro UV/VIS. Essi sono calcolati come assorbanze specifiche K232 e K270 di una soluzione all'1% dell'olio in esame in cicloesano in una cuvetta di quarzo dello spessore di 1 cm. I valori degli indici spettrofotometrici nell ultravioletto trovati nel campione di olio di canapa (K232 = 5.13, K270 = 0.37) differiscono dai valori riportati dalla letteratura soprattutto per il valore del K232 [6]. L alto valore di K232 trovato nel campione di olio in studio potrebbe confermare con il dato proveniente dal numero di perossidi uno stato di ossidazione già particolarmente elevato. COLORE, CAROTENOIDI, CLOROFILLE E PIROFEOFITINE Sul campione di olio di canapa in esame è stato valutato il colore determinando gli assorbimenti specifici dei composti clorofilliani e dei carotenoidi di una soluzione di olio in esano al 10% (v/v) e misurati mediante uno spettrofotometro UV/VIS alle lunghezze d onda 670, 610, 560 e 535 nm per i composti clorofilliani e 482, 475, 453, 448, 428, 414 e 412 nm per i carotenoidi. In Tabella III vengono riportate le caratteristiche di qualità del colore espresse come assorbimenti specifici alle lunghezze d onda rispettivamente dei composti clorofilliani e dei carotenoidi, confrontati con i dati presenti in letteratura per alcuni oli vergini di canapa commerciali [6]. Rispetto agli oli riportati dalla letteratura l olio di canapa oggetto dello studio presenta assorbimenti maggiori nella regione dei carotenoidi (

5 nm) rispetto agli assorbimenti delle clorofille ( nm). L olio di canapa mostra forti assorbimenti anche nelle regioni del vicino ultravioletto, nelle zone di lunghezze d onda comprese tra nm e nm che corrispondono alle zone dei raggi UV-A ( nm), UV-B ( nm) e UV- C ( nm). E quindi possibile ipotizzare che l olio di canapa potrebbe fornire una buona protezione nei confronti dei raggi UV-B e UV-A, responsabili quest ultimi dell invecchiamento cutaneo, ed essere utilizzato come fattore di protezione nei confronti dei raggi ultravioletti, con impieghi cosmetici come già riscontrato da altri autori [6]. I carotenoidi sono sostanze naturali con numerosi ruoli biochimici, comprese le funzioni di recettori della luce e di fotoprotezione durante il processo della fotosintesi. A livello umano numerosi studi hanno relazionato il contenuto dei carotenoidi e l effetto protettivo contro lo sviluppo di alcune forme di cancro, la loro attività antiossidante e di quenching durante i meccanismi ossidativi. L analisi è stata condotta attraverso un metodo interno, pesando 0.5 g di olio in 10 ml di acetone ed iniettando 20 μl della soluzione direttamente in un sistema analitico HPLC-PDA, monitorando il profilo cromatografico a 455 nm (VIS). Il contenuto è stato espresso utilizzando beta-carotene come standard esterno. Nella Tabella IV vengono riportati i valori dei caroteni espressi in mg/kg. Dall analisi del cromatogramma non è stata rivelata la presenza di beta-carotene ma solo di luteina a livelli molto bassi (5 mg/kg). In altri lavori bibliografici erano stati riscontrati valori di carotenoidi in misura di mg/kg in olio di canapa [7]. Vista l elevata intensità del colore verde dell olio di canapa si è proceduto alla determinazione del contenuto in clorofilla A, feofitine e pirofeofitina A secondo un metodo interno di cromatografia liquida e rivelatore PDA registrando il cromatogramma a 410 nm. L olio (0.5 g) è stato disciolto con acetone in un matraccio tarato da 10 ml e iniettato tal quale nel sistema cromatografico. Il contenuto dei pigmenti rivelati è stato espresso in mg/kg utilizzando la clorofilla A come standard esterno. Nella Tabella IV vengono riportati i valori ottenuti dalla media di due determinazioni indipendenti. La forma prevalente è costituita dalle Feofitine A+A1, mentre si registra un contenuto inferiore per la clorofilla A. Non abbiamo trovato lavori bibliografici in letteratura che riportino i valori relativi a questi composti nell olio di canapa. La presenza di Pirofeofitina A è legata ai trattamenti termici di deodorazione o di invecchiamento e nell olio extra vergine di oliva di nuova produzione è presente in misura dell 1% rispetto alla somma delle Feofitine A+A1 + Pirofeofitina A. In questo caso la % corrisponderebbe a 9.1% nell olio di canapa evidenziando la suscettibilità all ossidazione di questa matrice. E possibile affermare che per questa matrice i pigmenti clorofilliani prevalgono rispetto a quelli carotenoidei. ACIDI GRASSI (CONTENUTO E COMPOSIZIONE) La determinazione degli acidi grassi è stata eseguita sottoponendo l olio a un processo di transesterificazione diretta in fiala chiusa in soluzione metanolica di idrossido di potassio, in presenza di uno standard interno (C17- acido eptadecanoico), al fine di ottenere i corrispondenti esteri metilici degli acidi grassi (FAME), analizzati mediante gascromatografia in colonna capillare con rivelatore a ionizzazione di fiamma (FID). L'analisi gascromatografica permette di risalire alla composizione quali-quantitativa in acidi grassi dell'olio in esame e rivelare eventuali adulterazioni. In Tabella V sono riportati i contenuti in acidi grassi espressi in g/100 g di olio nel campione in esame e la composizione percentuale sul totale degli acidi grassi. Inoltre sono riportati i dati presenti in letteratura per altre due varietà di olio di canapa. Come si può osservare l olio di canapa è un prodotto altamente insaturo, con un elevato contenuto di acidi grassi polinsaturi (PUFAs) rappresentati dai due principali acidi grassi essenziali (EFAs) come l acido linoleico (18:2 ω6, LA) e l acido α- linolenico (18:3 ω3, ALA) e dai loro metaboliti biologici quali l acido γ-linolenico (18:3 ω6, GLA) e l acido stearidonico o acido octadecatetraenoico (18:4 ω3, SDA). E da puntualizzare che l alta percentuale di acido linoleico e di α-linolenico favorisce i processi di irrancidimento ossidativo, i quali possono essere limitati sottoponendo l olio a idonei sistemi di stoccaggio (basse temperature) e conservazione in atmosfera controllata di gas inerti. Gli acidi grassi essenziali non possono essere sintetizzati dai mammiferi ma, essendo precursori indispensabili per la sintesi di altri prodotti, devono 143

6 144 essere presenti nella dieta e perciò ricavati direttamente dalle fonti alimentari. Il ruolo essenziale degli EFAs nella dieta dell uomo è legato alla loro trasformazione in prodotti intermedi e finali attraverso differenti vie metaboliche. L acido linoleico una volta assunto con la dieta può venire trasformato in altri acidi grassi polinsaturi, come l acido γ-linolenico e l acido arachidonico. Quest ultimo è un importante precursore della famiglia degli eicosanoidi (prostaglandine e trombossani), sostanze ormono-simili coinvolte in molti processi biochimici importanti per lo stato di salute dell uomo come la regolazione della pressione sanguigna, degli stati infiammatori, delle funzioni riproduttive e dei processi di coagulazione del sangue. L acido α-linolenico viene invece trasformato sia nell acido eicosapentenoico (EPA), sia nell acido docosaesenoico (DHA). Nell olio di canapa da noi analizzato gli acidi grassi essenziali sono presenti in quantità elevata, in particolare l acido linoleico rappresenta il 55.75% del totale degli acidi grassi seguito dall acido α- linolenico pari a 17.37% e dagli acidi γ-linolenico (4.65%) e stearidonico (1.48%). La presenza di questi ultimi due acidi grassi rende questo olio unico nel suo genere, in quanto essi non si ritrovano nei semi oleaginosi tradizionali ad uso industriale, ma sono presenti in proporzioni variabili solo in alcune piante oleaginose non industriali come l olio di borragine, l olio di primula, l olio di ribes nero e di germe di grano [2]. Gli acidi grassi polinsaturi rappresentano il 79.25% del totale degli acidi grassi, mentre gli acidi grassi saturi e monoinsaturi rispettivamente il 9.86% e il 10.91%. Un rapporto elevato tra acidi grassi polinsaturi e acidi grassi saturi (PUFAs/SFAs = 8.04) è considerato vantaggioso nella riduzione dei livelli del colesterolo nel sangue e nella prevenzione delle patologie coronariche [5]. Come si può osservare dai dati della Tabella V il profilo degli acidi grassi del campione da noi analizzato è confrontabile con quello riportato dalla letteratura per gli oli di canapa di due diverse cultivar. Leggere differenze si notano nella ripartizione degli acidi ω3 e ω6 dovute alla variabilità delle cultivar selezionate. In particolare le quantità degli acidi γ- linolenico e stearidonico sembrano essere determinate geneticamente e il loro contenuto è normalmente più alto nella varietà Finola (Finlandese) rispetto ad altre cultivar [2, 12]. Un significato rilevante per la salute dell uomo assume il rapporto ω6/ω3 tra gli acidi grassi essenziali. Nella maggior parte degli oli vegetali il rapporto ω6/ω3 non è ottimale, a causa della compe-

7 tizione tra i due acidi grassi per l accesso all enzima delta-6 desaturasi che promuove l accumulo dei prodotti intermedi, ostacolando il metabolismo degli acidi grassi. Fino a 10 anni fa la FAO e l Organizzazione Mondiale della Sanità (WHO) [13] stabilivano che un rapporto ottimale tra ω6/ω3 doveva essere compreso tra 5:1 e 10:1. Di conseguenza l olio di soia era ritenuto il miglior prodotto per la salute dell uomo in quanto il rapporto ω6/ω3 è circa 7:1. Solo recentemente nuovi studi clinici hanno suggerito un diverso rapporto ω6/ω3 prendendo in considerazione la dieta giapponese e quella mediterranea dove l incidenza delle malattie coronariche risulta tra le più basse. Questi studi hanno portato a riconsiderare il rapporto portando il valore ottimale ω6/ω3 nell intervallo tra 2:1 e 3:1. Il rapporto ω6/ω3 ottenuto nell olio di canapa in esame (3.20) si avvicina al valore ideale, infatti è compreso in questo range e corrisponde a quello consigliato e accreditato dalle ricerche mediche per l assunzione degli acidi grassi essenziali (ISSFAL, Società Internazionale per lo studio degli acidi grassi). In parallelo è stata condotta anche una determinazione della composizione acidica mediante trans esterificazione con benzilato sodico 1.0 M in alcool benzilico a freddo e successiva analisi cromatografica in HPLC, secondo un metodo sviluppato per la determinazione del contenuto degli acidi grassi ossidati rispetto a quelli naturali nell olio di oliva [14, 15]. Gli acidi grassi separati cromatograficamente vengono rivelati a 255 nm e calcolati per normalizzazione a 100. I dati ottenuti sono comparabili con quelli riportati in Tabella V. ACIDI GRASSI OSSIDATI, CLnA e CLA Con la medesima metodologia HPLC utilizzata per la determinazione dei benzilesteri degli acidi grassi è stata effettuata la valutazione quantitativa degli acidi grassi ossidati presenti sui trigliceridi, dopo trans esterificazione con benzilato sodico [15]. Con il metodo applicato è possibile determinare le forme primarie dell ossidazione, costituite dalla forme idroperossidiche e le forme secondarie derivate da queste, quali ad esempio i derivati idrossi, epossi, epidiossi e cheto, che nella Tabella VI vengono riportate come Ox1 e Ox2. Il contenuto in acidi grassi ossidati totali viene espresso in mg/100 mg utilizzando la benzileptadecanoina come standard interno. Nella Tabella VI vengono riportati i quantitativi ottenuti per l olio da pressione affiancati per paragone ai valori massimi riscontrati per l olio extravergine di oliva dopo 12 mesi di conservazione in normali condizioni ambientali (temperatura ambiente, vetro scuro). Il valore ottenuto nel campione di olio in analisi, pari a mg/100 mg è abbastanza elevato e si può giustificare dal fatto che questa matrice, altamente insatura, è sicuramente molto soggetta ai fenomeni ossidativi e per questo motivo deve essere conservata in condizioni idonee (atmosfera inerte, buio, assenza di battente di ossigeno, ambiente fresco), e in ogni caso dal punto di vista della sicurezza alimentare o dell impiego farmaceutico, lo stato di ossidazione sarà un fattore che dovrà essere spesso monitorato. Con lo stesso metodo è stato inoltre possibile determinare il contenuto in acidi grassi trienici coniugati del C18:3 (CLnA) e quelli dienici del C18:2 (CLA), nelle forme c,t / t,c / t,t. Gli acidi grassi coniugati dell acido linoleico studiati in particolare nel latte per i loro effetti benefici a livello di anticancerogenicità, antiaterogenicità, promotori della crescita, antiobesità, immunomodulatori destano molta attenzione quando presenti all interno di una matrice alimentare [16]. Essi sono una miscela di isomeri geometrici e posizionali dell acido linoleico, nelle forme cis-trans, trans-cis e trans-trans (queste ulti- 145

8 146 me prevalenti in matrici sottoposte a trattamenti chimico-fisici). Tali composti, oltre ad essere presenti in piccole quantità anche naturalmente, possono derivare da forme di riarrangiamento dei prodotti di ossidazione o nel caso di oli raffinati, durante il passaggio sulle terre decoloranti. Con il metodo impiegato sono stati monitorati gli acidi grassi coniugati dell acido linolenico (CLnA), al momento ancora poco studiati ma presumibilmente in grado di avere gli stessi effetti positivi dei CLA. Entrambi devono essere sempre presenti in una forma equilibrata, in quanto maggiormente predisposti al fenomeno dell ossidazione lipidica rispetto alle forme non coniugate. Il valore in acidi coniugati riscontrato è risultato essere non molto elevato, di poco superiore a quello degli oli extra vergini di oliva dell area mediterranea all interno di un anno di conservazione (CLnA = 0.60% massimo, CLA = 0.40% massimo). COMPOSTI CARBONILICI VOLATILI (CVC) Il profilo relativo ai composti carbonilici volatili che si ritrovano nelle matrici liposolubili è legato alla composizione acidica e di conseguenza alla presenza dei prodotti di ossidazione degli acidi grassi che ad un certo punto si frammentano e formano composti aldeidico-chetonici a diversa lunghezza di catena. Tali prodotti sono responsabili di determinate sensazioni organolettiche legate alla loro concentrazione; in funzione di quest ultima e della matrice in cui si ritrovano possono causare la percezione di note sensoriali positive o negative. Si tratta di un profilo molto complesso e in particolare con la metodologia da noi sviluppata è possibile determinare questi composti nell intervallo C4-C12 [17]. Nella Tabella VII sono stati riportati i valori ottenuti per l olio di canapa. In questo caso l olio è stato sottoposto a reazione di derivatizzazione con 2,4- dinitrofenilidrazina in acetonitrile e successiva analisi cromatografica in HPLC-UV monitorando il cromatogramma a 360 nm ed esprimendo il contenuto di ciascun composto carbonilico in dodecanale derivatizzata e utilizzata come standard interno. Nell olio di canapa oggetto del presente lavoro sono stati riscontrati valori di CVC pari a 465 mg/kg, per esperienza abbastanza elevati, se si pensa che in un olio ad uso alimentare diretto quale l olio extra vergine di oliva, un valore del genere coincide solitamente con un prodotto ad avanzato stato ossidativo. Tra i composti analizzati prevalgono l esenale, l esanale e la nonenale. In letteratura sono state riscontrate per l esenale le note sensoriali tipiche del verde, erbaceo, foglia, frutta verde, mandorla, fruttato, carciofo e floreale, per l esanale le caratteristiche del verde, erba, fresco, fruttato e per la nonenale le caratteristiche di aldeide, cocomero, sego, pelle vecchia. Altri autori hanno confermato la presenza di queste aldeidi [18] nell analisi dell olio di canapa attraverso lo spazio di testa. STEROLI (COMPOSIZIONE E CONTENUTO) I fitosteroli appartengono alla famiglia dei triterpeni, composti di origine naturale che comprendono un ampia gamma di steroli vegetali (circa 4000 diversi composti chimici). Questi composti non possono essere sintetizzati direttamente nell uomo, pertanto derivano unicamente dalla dieta. Sebbene siano stati identificati più di 100 differenti tipi di fitosteroli, i più comuni sono il beta-sitosterolo, il campesterolo e lo stigmasterolo. Gli alimenti con il maggior contenuto di fitosteroli sono gli oli vegetali, la frutta a guscio, i cereali e i loro derivati. Negli oli vegetali gli steroli sono presenti sia in forma libera che in forma esterificata con gli acidi grassi. I fitosteroli svolgono un ruolo importante in diversi settori, da quello farmaceutico a quello nutrizionale e per finire in quello cosmetico. L'effetto ipocolesterolemizzante dei fitosteroli è stato evidenziato per la prima volta nel Sebbene varie ricerche abbiano principalmente dimostrato l efficacia del beta-sitosterolo nella riduzione del colesterolo, numerosi altri studi scientifici e clinici hanno constatato che anche l assunzione di altri fitosteroli potrebbe ridurre le concentrazioni

9 del colesterolo presente nel sistema circolatorio (totale e LDL) del 5-15% e rappresentare pertanto uno strumento importante nella riduzione del rischio cardiovascolare. Gli steroli vegetali intervengono sul meccanismo di assorbimento del colesterolo, bloccandolo attraverso fenomeni di cristallizzazione e coprecipitazione. L esclusione del colesterolo nella formazione delle micelle riduce la sua solubilità e ne impedisce l assorbimento nel lume intestinale. Inoltre a livello della mucosa intestinale esiste una concorrenza per l assorbimento tra gli steroli e il colesterolo [7]. Il profilo degli steroli e il loro contenuto sono caratteristici di ciascuna specie botanica; pertanto la determinazione della composizione degli steroli è ampiamente applicata come uno strumento efficace e affidabile per determinare la genuinità di un olio. In Tabella VIII è riportata la composizione percentuale relativa degli steroli dell olio di canapa e il contenuto totale espresso in mg/kg di olio nel campione in esame. Come si vede dai dati tabulati, nell olio di canapa si riscontra la varietà di fitosteroli che normalmente si ritrovano negli oli vegetali: il beta-sitosterolo è il componente maggiormente rappresentato, seguito dal campesterolo, stigmasterolo e delta-5-avenasterolo presenti in discrete percentuali. TRIGLICERIDI L analisi della composizione trigliceridica è stata eseguita mediante HPLC-RI [19-21]. La caratterizzazione del profilo trigliceridico è molto importante per la definizione della classe botanica così come quella degli acidi grassi. Il profilo cromatografico ottenuto rappresenta il fingerprinting della matrice specifica all interno di range di variabilità naturali che vanno definiti. I trigliceridi si separano nelle condizioni analitiche utilizzate in funzione del loro valore di ECN (equivalent carbon number) dato dalla differenza tra il numero di carboni totali (CN) e il numero di doppi legami (2DB). La composizione trigliceridica rispecchia quella acidica; infatti è possibile notare forme trigliceridiche molto insature, comprese nel range tra ECN30 ed ECN52. Le classi prevalenti sono quelle degli ECN42 a cui appartiene in maggior misura il picco della trilinoleina (LLL) ed ECN44 a cui appartengono i picchi LLO ed LnOO in egual misura. Nella Tabella IX sono riportate tutte le classi trigliceridiche individuate per l olio di canapa e la loro ipotesi di identificazione, mentre nella Tabella X (riassuntiva finale) sono riportati anche i valori delle 147

10 148 classi ECN di un olio di oliva preso ad esempio e di un olio di soia. TOCOFEROLI E TOCOTRIENOLI Questa classe di composti, ad alto valore antiossidante e vitaminico è composta in principal modo da 8 forme naturali: delta, gamma, beta ed alfa tocoferolo e dalle rispettive forme tocotrienoliche. Esse differiscono nella loro struttura chimica e nel grado di attività vitaminica. L alfa tocoferolo è la sostanza con maggiore attività vitaminica, ad esso viene attribuito il valore di 1.0 [22]. Le forme tocoferoliche vengono comunemente indicate con il termine di Vitamina E. Si tratta di sostanze labili e sensibili alla luce e all esposizione all aria. Gli oli di origine vegetale sono particolarmente ricchi di queste sostanze e i rapporti isomerici tra le varie forme sono legati all origine della materia prima, rappresentando una peculiarità. L attività vitaminica è massima in una matrice nuova, poi lentamente decade. I processi di raffinazione abbattono il contenuto in tocoferoli, così come il riscaldamento. La presente analisi è stata condotta sull olio tal quale, pesando 0.5 g in 10 ml di acetone ed eseguendo l analisi in HPLC a 292 nm [23]. Nelle condizioni analitiche utilizzate, la forma beta non si separa dalla forma gamma, e quindi tali forme sono state considerate insieme; tutte le forme sono state espresse come alfa tocoferolo. Per quanto riguarda il contenuto totale di tocoferoli presenti nell olio di canapa, si tratta di un contenuto abbastanza elevato (928 mg/kg), paragonabile a quello di un olio di soia ( mg/kg) o di girasole ( mg/kg). In altri lavori [6, 24, 25] sono stati riscontrati valori di tocoferoli dell olio di semi di canapa nei rapporti: delta, gamma+ beta, alfa 2:10:7, valori che si riscontrato anche per l olio di soia [8]. Per l olio di canapa in questione abbiamo ottenuto i rapporti di 1:26:1, differenti da quelli di riportati in bibliografia. I valori dei tocoferoli ottenuti per l olio di canapa in esame rientrano nei range riscontrati da altri autori, per la forma alfa e delta. E stato osservato invece un contenuto superiore della forma beta+gamma rispetto a quanto riportato in letteratura; solitamente la forma prevalente è la forma gamma, mentre la forma beta è presente in quantità inferiore. Nella Tabella XI sono stati riportati i quantitativi ottenuti per l olio di canapa analizzato. In aggiunta con la medesima metodologia è possibile quantificare anche l alfa tocoferilchinone, il prodotto di ossidazione dell alfa tocoferolo [26], monitorato a 268 nm. L alfa tocoferilchinone è presente nell olio di canapa in concentrazione paragonabile a quella riscontrata negli altri oli vegetali all interno del loro periodo di conservazione, riflettendo uno stato di ossidazione non indifferente. Non è stata invece riscontrata presenza di forme tocotrienoliche. VITAMINE È stato eseguito uno screening relativo alla determinazione di altre vitamine oltre alla vitamina E, alcune di natura idrofila (Vitamina B1, B2, B3 o PP, B5, B6, C, H, acido citrico, acido folico e acido lipoico), altre di natura lipofila (Vitamina A, D2, K1, Q10, Q9), mediante HPLC-MS/MS con interfaccia

11 APCI e spettrometro di massa a trappola ionica. Per ciascuna vitamina sono state ottimizzate le condizioni di ionizzazione e di acquisizione in SRM (selective reaction monitoring), determinando i valori di LOD e di LOQ strumentali. Non abbiamo individuato materiale bibliografico relativo al contenuto vitaminico nella canapa. Alcuni autori hanno rilevato la presenza di vitamina K nella Cannabis sativa [27]. Nella Tabella XII sono elencate le vitamine analizzate e i valori ottenuti per l olio di canapa in esame. Vengono inoltre riportati i valori dei livelli giornalieri raccomandati per i bambini da 0-12 mesi degli standard americani per la nutrizione [29]. Dall analisi dei risultati ottenuti si nota che sono presenti principalmente vitamine liposolubili, tra le quali la vitamina A (0.6 mg/kg), la vitamina D2 (1.7 mg/kg) e la vitamina K1 (0.10 mg/kg). Il Coenzima Q10 conosciuto come Ubichinone è risultato essere presente in quantità significativa (8.1 mg/kg) e i valori riscontrati rientrano nel range di valori relativi all olio di girasole (4-15 mg/kg) e di mandorle (5-14 mg/kg), mentre nell olio di soia se ne riscontrano mg/kg e nell olio di oliva mg/kg [30]. Inoltre, nel campione in esame prevale la forma ridotta, cioè l Ubichinolo 10, derivante dal meccanismo di attività antiossidante del primo. Nell olio di canapa analizzato è stata riscontrata anche una quantità di Coenzima Q9 pari a 23.5 mg/kg, espresso come Coenzima Q10, oltre alla sua forma ridotta di Ubichinolo 9. Per quanto riguarda le vitamine idrosolubili, esse sono quasi assenti nell olio di canapa in questione ad eccezione della vitamina B3 o PP, come acido nicotinico, in concentrazione di 0.90 mg/kg. FENOLI Per quanto riguarda questa classe di composti, da un indagine bibliografica risulta che negli estratti naturali di canapa, non sono stati riportati flavonoidi liberi, ma solo nella forma glucosidica [27]. In tale lavoro non viene riportato in quale parte anatomica della pianta sono stati riscontrati, ma in particolare sono stati evidenziati derivati dell apigenina quali la vitexina e l isovitexina, della luteolina e in particolare l orientina, derivati della quercetina e del kaempferolo. Per questo tipo di analisi è stato applicato il metodo messo a punto nel nostro istituto per i biofenoli 149

12 150 degli oli di oliva [28] e diventato norma NGD e COI, con il quale è possibile identificare i principali fenoli e flavonoidi comprensivi dei loro derivati glucosidici. I contenuti sono poi espressi in mg/kg di acido cinnamico utilizzato come standard esterno. Sul campione di olio di canapa, in base alle nostre conoscenze e in base agli standard di riferimento, non si sono evidenziate le forme libere e glucosidiche dell apigenina, della luteolina, della quercetina e del kaempferolo. Il composto prevalente ritrovato nell olio è l acido cinnamico. Alcuni composti non sono stati identificati in quanto non corrispondenti agli standard in nostro possesso. Nella Tabella XIII vengono riportati i valori riscontrati, ma il contenuto in fenoli nell olio di canapa è molto ridotto e poco significativo. CONCLUSIONI Nel presente lavoro di ricerca è stato caratterizzato chimicamente un olio di canapa ottenuto dalla spremitura a freddo dei semi di Cannabis sativa L. Le analisi eseguite hanno incluso i principali parametri di qualità, il contenuto e la composizione in acidi grassi, steroli e trigliceridi, la valutazione dello stato ossidativo mediante l analisi degli acidi grassi ossidati, dei tocoferoli ossidati e dei composti carbonilici volatili. Inoltre sono stati determinati i contenuti delle principali vitamine, dei pigmenti (clorofille, carotenoidi) e dei composti fenolici. Per quanto riguarda il valore di umidità e sostanze volatili riscontrato (0.08%), il valore delle impurità insolubili in etere di petrolio (0.01%) e il valore dell acidità libera riscontrata (0.49% acido oleico) sono risultati in linea con i valori previsti dal Codex Alimentarius per gli oli vegetali vergini ad uso alimentare ottenuti con procedimenti meccanici a freddo. Il valore del numero di perossidi (28.2 meqo2/kg) è invece più elevato rispetto a quello previsto dagli standard del Codex Alimentarius per un olio pressato a freddo e indica la presenza di uno stato di ossidazione primaria già in atto, trattandosi di un olio ad alto grado di insaturazione in cui gli acidi grassi polinsaturi costituiscono circa l 80% del totale. I valori degli indici spettrofotometrici nell ultravioletto determinati (K232 = 5.13, K270 = 0.37) differiscono dai valori riportati dalla letteratura soprattutto per il K232. Valori elevati di questi indici evidenziano uno stato di ossidazione particolarmente elevato, confermato anche dal valore di altre analisi (numero di perossidi e acidi grassi ossidati). Il colore è stato valutato misurando gli assorbimenti specifici nel visibile a determinate lunghezze d onda nelle regioni dei carotenoidi e delle clorofille. I valori riscontrati sono stati messi a confronto con gli assorbimenti di alcuni oli commerciali presenti in letteratura e hanno mostrato assorbimenti maggiori nella regione dei carotenoidi rispetto agli assorbimenti delle clorofille. Per quanto riguarda la classe di composti chimici naturali quali i carotenoidi è risultato che nell olio di canapa è presente solo la luteina e non è stata rilevata presenza di beta-carotene e dei suoi isomeri. L olio di canapa era caratterizzato da un intenso colore verde, infatti dalla determinazione dei pigmenti clorofilliani è risultato che questo contiene una quantità significativa di questi composti, superiore a quelli presenti ad esempio nella categoria degli oli extra vergini di oliva: i composti principali sono le feofitine A+A1, a seguire in ordine decrescente le feofitine B+B1, la pirofeofitina A e in ultimo la clorofilla A. Non sono stati trovati dati in letteratura relativi a questa classe di composti. Per quanto riguarda la composizione acidica l olio di canapa analizzato è risultato essere un importante fonte di acidi grassi essenziali. La sua particolare composizione in acidi grassi ha mostrato un elevata percentuale di acidi grassi polinsaturi (79.25%) rappresentati dai due principali acidi grassi essenziali quali l acido linoleico (18:2-ω6) e α-linolenico (18:3-ω3) più i loro metaboliti biologici come l acido γ-linolenico (18:3-ω6) e l acido stearidonico (18:4-ω3). Rispetto agli oli delle più comuni oleaginose industriali l olio di canapa possiede pertanto un elevata percentuale di acidi grassi 6 (60.40%) e ω3 (18.85%) presenti in un rapporto ottimale ω6/ω3 compreso tra 2:1 e 3:1, molto importante per i risvolti nutrizionali e nutraceutici. E stato però riscontrato un contenuto in acidi grassi ossidati non indifferente (13.92 mg/100mg). Sarà necessario quindi porre molta attenzione alle condizioni di produzione, stoccaggio e monitoraggio di questo prodotto, selezionando le condizioni migliori per la sua inalterabilità, quali la conservazione in atmosfera modificata, il buio, il fresco e l assenza di un battente di ossigeno. Gli acidi grassi coniugati sia del linolenico (CLnA) che del linoleico (CLA) non si sono dimostrati essere presenti in grossa quantità rispetto ad altre matrici con composizione acidica più satura, quali l olio di oliva, e notevolmente inferiori a quelli riscontrati e tipici del latte. È stato rilevato anche un contenuto elevato di com-

13 posti carbonilici volatili (465 mg/kg) provenienti dai processi di ossidazione sia enzimatica che chimica, mettendo in evidenza le componenti (esenale, esanale, nonanale) che ne influenzano le note olfattive legate all erbaceo, al verde, alla mandorla, all odore di aldeide e cocomero. La composizione degli steroli rilevata nell olio di canapa è quella che normalmente si riscontra negli oli vegetali. Esso rappresenta una buona sorgente di fitosteroli in cui il beta-sitosterolo (67.8%) rappresenta il componente presente in misura maggiore, seguito da campesterolo, delta-5-avenasterolo e stigmasterolo. Il contenuto di steroli totali ritrovato (4393 mg/kg) è in linea con i più comuni oli di semi industriali ad eccezione dell olio di colza e di mais in cui gli steroli totali sono decisamente più elevati. La determinazione del profilo trigliceridico ha confermato la natura altamente insatura dei principali trigliceridi distribuiti tra le classi ECN30 ed ECN52, con la prevalenza dei composti quali LnLLn, LnLL, LLL, LOO ed LnOO. La composizione totale in classi ECN avvicina questa matrice all olio di soia, presentando comunque una maggior insaturazione. L olio analizzato è risultato avere un contenuto in tocoferoli (928 mg/kg) in sintonia con altri lavori bibliografici presenti in letteratura, confermando che questo olio vegetale può essere considerato una buona fonte di vitamina E, al pari di un olio di soia o di girasole. Non sono stati riscontrati tocotrienoli. E stata osservata la presenza di un contenuto significativo di alfa-tocoferilchinone (10 mg/kg), prodotto di ossidazione dell alfa-tocoferolo e si ribadisce la necessità di condizioni controllate sia di produzione che di stoccaggio. Per quanto riguarda il contenuto vitaminico è stata riscontrata e quantificata la presenza delle Vitamine A, D2, K1, Coenzima Q10, Ubichinolo Q10, Coenzima Q9, Ubichinolo Q9, e Vitamina B3 (acido nicotinico). Dalla caratterizzazione dei fenoli non sono stati individuati come ritrovato in alcuni lavori bibliografici presenza di apigenina in forma libera e dei suoi derivati glucosidici quali la vitexina e l isovitexina, così come la luteolina in forma libera e i suoi derivati glucosidici quali l orientina. Non sono stati ritrovati neanche flavonoidi quali la quercetina e il kaempferolo citati in altri lavori. Il componente peculiare individuato nell olio è stato l acido cinnamico. BIBLIOGRAFIA [1] C.E. Turner, M.A. Elsohly, E.G. Boeren, Constituents of Cannabis sativa L. XVII. A review of the natural constituents, J. Nat. Prod. 43, (1980) [2] J.C. Callaway, Hempseed as a nutritional resource: an overview, Euphytica 140, (2004) [3] M. Piccioni, Dizionario degli alimenti per il bestiame, Ed. EDAGRICOLE. V Edizione (1989) [4] F.V. Dulf, C. Bele, S. Spinean, V. S. Chedea, G. Zegrean, C. Socaciu, Comparative studies on fatty acid fingerprint from total lipids and phytosterols esters of some edible plant oils, Buletin USAMV-CN 62, (2006) [5] G. Fournier, Le Chanvre (Cannabis sativa L.) et sa reglementation europeenne en Teneurs en D9-THC des varieties cultivee en France, Ann. Toxic. Anal. 15(3), (2003) [6] B.D. Omomah, M. Busson, D. V. Godfrey, J. C. G. Drover, Characteristics of hemp (Cannabis sativa L.) seed oil, Food Chemistry 76, (2002) [7] C. Leizer, D. Ribnicky, A. Poulev, S. Dushenkov, I. Raskin, The Composition of Hemp Seed Oil and its Potential as an important Source of Nutrition, Journal of Nutraceuticals Functional & Medical Foods 2 (4), (2000) [8] H. Stambouli, A. El Bouri, T. Bouayoun, A. Belliman, Caracterisation de l huile de grains de Cannabis sativa L. Cultivè au nord du Maroc, Annales de Toxicologie Analytique 17 (2), (2006) [9] J.B. Roberts, T. Yazicioglu, Cannabis sativa (Moraceae). In Ucciani E. Nouveau dictionn. des huiles veget., (1995) [10] P. Fusari, P. Rovellini, L. Folegatti, D. Baglio, A. Cavalieri, Olio e farina da Cannabis sativa L. analisi multiscreening di micotossine, ftalati, idrocarburi policiclici aromatici, metalli e fitofarmaci, La Rivista Italiana delle Sostanze Grasse 90, 9-19 (2013) [11] CODEX STAN Codex Standard for edible fats and oils not covered by individual standards. Adopted Revisions 1987, Amendment 2009 [12] J.C. Callaway, T. Tennila, D.W. Pate, Occurence of omega-3 stearidonic acid (cis-6,9,12,15-octadecatetraenoic acid) in hemp (Cannabis sativa L.) seed, Journal of the International Hemp Association 3(2), (1996) [13] FAO/WHO/UNU. Energy and Protein Requirements. Report of a Joint Expert Consultation. Geneva, Switzerland: Technical report series no. 724, World Health Organization (1985) [14] N. Cortesi, P. Rovellini, Cromatografia liquida ad alta risoluzione dei derivati benzilici degli acidi grassi e dei loro isomeri. La Rivista Italiana delle Sostanze Grasse 71, (1994) [15] NGD C88:2007, Determinazione dello stato di ossidazione degli oli vergini di oliva mediante HPLC 151

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