RISG. Organo ufficiale della Divisione SSOG di Innovhub Stazioni Sperimentali per l Industria Azienda Speciale della Camera di Commercio di Milano

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1 Organo ufficiale della Divisione SSOG di Innovhub Stazioni Sperimentali per l Industria Azienda Speciale della Camera di Commercio di Milano LUGLIO/SETTEMBRE 2013 ISSN RISGARD 90 (3) (2013) Poste Italiane S.p.a. - Spedizione in Abbonamento Postale -70% Finito di stampare nel mese di Settembre 2013 RISG 3

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3 3 duemilatredici L U GLIO/SETTEMB RE 2013 ANNO XC ORGANO UFFICIALE DELLA DIVISIONE SSOG DI INNOVHUB STAZIONI SPERIMENTALI PER L INDUSTRIA AZIENDA SPECIALE DELLA CAMERA DI COMMERCIO DI MILANO Sommario GRAFICA IMPAGINAZIONE E STAMPA LASERGRAFICA POLVER SRL Via Kramer, Milano P. Rovellini, L. Folegatti, D. Baglio, S. De Cesarei, P. Fusari, S. Venturini, A. Cavalieri D. Baglio, L. Folegatti E. Valli, R. Manzini, R. Accorsi, M. Bortolini, M. Gamberi, A. Bendini, G. Lercker, T. Gallina Toschi E.I. Adeyeye, R.O. Akinyeye H.E. Samli, V. Nalbant, A. Agma Okur B. Lanza, A. Russo, M.G. Di Serio, C. Benincasa, F. Russi, M.R. Mucciarella, E. Perri Notiziario Caratterizzazione chimica dell olio ottenuto dalla spremitura a freddo dei semi di Cannabis sativa L. Determinazione diretta di alcuni metalli negli oli extra vergini mediante assorbimento atomico con fornetto di grafite (GF-AAS) Quality at destination: simulating shipment of three bottled edible oils from Italy to Taiwan Studies in the transformations of lipid components of cocoa butter and palm kernel oil under different temperature processing conditions Effects of microwave heating on some oil seeds nutrient contents and colour change The effect of the lime-and-ash debittering and the fermentation with and without starter on the composition in sugars and phenols of table olives biblioteca ssog it 02/ / Redazione: franca.paparella@mi.camcom.it Sito web: 100,00 200,00 umero singolo 30,00

4 A. FABERI: Ministero delle Politiche Agricole Alimentari e Forestali Roma La RIVISTA ITALIANA DELLE SOSTANZE GRASSE è l organo ufficiale della Divisione SSOG di Innovhub Stazioni Sperimentali per l Industria Azienda Speciale della Camera di Commercio di Milano. Ha periodicità trimestrale e la scientificità dei contenuti è garantita da un Comitato Internazionale di Referee. Pubblica lavori originali e sperimentali di autori italiani ed esteri riguardanti la chimica, la biochimica, l analisi e la tecnologia nei settori: sostanze grasse e loro derivati, tensioattivi, detersivi, cosmetici, oli minerali. Include metodi di analisi in inchiesta pubblica relativi ai settori di competenza, il Notiziario con informazioni su congressi, notizie in breve e libri. La Rivista viene consultata in Italia dalle industrie produttrici di oli e grassi alimentari ed industriali, dalle industrie chimiche, da laboratori di enti statali, da istituti di ricerca e facoltà universitarie. E inoltre distribuita all estero in vari Paesi come Spagna, Grecia, Francia, Germania, Tunisia, Nigeria, Congo, Polonia, Romania, Bulgaria, Russia, Stati Uniti, Brasile, Cina, Giappone, presso industrie produttrici ed esportatrici, enti pubblici e università, da dove provengono diversi lavori scientifici.

5 Caratterizzazione chimica dell olio ottenuto dalla spremitura a freddo dei semi di Cannabis sativa L. P. Rovellini* L. Folegatti D. Baglio S. De Cesarei P. Fusari S. Venturini A. Cavalieri 1 INNOVHUB - SSI Azienda Speciale della Camera di Commercio di Milano Divisione SSOG - Milano 1 ATI Consulting - Milano *CORRISPONDENZA AUTORE: Dr.ssa Pierangela Rovellini Tel Fax angela.rovellini@mi.camcom.it Il presente lavoro ha focalizzato l attenzione sulla caratterizzazione chimica dell olio ottenuto dalla spremitura a freddo dei semi decorticati di Cannabis Sativa L. La Cannabis sativa è una pianta della famiglia delle Cannabinacee, annuale, erbacea, molto rustica, poco esigente, adattabile a tutti i tipi di terreno e fa parte delle piante più antiche conosciute nella medicina tradizionale e di quelle più studiate dal punto di vista fitochimico. I semi di canapa e i prodotti da essi derivati, in aggiunta al loro valore nutrizionale, hanno dimostrato effetti benefici riguardanti l abbassamento del colesterolo ematico, dei trigliceridi, della pressione sanguigna, nella cura delle dermatiti, delle malattie degenerative del sistema immunitario, dell apparato respiratorio e hanno trovato impieghi in campo alimentare sia come integratori che nelle preparazioni della medicina tradizionale. La caratterizzazione chimica ha riguardato i principali parametri di qualità, il contenuto e la composizione di acidi grassi, di steroli e trigliceridi, di acidi grassi ossidati, di tocoferoli ossidati e di composti carbonilici volatili. Inoltre sono stati determinati i contenuti delle principali vitamine, dei pigmenti (clorofille e carotenoidi) ed è stata effettuata la caratterizzazione di alcuni composti fenolici. I valori di alcuni parametri rientrano nei limiti proposti dalla normativa Codex per un olio vergine ottenuto da semi per pressione, quali umidità (0.08%), impurità (0.01%) e acidità (0.49% in acido oleico); mentre si è evidenziato un certo stato di ossidazione in base ai valori del numero di perossidi (28.2 meq O2/kg), del K232 (5.13), del contenuto in acidi grassi ossidati (13.92 mg/100 mg) e del contenuto in composti carbonilici volatili (465 mg/kg). E stata riscontrata la presenza di luteina (5 mg/kg) e non di beta-carotene e di un buon contenuto in pigmenti clorofilliani (51.8 mg/kg). Per quanto concerne la composizione in acidi grassi, l alto tenore in PUFA (79.25%) e il rapporto ω6/ω3 pari a 3.20 confermano l ottimale apporto nutrizionale dell olio di canapa. La composizione sterolica ha messo in risalto il beta-sitosterolo quale componente principale e un buon livello di steroli totali (4393 mg/kg). Dall analisi del profilo trigliceridico il picco della LLL (16.78%) è risultato essere quello prevalente in un range di classi ECN da 30 a 52. Il contenuto in tocoferoli totali è risultato essere pari a 928 mg/kg con un rapporto tra i vari isomeri simile a quello di un olio di soia. Dal punto di vista dei composti fenolici è stata messa in evidenza la presenza di acido cinnamico. Infine dall analisi multi-screening delle vitamine si è evidenziata la presenza di vitamina A, D2, K1, B3 (PP) coenzima Q10 e Q9, Ubichinolo 9. Chemical characterization of oil obtained by the cold pressing of Cannabis sativa L. seeds The present paper has focused its attention on the chemical characterization of the oil obtained from cold pressed hulled Cannabis Sativa L. seeds. 139

6 The Cannabis Sativa L. is a plant belonging to the Cannabinacee family, and it is annual, herbaceous, very rustic, not very demanding, adaptable to all soil types. It is also one of the most well-known plants in traditional medicine and one of the most studied from a phytochemical point of view. The hemp seeds and the products derived from it are important not only for their nutritional values but have also shown beneficial effects regarding haematic cholesterol, triglycerides, in lowering blood pressure, in dermatitis care, in the degenerative illnesses of the immune apparatus and of the breathing apparatus. Also there have been found in them uses in the field of food as integrator for traditional medicine preparation. The chemical characterization has regarded the principal quality parameters, the content and the fatty acids, sterols and triglycerides composition, oxidized fatty acids, oxidized tocopherols and carbonylic volatile compounds. Moreover, we have determined the principal vitamins contents, pigments contents (chlorophylls and carotenoids) and characterized phenolic compounds profile. The values of some parameters are within the Codex limits for virgin olive oils obtained from pressed seeds, for instance humidity (0.08%), impurity (0.01%) and acidity (0.49% as oleic acid); while it has been evidenced a sure oxidized status on the basis of peroxide number (28.2 meqo2/kg), of K232 (5.13), oxidized fatty acids (13.92 mg/100 mg) and of the carbonylic volatile compounds content (465 mg/kg). Lutein presence was checked (5 mg/kg), there was an absence of beta-carotene but a presence of a good chlorophyllian pigment content (51.8 mg/kg). Concerning the fatty acids composition the high content of PUFAs (79.25%) and the ratio of ω6/ω3 of 3.20 confirms the good nutritional contribution of hemp oil. The sterolic composition has evidenced β-sitosterol as a principal component and a good level of total sterols (4393 mg/kg). From a profile of the triglycerides analysis the peak of LLL (16.78%) resulted in the prevailing of a range of ECN classes from 30 to 52. The total tocopherols content resulted to be of 928 mg/kg with a ratio between the different isomers similar to that of soybean oil. From the point of view of phenolic compounds it has been pointed out the presence of cinnamic acid. At last from the multi-screening analysis of vitamins it has been evidenced the presence of vitamin A, D2, K1, B3 (PP), coenzyme Q10, Q9 and Ubichinol

7 INTRODUZIONE L olio ottenuto dai semi di Cannabis sativa è una fonte eccezionalmente ricca in acidi grassi insaturi, in particolare dell acido grasso essenziale acido linoleico (18:2, ω6), dell acido alfa linolenico (18:3, ω3) e dei loro metaboliti quali l acido γ- linolenico (18:3, ω6) e l acido stearidonico (18:4, ω3), che l uomo non può assolutamente sintetizzare ma deve approvvigionarsi con la dieta [1-9]. A differenza degli acidi grassi a corta catena, gli acidi grassi a lunga catena intervengono nella formazione delle membrane cellulari e sono precursori per la sintesi di importanti regolatori biochimici del corpo umano (prostaglandine). Dal punto di vista nutrizionale, una sua caratteristica importante è il rapporto ideale tra gli acidi grassi essenziali ω6/ω3 di 3:1, valore attualmente raccomandato dall Organizzazione Mondiale della Sanità che rende questo olio perfettamente equilibrato per la sua assunzione. I semi di canapa presentano un contenuto in olio compreso tra il 10-15%, contengono il 20-25% di proteine, il 20-30% di carboidrati, il 10-15% di fibre insolubili e sono ricchi in minerali. I semi di canapa, in aggiunta al loro valore nutrizionale, hanno dimostrato effetti benefici riguardanti l abbassamento del colesterolo, della pressione sanguigna e hanno mostrato impieghi nel campo alimentare e nelle preparazioni della medicina tradizionale. Visto l alto grado di insaturazione questo olio può essere anche usato nel settore degli inchiostri, delle vernici, della detergenza e dei saponi, mentre nel campo cosmetico la presenza di acido γ- linolenico lo rende ideale quale olio per il corpo e come ingrediente di creme cosmetiche con alta capacità penetrante nella pelle. Inoltre gli oli ottenuti per pressatura a freddo possono ritenere molti componenti benefici dei semi compresi gli antiossidanti naturali [31]. In questo lavoro l olio ottenuto dai semi di canapa è stato caratterizzato chimicamente analizzando i principali parametri di qualità, il contenuto e la composizione in acidi grassi, steroli e trigliceridi, e lo stato ossidativo mediante l analisi degli acidi grassi ossidati, dei tocoferoli ossidati e dei composti carbonilici volatili. Inoltre sono stati determinati i contenuti delle principali vitamine, dei pigmenti (clorofille e carotenoidi) e dei composti fenolici. Visto l elevato grado di insaturazione, come per tutti gli altri oli da semi è necessario conservarlo in ambienti freschi e bui per evitare l ossidazione e l irrancidimento. Lo stesso olio di canapa qui caratterizzato era stato in precedenza sottoposto ad analisi multiscreening dei principali contaminanti, quali micotossine, ftalati, idrocarburi policiclici aromatici, metalli e residui di fitofarmaci ed i risultati ottenuti sono stati recentemente pubblicati [10]. PARTE SPERIMENTALE CAMPIONI Il campione era costituito da un olio di canapa ottenuto mediante un procedimento di spremitura a freddo dei semi di canapa previamente decorticati. La resa di estrazione dell olio è risultata 141

8 142 essere del 10.1%. Esso mostrava un caratteristico colore verde-giallo e un odore di noce tostata, nocciola e frutta immatura. METODI DI ANALISI Nella Tabella I vengono elencati i parametri ed i metodi utilizzati per la caratterizzazione dell olio di canapa. RISULTATI E DISCUSSIONE UMIDITÀ, IMPURITÀ, ACIDITÀ LIBERA, NUMERO DI PEROSSIDI E ANALISI SPETTROFOTOMETRICA NELL UL- TRAVIOLETTO In Tabella II sono riportati i risultati ottenuti per alcuni dei parametri di qualità dell olio di canapa analizzato. I risultati si riferiscono alla media di due determinazioni indipendenti. I valori di umidità e sostanze volatili, delle impurità insolubili e dell acidità sono in accordo con gli standard di qualità previsti dal Codex Alimentarius per gli oli vegetali ad uso alimentare, dove per gli oli vergini ottenuti con procedimenti meccanici a freddo il valore dell umidità è max 0.2% m/m, delle impurità insolubili max 0.05% m/m e dell acidità max 4.0 mg KOH/g olio che corrisponde ad un acidità max 2.0% espressa come acido oleico. Il valore del numero di perossidi trovato nell olio di canapa (28.2 meqo2/kg olio) è invece più elevato rispetto a quello previsto dagli standard del Codex Alimentarius per un olio pressato a freddo, dove il valore è max 15 meqo2/kg olio (Codex Stan ) [11]. Il numero di perossidi pari a 28.2 meqo2/kg olio indica la presenza di uno stato di ossidazione significativo, trattandosi di un olio ad alto grado di insaturazione in cui gli acidi grassi polinsaturi costituiscono circa l 80% del totale. Infatti è noto che l olio di canapa, per la sua caratteristica composizione in acidi grassi, irrancidisce facilmente, producendo un odore sgradevole e portando ad una consistenza collosa del prodotto per le reazioni di polimerizzazione a carico dei suoi componenti. Il valore trovato per l acidità (0.49%) indica una buona qualità della materia prima impiegata, un buono stato di conservazione del seme e una corretta procedura nel processo di estrazione meccanica dell olio. Nella medesima tabella sono inoltre riportati i valori degli indici spettrofotometrici nella regione dell UV, misurati mediante uno spettrofotometro UV/VIS. Essi sono calcolati come assorbanze specifiche K232 e K270 di una soluzione all'1% dell'olio in esame in cicloesano in una cuvetta di quarzo dello spessore di 1 cm. I valori degli indici spettrofotometrici nell ultravioletto trovati nel campione di olio di canapa (K232 = 5.13, K270 = 0.37) differiscono dai valori riportati dalla letteratura soprattutto per il valore del K232 [6]. L alto valore di K232 trovato nel campione di olio in studio potrebbe confermare con il dato proveniente dal numero di perossidi uno stato di ossidazione già particolarmente elevato. COLORE, CAROTENOIDI, CLOROFILLE E PIROFEOFITINE Sul campione di olio di canapa in esame è stato valutato il colore determinando gli assorbimenti specifici dei composti clorofilliani e dei carotenoidi di una soluzione di olio in esano al 10% (v/v) e misurati mediante uno spettrofotometro UV/VIS alle lunghezze d onda 670, 610, 560 e 535 nm per i composti clorofilliani e 482, 475, 453, 448, 428, 414 e 412 nm per i carotenoidi. In Tabella III vengono riportate le caratteristiche di qualità del colore espresse come assorbimenti specifici alle lunghezze d onda rispettivamente dei composti clorofilliani e dei carotenoidi, confrontati con i dati presenti in letteratura per alcuni oli vergini di canapa commerciali [6]. Rispetto agli oli riportati dalla letteratura l olio di canapa oggetto dello studio presenta assorbimenti maggiori nella regione dei carotenoidi (

9 nm) rispetto agli assorbimenti delle clorofille ( nm). L olio di canapa mostra forti assorbimenti anche nelle regioni del vicino ultravioletto, nelle zone di lunghezze d onda comprese tra nm e nm che corrispondono alle zone dei raggi UV-A ( nm), UV-B ( nm) e UV- C ( nm). E quindi possibile ipotizzare che l olio di canapa potrebbe fornire una buona protezione nei confronti dei raggi UV-B e UV-A, responsabili quest ultimi dell invecchiamento cutaneo, ed essere utilizzato come fattore di protezione nei confronti dei raggi ultravioletti, con impieghi cosmetici come già riscontrato da altri autori [6]. I carotenoidi sono sostanze naturali con numerosi ruoli biochimici, comprese le funzioni di recettori della luce e di fotoprotezione durante il processo della fotosintesi. A livello umano numerosi studi hanno relazionato il contenuto dei carotenoidi e l effetto protettivo contro lo sviluppo di alcune forme di cancro, la loro attività antiossidante e di quenching durante i meccanismi ossidativi. L analisi è stata condotta attraverso un metodo interno, pesando 0.5 g di olio in 10 ml di acetone ed iniettando 20 μl della soluzione direttamente in un sistema analitico HPLC-PDA, monitorando il profilo cromatografico a 455 nm (VIS). Il contenuto è stato espresso utilizzando beta-carotene come standard esterno. Nella Tabella IV vengono riportati i valori dei caroteni espressi in mg/kg. Dall analisi del cromatogramma non è stata rivelata la presenza di beta-carotene ma solo di luteina a livelli molto bassi (5 mg/kg). In altri lavori bibliografici erano stati riscontrati valori di carotenoidi in misura di mg/kg in olio di canapa [7]. Vista l elevata intensità del colore verde dell olio di canapa si è proceduto alla determinazione del contenuto in clorofilla A, feofitine e pirofeofitina A secondo un metodo interno di cromatografia liquida e rivelatore PDA registrando il cromatogramma a 410 nm. L olio (0.5 g) è stato disciolto con acetone in un matraccio tarato da 10 ml e iniettato tal quale nel sistema cromatografico. Il contenuto dei pigmenti rivelati è stato espresso in mg/kg utilizzando la clorofilla A come standard esterno. Nella Tabella IV vengono riportati i valori ottenuti dalla media di due determinazioni indipendenti. La forma prevalente è costituita dalle Feofitine A+A1, mentre si registra un contenuto inferiore per la clorofilla A. Non abbiamo trovato lavori bibliografici in letteratura che riportino i valori relativi a questi composti nell olio di canapa. La presenza di Pirofeofitina A è legata ai trattamenti termici di deodorazione o di invecchiamento e nell olio extra vergine di oliva di nuova produzione è presente in misura dell 1% rispetto alla somma delle Feofitine A+A1 + Pirofeofitina A. In questo caso la % corrisponderebbe a 9.1% nell olio di canapa evidenziando la suscettibilità all ossidazione di questa matrice. E possibile affermare che per questa matrice i pigmenti clorofilliani prevalgono rispetto a quelli carotenoidei. ACIDI GRASSI (CONTENUTO E COMPOSIZIONE) La determinazione degli acidi grassi è stata eseguita sottoponendo l olio a un processo di transesterificazione diretta in fiala chiusa in soluzione metanolica di idrossido di potassio, in presenza di uno standard interno (C17- acido eptadecanoico), al fine di ottenere i corrispondenti esteri metilici degli acidi grassi (FAME), analizzati mediante gascromatografia in colonna capillare con rivelatore a ionizzazione di fiamma (FID). L'analisi gascromatografica permette di risalire alla composizione quali-quantitativa in acidi grassi dell'olio in esame e rivelare eventuali adulterazioni. In Tabella V sono riportati i contenuti in acidi grassi espressi in g/100 g di olio nel campione in esame e la composizione percentuale sul totale degli acidi grassi. Inoltre sono riportati i dati presenti in letteratura per altre due varietà di olio di canapa. Come si può osservare l olio di canapa è un prodotto altamente insaturo, con un elevato contenuto di acidi grassi polinsaturi (PUFAs) rappresentati dai due principali acidi grassi essenziali (EFAs) come l acido linoleico (18:2 ω6, LA) e l acido α- linolenico (18:3 ω3, ALA) e dai loro metaboliti biologici quali l acido γ-linolenico (18:3 ω6, GLA) e l acido stearidonico o acido octadecatetraenoico (18:4 ω3, SDA). E da puntualizzare che l alta percentuale di acido linoleico e di α-linolenico favorisce i processi di irrancidimento ossidativo, i quali possono essere limitati sottoponendo l olio a idonei sistemi di stoccaggio (basse temperature) e conservazione in atmosfera controllata di gas inerti. Gli acidi grassi essenziali non possono essere sintetizzati dai mammiferi ma, essendo precursori indispensabili per la sintesi di altri prodotti, devono 143

10 144 essere presenti nella dieta e perciò ricavati direttamente dalle fonti alimentari. Il ruolo essenziale degli EFAs nella dieta dell uomo è legato alla loro trasformazione in prodotti intermedi e finali attraverso differenti vie metaboliche. L acido linoleico una volta assunto con la dieta può venire trasformato in altri acidi grassi polinsaturi, come l acido γ-linolenico e l acido arachidonico. Quest ultimo è un importante precursore della famiglia degli eicosanoidi (prostaglandine e trombossani), sostanze ormono-simili coinvolte in molti processi biochimici importanti per lo stato di salute dell uomo come la regolazione della pressione sanguigna, degli stati infiammatori, delle funzioni riproduttive e dei processi di coagulazione del sangue. L acido α-linolenico viene invece trasformato sia nell acido eicosapentenoico (EPA), sia nell acido docosaesenoico (DHA). Nell olio di canapa da noi analizzato gli acidi grassi essenziali sono presenti in quantità elevata, in particolare l acido linoleico rappresenta il 55.75% del totale degli acidi grassi seguito dall acido α- linolenico pari a 17.37% e dagli acidi γ-linolenico (4.65%) e stearidonico (1.48%). La presenza di questi ultimi due acidi grassi rende questo olio unico nel suo genere, in quanto essi non si ritrovano nei semi oleaginosi tradizionali ad uso industriale, ma sono presenti in proporzioni variabili solo in alcune piante oleaginose non industriali come l olio di borragine, l olio di primula, l olio di ribes nero e di germe di grano [2]. Gli acidi grassi polinsaturi rappresentano il 79.25% del totale degli acidi grassi, mentre gli acidi grassi saturi e monoinsaturi rispettivamente il 9.86% e il 10.91%. Un rapporto elevato tra acidi grassi polinsaturi e acidi grassi saturi (PUFAs/SFAs = 8.04) è considerato vantaggioso nella riduzione dei livelli del colesterolo nel sangue e nella prevenzione delle patologie coronariche [5]. Come si può osservare dai dati della Tabella V il profilo degli acidi grassi del campione da noi analizzato è confrontabile con quello riportato dalla letteratura per gli oli di canapa di due diverse cultivar. Leggere differenze si notano nella ripartizione degli acidi ω3 e ω6 dovute alla variabilità delle cultivar selezionate. In particolare le quantità degli acidi γ- linolenico e stearidonico sembrano essere determinate geneticamente e il loro contenuto è normalmente più alto nella varietà Finola (Finlandese) rispetto ad altre cultivar [2, 12]. Un significato rilevante per la salute dell uomo assume il rapporto ω6/ω3 tra gli acidi grassi essenziali. Nella maggior parte degli oli vegetali il rapporto ω6/ω3 non è ottimale, a causa della compe-

11 tizione tra i due acidi grassi per l accesso all enzima delta-6 desaturasi che promuove l accumulo dei prodotti intermedi, ostacolando il metabolismo degli acidi grassi. Fino a 10 anni fa la FAO e l Organizzazione Mondiale della Sanità (WHO) [13] stabilivano che un rapporto ottimale tra ω6/ω3 doveva essere compreso tra 5:1 e 10:1. Di conseguenza l olio di soia era ritenuto il miglior prodotto per la salute dell uomo in quanto il rapporto ω6/ω3 è circa 7:1. Solo recentemente nuovi studi clinici hanno suggerito un diverso rapporto ω6/ω3 prendendo in considerazione la dieta giapponese e quella mediterranea dove l incidenza delle malattie coronariche risulta tra le più basse. Questi studi hanno portato a riconsiderare il rapporto portando il valore ottimale ω6/ω3 nell intervallo tra 2:1 e 3:1. Il rapporto ω6/ω3 ottenuto nell olio di canapa in esame (3.20) si avvicina al valore ideale, infatti è compreso in questo range e corrisponde a quello consigliato e accreditato dalle ricerche mediche per l assunzione degli acidi grassi essenziali (ISSFAL, Società Internazionale per lo studio degli acidi grassi). In parallelo è stata condotta anche una determinazione della composizione acidica mediante trans esterificazione con benzilato sodico 1.0 M in alcool benzilico a freddo e successiva analisi cromatografica in HPLC, secondo un metodo sviluppato per la determinazione del contenuto degli acidi grassi ossidati rispetto a quelli naturali nell olio di oliva [14, 15]. Gli acidi grassi separati cromatograficamente vengono rivelati a 255 nm e calcolati per normalizzazione a 100. I dati ottenuti sono comparabili con quelli riportati in Tabella V. ACIDI GRASSI OSSIDATI, CLnA e CLA Con la medesima metodologia HPLC utilizzata per la determinazione dei benzilesteri degli acidi grassi è stata effettuata la valutazione quantitativa degli acidi grassi ossidati presenti sui trigliceridi, dopo trans esterificazione con benzilato sodico [15]. Con il metodo applicato è possibile determinare le forme primarie dell ossidazione, costituite dalla forme idroperossidiche e le forme secondarie derivate da queste, quali ad esempio i derivati idrossi, epossi, epidiossi e cheto, che nella Tabella VI vengono riportate come Ox1 e Ox2. Il contenuto in acidi grassi ossidati totali viene espresso in mg/100 mg utilizzando la benzileptadecanoina come standard interno. Nella Tabella VI vengono riportati i quantitativi ottenuti per l olio da pressione affiancati per paragone ai valori massimi riscontrati per l olio extravergine di oliva dopo 12 mesi di conservazione in normali condizioni ambientali (temperatura ambiente, vetro scuro). Il valore ottenuto nel campione di olio in analisi, pari a mg/100 mg è abbastanza elevato e si può giustificare dal fatto che questa matrice, altamente insatura, è sicuramente molto soggetta ai fenomeni ossidativi e per questo motivo deve essere conservata in condizioni idonee (atmosfera inerte, buio, assenza di battente di ossigeno, ambiente fresco), e in ogni caso dal punto di vista della sicurezza alimentare o dell impiego farmaceutico, lo stato di ossidazione sarà un fattore che dovrà essere spesso monitorato. Con lo stesso metodo è stato inoltre possibile determinare il contenuto in acidi grassi trienici coniugati del C18:3 (CLnA) e quelli dienici del C18:2 (CLA), nelle forme c,t / t,c / t,t. Gli acidi grassi coniugati dell acido linoleico studiati in particolare nel latte per i loro effetti benefici a livello di anticancerogenicità, antiaterogenicità, promotori della crescita, antiobesità, immunomodulatori destano molta attenzione quando presenti all interno di una matrice alimentare [16]. Essi sono una miscela di isomeri geometrici e posizionali dell acido linoleico, nelle forme cis-trans, trans-cis e trans-trans (queste ulti- 145

12 146 me prevalenti in matrici sottoposte a trattamenti chimico-fisici). Tali composti, oltre ad essere presenti in piccole quantità anche naturalmente, possono derivare da forme di riarrangiamento dei prodotti di ossidazione o nel caso di oli raffinati, durante il passaggio sulle terre decoloranti. Con il metodo impiegato sono stati monitorati gli acidi grassi coniugati dell acido linolenico (CLnA), al momento ancora poco studiati ma presumibilmente in grado di avere gli stessi effetti positivi dei CLA. Entrambi devono essere sempre presenti in una forma equilibrata, in quanto maggiormente predisposti al fenomeno dell ossidazione lipidica rispetto alle forme non coniugate. Il valore in acidi coniugati riscontrato è risultato essere non molto elevato, di poco superiore a quello degli oli extra vergini di oliva dell area mediterranea all interno di un anno di conservazione (CLnA = 0.60% massimo, CLA = 0.40% massimo). COMPOSTI CARBONILICI VOLATILI (CVC) Il profilo relativo ai composti carbonilici volatili che si ritrovano nelle matrici liposolubili è legato alla composizione acidica e di conseguenza alla presenza dei prodotti di ossidazione degli acidi grassi che ad un certo punto si frammentano e formano composti aldeidico-chetonici a diversa lunghezza di catena. Tali prodotti sono responsabili di determinate sensazioni organolettiche legate alla loro concentrazione; in funzione di quest ultima e della matrice in cui si ritrovano possono causare la percezione di note sensoriali positive o negative. Si tratta di un profilo molto complesso e in particolare con la metodologia da noi sviluppata è possibile determinare questi composti nell intervallo C4-C12 [17]. Nella Tabella VII sono stati riportati i valori ottenuti per l olio di canapa. In questo caso l olio è stato sottoposto a reazione di derivatizzazione con 2,4- dinitrofenilidrazina in acetonitrile e successiva analisi cromatografica in HPLC-UV monitorando il cromatogramma a 360 nm ed esprimendo il contenuto di ciascun composto carbonilico in dodecanale derivatizzata e utilizzata come standard interno. Nell olio di canapa oggetto del presente lavoro sono stati riscontrati valori di CVC pari a 465 mg/kg, per esperienza abbastanza elevati, se si pensa che in un olio ad uso alimentare diretto quale l olio extra vergine di oliva, un valore del genere coincide solitamente con un prodotto ad avanzato stato ossidativo. Tra i composti analizzati prevalgono l esenale, l esanale e la nonenale. In letteratura sono state riscontrate per l esenale le note sensoriali tipiche del verde, erbaceo, foglia, frutta verde, mandorla, fruttato, carciofo e floreale, per l esanale le caratteristiche del verde, erba, fresco, fruttato e per la nonenale le caratteristiche di aldeide, cocomero, sego, pelle vecchia. Altri autori hanno confermato la presenza di queste aldeidi [18] nell analisi dell olio di canapa attraverso lo spazio di testa. STEROLI (COMPOSIZIONE E CONTENUTO) I fitosteroli appartengono alla famiglia dei triterpeni, composti di origine naturale che comprendono un ampia gamma di steroli vegetali (circa 4000 diversi composti chimici). Questi composti non possono essere sintetizzati direttamente nell uomo, pertanto derivano unicamente dalla dieta. Sebbene siano stati identificati più di 100 differenti tipi di fitosteroli, i più comuni sono il beta-sitosterolo, il campesterolo e lo stigmasterolo. Gli alimenti con il maggior contenuto di fitosteroli sono gli oli vegetali, la frutta a guscio, i cereali e i loro derivati. Negli oli vegetali gli steroli sono presenti sia in forma libera che in forma esterificata con gli acidi grassi. I fitosteroli svolgono un ruolo importante in diversi settori, da quello farmaceutico a quello nutrizionale e per finire in quello cosmetico. L'effetto ipocolesterolemizzante dei fitosteroli è stato evidenziato per la prima volta nel Sebbene varie ricerche abbiano principalmente dimostrato l efficacia del beta-sitosterolo nella riduzione del colesterolo, numerosi altri studi scientifici e clinici hanno constatato che anche l assunzione di altri fitosteroli potrebbe ridurre le concentrazioni

13 del colesterolo presente nel sistema circolatorio (totale e LDL) del 5-15% e rappresentare pertanto uno strumento importante nella riduzione del rischio cardiovascolare. Gli steroli vegetali intervengono sul meccanismo di assorbimento del colesterolo, bloccandolo attraverso fenomeni di cristallizzazione e coprecipitazione. L esclusione del colesterolo nella formazione delle micelle riduce la sua solubilità e ne impedisce l assorbimento nel lume intestinale. Inoltre a livello della mucosa intestinale esiste una concorrenza per l assorbimento tra gli steroli e il colesterolo [7]. Il profilo degli steroli e il loro contenuto sono caratteristici di ciascuna specie botanica; pertanto la determinazione della composizione degli steroli è ampiamente applicata come uno strumento efficace e affidabile per determinare la genuinità di un olio. In Tabella VIII è riportata la composizione percentuale relativa degli steroli dell olio di canapa e il contenuto totale espresso in mg/kg di olio nel campione in esame. Come si vede dai dati tabulati, nell olio di canapa si riscontra la varietà di fitosteroli che normalmente si ritrovano negli oli vegetali: il beta-sitosterolo è il componente maggiormente rappresentato, seguito dal campesterolo, stigmasterolo e delta-5-avenasterolo presenti in discrete percentuali. TRIGLICERIDI L analisi della composizione trigliceridica è stata eseguita mediante HPLC-RI [19-21]. La caratterizzazione del profilo trigliceridico è molto importante per la definizione della classe botanica così come quella degli acidi grassi. Il profilo cromatografico ottenuto rappresenta il fingerprinting della matrice specifica all interno di range di variabilità naturali che vanno definiti. I trigliceridi si separano nelle condizioni analitiche utilizzate in funzione del loro valore di ECN (equivalent carbon number) dato dalla differenza tra il numero di carboni totali (CN) e il numero di doppi legami (2DB). La composizione trigliceridica rispecchia quella acidica; infatti è possibile notare forme trigliceridiche molto insature, comprese nel range tra ECN30 ed ECN52. Le classi prevalenti sono quelle degli ECN42 a cui appartiene in maggior misura il picco della trilinoleina (LLL) ed ECN44 a cui appartengono i picchi LLO ed LnOO in egual misura. Nella Tabella IX sono riportate tutte le classi trigliceridiche individuate per l olio di canapa e la loro ipotesi di identificazione, mentre nella Tabella X (riassuntiva finale) sono riportati anche i valori delle 147

14 148 classi ECN di un olio di oliva preso ad esempio e di un olio di soia. TOCOFEROLI E TOCOTRIENOLI Questa classe di composti, ad alto valore antiossidante e vitaminico è composta in principal modo da 8 forme naturali: delta, gamma, beta ed alfa tocoferolo e dalle rispettive forme tocotrienoliche. Esse differiscono nella loro struttura chimica e nel grado di attività vitaminica. L alfa tocoferolo è la sostanza con maggiore attività vitaminica, ad esso viene attribuito il valore di 1.0 [22]. Le forme tocoferoliche vengono comunemente indicate con il termine di Vitamina E. Si tratta di sostanze labili e sensibili alla luce e all esposizione all aria. Gli oli di origine vegetale sono particolarmente ricchi di queste sostanze e i rapporti isomerici tra le varie forme sono legati all origine della materia prima, rappresentando una peculiarità. L attività vitaminica è massima in una matrice nuova, poi lentamente decade. I processi di raffinazione abbattono il contenuto in tocoferoli, così come il riscaldamento. La presente analisi è stata condotta sull olio tal quale, pesando 0.5 g in 10 ml di acetone ed eseguendo l analisi in HPLC a 292 nm [23]. Nelle condizioni analitiche utilizzate, la forma beta non si separa dalla forma gamma, e quindi tali forme sono state considerate insieme; tutte le forme sono state espresse come alfa tocoferolo. Per quanto riguarda il contenuto totale di tocoferoli presenti nell olio di canapa, si tratta di un contenuto abbastanza elevato (928 mg/kg), paragonabile a quello di un olio di soia ( mg/kg) o di girasole ( mg/kg). In altri lavori [6, 24, 25] sono stati riscontrati valori di tocoferoli dell olio di semi di canapa nei rapporti: delta, gamma+ beta, alfa 2:10:7, valori che si riscontrato anche per l olio di soia [8]. Per l olio di canapa in questione abbiamo ottenuto i rapporti di 1:26:1, differenti da quelli di riportati in bibliografia. I valori dei tocoferoli ottenuti per l olio di canapa in esame rientrano nei range riscontrati da altri autori, per la forma alfa e delta. E stato osservato invece un contenuto superiore della forma beta+gamma rispetto a quanto riportato in letteratura; solitamente la forma prevalente è la forma gamma, mentre la forma beta è presente in quantità inferiore. Nella Tabella XI sono stati riportati i quantitativi ottenuti per l olio di canapa analizzato. In aggiunta con la medesima metodologia è possibile quantificare anche l alfa tocoferilchinone, il prodotto di ossidazione dell alfa tocoferolo [26], monitorato a 268 nm. L alfa tocoferilchinone è presente nell olio di canapa in concentrazione paragonabile a quella riscontrata negli altri oli vegetali all interno del loro periodo di conservazione, riflettendo uno stato di ossidazione non indifferente. Non è stata invece riscontrata presenza di forme tocotrienoliche. VITAMINE È stato eseguito uno screening relativo alla determinazione di altre vitamine oltre alla vitamina E, alcune di natura idrofila (Vitamina B1, B2, B3 o PP, B5, B6, C, H, acido citrico, acido folico e acido lipoico), altre di natura lipofila (Vitamina A, D2, K1, Q10, Q9), mediante HPLC-MS/MS con interfaccia

15 APCI e spettrometro di massa a trappola ionica. Per ciascuna vitamina sono state ottimizzate le condizioni di ionizzazione e di acquisizione in SRM (selective reaction monitoring), determinando i valori di LOD e di LOQ strumentali. Non abbiamo individuato materiale bibliografico relativo al contenuto vitaminico nella canapa. Alcuni autori hanno rilevato la presenza di vitamina K nella Cannabis sativa [27]. Nella Tabella XII sono elencate le vitamine analizzate e i valori ottenuti per l olio di canapa in esame. Vengono inoltre riportati i valori dei livelli giornalieri raccomandati per i bambini da 0-12 mesi degli standard americani per la nutrizione [29]. Dall analisi dei risultati ottenuti si nota che sono presenti principalmente vitamine liposolubili, tra le quali la vitamina A (0.6 mg/kg), la vitamina D2 (1.7 mg/kg) e la vitamina K1 (0.10 mg/kg). Il Coenzima Q10 conosciuto come Ubichinone è risultato essere presente in quantità significativa (8.1 mg/kg) e i valori riscontrati rientrano nel range di valori relativi all olio di girasole (4-15 mg/kg) e di mandorle (5-14 mg/kg), mentre nell olio di soia se ne riscontrano mg/kg e nell olio di oliva mg/kg [30]. Inoltre, nel campione in esame prevale la forma ridotta, cioè l Ubichinolo 10, derivante dal meccanismo di attività antiossidante del primo. Nell olio di canapa analizzato è stata riscontrata anche una quantità di Coenzima Q9 pari a 23.5 mg/kg, espresso come Coenzima Q10, oltre alla sua forma ridotta di Ubichinolo 9. Per quanto riguarda le vitamine idrosolubili, esse sono quasi assenti nell olio di canapa in questione ad eccezione della vitamina B3 o PP, come acido nicotinico, in concentrazione di 0.90 mg/kg. FENOLI Per quanto riguarda questa classe di composti, da un indagine bibliografica risulta che negli estratti naturali di canapa, non sono stati riportati flavonoidi liberi, ma solo nella forma glucosidica [27]. In tale lavoro non viene riportato in quale parte anatomica della pianta sono stati riscontrati, ma in particolare sono stati evidenziati derivati dell apigenina quali la vitexina e l isovitexina, della luteolina e in particolare l orientina, derivati della quercetina e del kaempferolo. Per questo tipo di analisi è stato applicato il metodo messo a punto nel nostro istituto per i biofenoli 149

16 150 degli oli di oliva [28] e diventato norma NGD e COI, con il quale è possibile identificare i principali fenoli e flavonoidi comprensivi dei loro derivati glucosidici. I contenuti sono poi espressi in mg/kg di acido cinnamico utilizzato come standard esterno. Sul campione di olio di canapa, in base alle nostre conoscenze e in base agli standard di riferimento, non si sono evidenziate le forme libere e glucosidiche dell apigenina, della luteolina, della quercetina e del kaempferolo. Il composto prevalente ritrovato nell olio è l acido cinnamico. Alcuni composti non sono stati identificati in quanto non corrispondenti agli standard in nostro possesso. Nella Tabella XIII vengono riportati i valori riscontrati, ma il contenuto in fenoli nell olio di canapa è molto ridotto e poco significativo. CONCLUSIONI Nel presente lavoro di ricerca è stato caratterizzato chimicamente un olio di canapa ottenuto dalla spremitura a freddo dei semi di Cannabis sativa L. Le analisi eseguite hanno incluso i principali parametri di qualità, il contenuto e la composizione in acidi grassi, steroli e trigliceridi, la valutazione dello stato ossidativo mediante l analisi degli acidi grassi ossidati, dei tocoferoli ossidati e dei composti carbonilici volatili. Inoltre sono stati determinati i contenuti delle principali vitamine, dei pigmenti (clorofille, carotenoidi) e dei composti fenolici. Per quanto riguarda il valore di umidità e sostanze volatili riscontrato (0.08%), il valore delle impurità insolubili in etere di petrolio (0.01%) e il valore dell acidità libera riscontrata (0.49% acido oleico) sono risultati in linea con i valori previsti dal Codex Alimentarius per gli oli vegetali vergini ad uso alimentare ottenuti con procedimenti meccanici a freddo. Il valore del numero di perossidi (28.2 meqo2/kg) è invece più elevato rispetto a quello previsto dagli standard del Codex Alimentarius per un olio pressato a freddo e indica la presenza di uno stato di ossidazione primaria già in atto, trattandosi di un olio ad alto grado di insaturazione in cui gli acidi grassi polinsaturi costituiscono circa l 80% del totale. I valori degli indici spettrofotometrici nell ultravioletto determinati (K232 = 5.13, K270 = 0.37) differiscono dai valori riportati dalla letteratura soprattutto per il K232. Valori elevati di questi indici evidenziano uno stato di ossidazione particolarmente elevato, confermato anche dal valore di altre analisi (numero di perossidi e acidi grassi ossidati). Il colore è stato valutato misurando gli assorbimenti specifici nel visibile a determinate lunghezze d onda nelle regioni dei carotenoidi e delle clorofille. I valori riscontrati sono stati messi a confronto con gli assorbimenti di alcuni oli commerciali presenti in letteratura e hanno mostrato assorbimenti maggiori nella regione dei carotenoidi rispetto agli assorbimenti delle clorofille. Per quanto riguarda la classe di composti chimici naturali quali i carotenoidi è risultato che nell olio di canapa è presente solo la luteina e non è stata rilevata presenza di beta-carotene e dei suoi isomeri. L olio di canapa era caratterizzato da un intenso colore verde, infatti dalla determinazione dei pigmenti clorofilliani è risultato che questo contiene una quantità significativa di questi composti, superiore a quelli presenti ad esempio nella categoria degli oli extra vergini di oliva: i composti principali sono le feofitine A+A1, a seguire in ordine decrescente le feofitine B+B1, la pirofeofitina A e in ultimo la clorofilla A. Non sono stati trovati dati in letteratura relativi a questa classe di composti. Per quanto riguarda la composizione acidica l olio di canapa analizzato è risultato essere un importante fonte di acidi grassi essenziali. La sua particolare composizione in acidi grassi ha mostrato un elevata percentuale di acidi grassi polinsaturi (79.25%) rappresentati dai due principali acidi grassi essenziali quali l acido linoleico (18:2-ω6) e α-linolenico (18:3-ω3) più i loro metaboliti biologici come l acido γ-linolenico (18:3-ω6) e l acido stearidonico (18:4-ω3). Rispetto agli oli delle più comuni oleaginose industriali l olio di canapa possiede pertanto un elevata percentuale di acidi grassi 6 (60.40%) e ω3 (18.85%) presenti in un rapporto ottimale ω6/ω3 compreso tra 2:1 e 3:1, molto importante per i risvolti nutrizionali e nutraceutici. E stato però riscontrato un contenuto in acidi grassi ossidati non indifferente (13.92 mg/100mg). Sarà necessario quindi porre molta attenzione alle condizioni di produzione, stoccaggio e monitoraggio di questo prodotto, selezionando le condizioni migliori per la sua inalterabilità, quali la conservazione in atmosfera modificata, il buio, il fresco e l assenza di un battente di ossigeno. Gli acidi grassi coniugati sia del linolenico (CLnA) che del linoleico (CLA) non si sono dimostrati essere presenti in grossa quantità rispetto ad altre matrici con composizione acidica più satura, quali l olio di oliva, e notevolmente inferiori a quelli riscontrati e tipici del latte. È stato rilevato anche un contenuto elevato di com-

17 posti carbonilici volatili (465 mg/kg) provenienti dai processi di ossidazione sia enzimatica che chimica, mettendo in evidenza le componenti (esenale, esanale, nonanale) che ne influenzano le note olfattive legate all erbaceo, al verde, alla mandorla, all odore di aldeide e cocomero. La composizione degli steroli rilevata nell olio di canapa è quella che normalmente si riscontra negli oli vegetali. Esso rappresenta una buona sorgente di fitosteroli in cui il beta-sitosterolo (67.8%) rappresenta il componente presente in misura maggiore, seguito da campesterolo, delta-5-avenasterolo e stigmasterolo. Il contenuto di steroli totali ritrovato (4393 mg/kg) è in linea con i più comuni oli di semi industriali ad eccezione dell olio di colza e di mais in cui gli steroli totali sono decisamente più elevati. La determinazione del profilo trigliceridico ha confermato la natura altamente insatura dei principali trigliceridi distribuiti tra le classi ECN30 ed ECN52, con la prevalenza dei composti quali LnLLn, LnLL, LLL, LOO ed LnOO. La composizione totale in classi ECN avvicina questa matrice all olio di soia, presentando comunque una maggior insaturazione. L olio analizzato è risultato avere un contenuto in tocoferoli (928 mg/kg) in sintonia con altri lavori bibliografici presenti in letteratura, confermando che questo olio vegetale può essere considerato una buona fonte di vitamina E, al pari di un olio di soia o di girasole. Non sono stati riscontrati tocotrienoli. E stata osservata la presenza di un contenuto significativo di alfa-tocoferilchinone (10 mg/kg), prodotto di ossidazione dell alfa-tocoferolo e si ribadisce la necessità di condizioni controllate sia di produzione che di stoccaggio. Per quanto riguarda il contenuto vitaminico è stata riscontrata e quantificata la presenza delle Vitamine A, D2, K1, Coenzima Q10, Ubichinolo Q10, Coenzima Q9, Ubichinolo Q9, e Vitamina B3 (acido nicotinico). Dalla caratterizzazione dei fenoli non sono stati individuati come ritrovato in alcuni lavori bibliografici presenza di apigenina in forma libera e dei suoi derivati glucosidici quali la vitexina e l isovitexina, così come la luteolina in forma libera e i suoi derivati glucosidici quali l orientina. Non sono stati ritrovati neanche flavonoidi quali la quercetina e il kaempferolo citati in altri lavori. Il componente peculiare individuato nell olio è stato l acido cinnamico. BIBLIOGRAFIA [1] C.E. Turner, M.A. Elsohly, E.G. Boeren, Constituents of Cannabis sativa L. XVII. A review of the natural constituents, J. Nat. Prod. 43, (1980) [2] J.C. Callaway, Hempseed as a nutritional resource: an overview, Euphytica 140, (2004) [3] M. Piccioni, Dizionario degli alimenti per il bestiame, Ed. EDAGRICOLE. V Edizione (1989) [4] F.V. Dulf, C. Bele, S. Spinean, V. S. Chedea, G. Zegrean, C. Socaciu, Comparative studies on fatty acid fingerprint from total lipids and phytosterols esters of some edible plant oils, Buletin USAMV-CN 62, (2006) [5] G. Fournier, Le Chanvre (Cannabis sativa L.) et sa reglementation europeenne en Teneurs en D9-THC des varieties cultivee en France, Ann. Toxic. Anal. 15(3), (2003) [6] B.D. Omomah, M. Busson, D. V. Godfrey, J. C. G. Drover, Characteristics of hemp (Cannabis sativa L.) seed oil, Food Chemistry 76, (2002) [7] C. Leizer, D. Ribnicky, A. Poulev, S. Dushenkov, I. Raskin, The Composition of Hemp Seed Oil and its Potential as an important Source of Nutrition, Journal of Nutraceuticals Functional & Medical Foods 2 (4), (2000) [8] H. Stambouli, A. El Bouri, T. Bouayoun, A. Belliman, Caracterisation de l huile de grains de Cannabis sativa L. Cultivè au nord du Maroc, Annales de Toxicologie Analytique 17 (2), (2006) [9] J.B. Roberts, T. Yazicioglu, Cannabis sativa (Moraceae). In Ucciani E. Nouveau dictionn. des huiles veget., (1995) [10] P. Fusari, P. Rovellini, L. Folegatti, D. Baglio, A. Cavalieri, Olio e farina da Cannabis sativa L. analisi multiscreening di micotossine, ftalati, idrocarburi policiclici aromatici, metalli e fitofarmaci, La Rivista Italiana delle Sostanze Grasse 90, 9-19 (2013) [11] CODEX STAN Codex Standard for edible fats and oils not covered by individual standards. Adopted Revisions 1987, Amendment 2009 [12] J.C. Callaway, T. Tennila, D.W. Pate, Occurence of omega-3 stearidonic acid (cis-6,9,12,15-octadecatetraenoic acid) in hemp (Cannabis sativa L.) seed, Journal of the International Hemp Association 3(2), (1996) [13] FAO/WHO/UNU. Energy and Protein Requirements. Report of a Joint Expert Consultation. Geneva, Switzerland: Technical report series no. 724, World Health Organization (1985) [14] N. Cortesi, P. Rovellini, Cromatografia liquida ad alta risoluzione dei derivati benzilici degli acidi grassi e dei loro isomeri. La Rivista Italiana delle Sostanze Grasse 71, (1994) [15] NGD C88:2007, Determinazione dello stato di ossidazione degli oli vergini di oliva mediante HPLC 151

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19 Determinazione diretta di alcuni metalli negli oli extra vergini di oliva mediante assorbimento atomico con fornetto di grafite (GF-AAS) D. Baglio L. Folegatti* INNOVHUB - SSI Azienda Speciale della Camera di Commercio di Milano Divisione SSOG - Milano Il presente studio ha lo scopo di sviluppare e validare i metodi di analisi per la determinazione di 14 elementi metallici (Al, As, Cd, Co, Cr, Cu, Fe, Mn, Mo, Ni, Pb, Sn, Zn e V) negli oli extra vergini di oliva mediante diluizione del campione in un solvente organico (cicloesano) e introduzione diretta in uno spettrofotometro ad assorbimento atomico dotato di un fornetto di grafite. I diversi metodi di analisi sono stati ottimizzati per adattarli alla tipologia dei campioni in esame, selezionando il migliore modificante di matrice e le migliori condizioni strumentali di temperatura per il processo di pirolisi e di atomizzazione. Le metodologie sono state successivamente validate determinando la linearità in un intervallo compreso tra 10 e 60 μg/kg di olio, la precisione in termini di ripetibilità, l accuratezza e la sensibilità in termini di limite di rilevabilità e di quantificazione. I risultati ottenuti sono stati confrontati con i metodi di riferimento ISO, ove disponibili, con ottima corrispondenza tra loro. I contenuti dei singoli metalli nei campioni sono poi stati utilizzati per classificare i diversi oli extra vergini di oliva sulla base delle origini geografiche impiegando tecniche chemiometriche ed in particolare l analisi delle componenti principali e l analisi discriminante lineare. Direct determination of some metals in extra virgin olive oils by graphite furnace atomic absorption (GF-AAS) The present study aims to develop and validate analytical methods for the determination of 14 metallic elements (Al, As, Cd, Co, Cr, Cu, Fe, Mn, Mo, Ni, Pb, Sn, Zn and V) in extra virgin olive oils by diluting the sample in an organic solvent (cyclohexane) and a direct introduction into a graphite furnace atomic absorption spectrophotometer. The different methods of analysis have been optimized to fit the type of samples, selecting the best matrix modifier and the best instrumental conditions of the temperature for the process of the pyrolysis and atomization. The methodologies were subsequently validated by determining the linearity in the range between 10 and 60 μg/kg of oil, the precision in terms of repeatability, the accuracy and the sensitivity in terms of the limit of detection and limit of quantification. The results obtained were compared with the ISO reference methods, when available, and showed good agreement between them. The content of the individual metals in the oil samples were then used to classify the different extra virgin olive oils on the basis of geographical origins using chemometric techniques and in particular principal components analysis and linear discriminant analysis. 153 *CORRISPONDENZA AUTORE: dr.ssa Liliana Folegatti Divisione SSOG Via Giuseppe Colombo Milano liliana.folegatti@mi.camcom.it Tel

20 INTRODUZIONE I metalli sono elementi ubiquitari, variamente distribuiti nell ambiente e si ritrovano nel suolo, nell acqua, nell aria e in molte matrici alimentari. Essi sono i costituenti naturali dei terreni e sono parte dell ecosistema, tuttavia le attività dell uomo hanno profondamente modificato la loro distribuzione e quantità nell ambiente [1, 2]. Gli elementi metallici non subiscono processi di degradazione, non vengono eliminati o ridotti una volta immessi nell ambiente e raggiungono così l uomo attraverso gli alimenti, l acqua e l aria. Come elementi in tracce alcuni di essi sono essenziali al mantenimento del metabolismo animale e vegetale e, in particolare, rientrano in questa categoria il Na, K, Ca, Mg, Fe, Cu, Zn e Mn. Altre specie metalliche possono risultare tossiche anche in concentrazioni molto basse e quindi rappresentare un rischio per la salute umana ed animale. Metalli quali il As, Cd, Pb, Cr, Co e Cu possono avere effetti negativi sulla salute, sia attraverso esposizioni croniche che accidentali. L agenzia per le sostanze tossiche e il registro delle malattie (ATSDR) degli Stati Uniti ha pubblicato una lista delle 275 sostanze organiche ed inorganiche maggiormente nocive per l uomo e per l ambiente (CERCLA Priority List of Hazardous Substances, 2003) e tra le prime 20 sostanze, 5 sono metalli pesanti (As, Pb, Hg, Cd e Cr) [3, 4]. Attualmente si registra un considerevole interesse nella determinazione delle specie metalliche negli alimenti. Tra le matrici alimentari anche l olio di oliva contiene specie metalliche e l entità della contaminazione dipende sia da fattori endogeni che esogeni [5, 6]. Tra i primi si annoverano la naturale composizione del suolo, dell acqua e dell aria e il contenuto elementare delle olive, dipendente dal genotipo della pianta. I fattori esogeni includono l impiego di pesticidi e/o fertilizzanti in agricoltura, la presenza di grandi vie di comunicazione o di industrie nelle vicinanze degli oliveti, i processi di produzione (attraverso i coadiuvanti di processo) o il contatto con le parti metalliche degli impianti e durante lo stoccaggio dell olio. Inoltre, i metalli di transizione quali Cu e Fe catalizzano i processi di ossidazione degli acidi grassi, esercitando un forte effetto deleterio sulla conservabilità dell olio stesso. Il contenuto di metalli pesanti negli oli è oggetto di normative a livello europeo e mondiale. In particolare, il Regolamento CE 1881/2006 e successive modifiche stabilisce una concentrazione massima tollerata nei grassi e oli alimentari per il Pb di 0.10 mg/kg [7]. Il Consiglio Oleicolo Internazionale ha posto come criterio di qualità per gli oli vergini di oliva un contenuto massimo pari a 3.0 mg/kg per il Fe e 0.1 mg/kg per Cu, Pb e As [8]. Gli stessi limiti sono presenti anche nella norma del Codex Alimentarius per gli oli di oliva e gli oli di sansa di oliva [9]. La determinazione dei metalli è un analisi difficoltosa in quanto alcuni di essi sono presenti in basse concentrazioni in una matrice ad alto contenuto organico [10]. Le tecniche analitiche maggiormente impiegate nell analisi dei metalli negli oli includono sia le spettrofotometrie di assorbimento che di emissione atomica. Il pre-trattamento del campione di olio è spesso necessario ed è eseguito allo scopo di decomporre la matrice organica oppure di estrarre i metalli dalla matrice stessa. Metodi alternativi prevedono la semplice diluizione del campione di olio in un solvente organico opportuno, l emulsione per la determinazione diretta delle specie metalliche presenti nell olio alimentare e l impiego dell analisi potenziometrica (derivative potentiometric stripping analysis) [11-15]. Il presente studio ha lo scopo di sviluppare e validare i metodi di analisi per la determinazione di 14 elementi metallici (Al, As, Cd, Co, Cr, Cu, Fe, Mn, Mo, Ni, Pb, Sn, Zn e V) negli oli extra vergini di oliva mediante diluizione del campione in un solvente organico e introduzione diretta in uno spettrofotometro ad assorbimento atomico dotato di un fornetto di grafite. I contenuti dei singoli metalli nei campioni saranno poi utilizzati per classificare i diversi oli extra vergini di oliva sulla base delle origini geografiche impiegando tecniche chemiometriche [16, 17]. 2. PARTE SPERIMENTALE 2.1. MATERIALI E REAGENTI Tutti i reagenti impiegati sono di grado ultra-puro. Il cicloesano (grado per spettrofotometria) e il 2- propanolo sono forniti dalla Carlo Erba (Milano, IT), le soluzioni standard dei metalli in olio (standard multielemento S21 alla concentrazione di 100 mg/kg, Arsenico alla concentrazione di 100 mg/kg e Cobalto alla concentrazione di 1000 mg/kg), e l olio bianco diluente sono forniti dalla Conostan (Nova Chimica, Milano, IT). La lecitina da soia è fornita dalla BDH (Milano, IT) e il modificante di matrice Pd(NO3)2 in 15% HNO3 (10000 mg/l di Pd) è fornito dalla Perkin Elmer (Monza, IT). I campioni analizzati erano 19 oli extra vergini di oliva di diversa provenienza geografica il cui dettaglio è riportato in Tabella I STRUMENTAZIONE Le analisi sono state condotte impiegando uno spettrofotometro ad assorbimento atomico modello AAnalyst 600 della Perkin-Elmer dotato di fornetto di grafite con correzione del rumore di fondo mediante effetto Zeeman longitudinale. Il fornetto di grafite montava tubi di grafite pirolitica riscalda-

21 ti trasversalmente con piattaforma integrata (THGA end-caps). I programmi di temperatura utilizzati per le analisi dei diversi metalli sono riportati in Tabella II. Le lampade utilizzate erano di tipo a catodo cavo (HCL) e a scarica senza elettrodi (EDL) a seconda dell elemento analizzato ed i dettagli sono riportati in Tabella III. L introduzione del campione è stata effettuata con un autocampionatore modello AS 800 della Perkin- Elmer e il volume iniettato era di 10 μl ad una temperatura iniziale del fornetto di 50 C. L acquisizione e l elaborazione dei dati è stata eseguita con il software WinLab PREPARAZIONE DEI MODIFICANTI DI MATRICE Per l analisi di Cd e Pb il modificante di matrice è composto da una soluzione al 2% di lecitina da soia (contenuto in fosforo del 2-3%) in cicloesano per spettrofotometria. Tale modificante è impiegato nella diluizione del campione in sostituzione del cicloesano, come previsto per l analisi degli altri metalli. Per l analisi di As e Sn il modificante di matrice è costituito da Pd(NO3)2 in 15% HNO3 (10000 mg/l di Pd) in 2-propanolo ad una concentrazione di 1000 mg/l. Tale soluzione è introdotta direttamente nella fornace insieme al campione diluito ad un volume di 1 μl per l analisi dell As e 2 μl per l analisi dello Sn PREPARAZIONE DELLE SOLUZIONI DI CALIBRAZIONE E DEI CAMPIONI Le soluzioni di calibrazione sono state preparate partendo da una soluzione standard di metalli in olio della Conostan (standard multielemento S21, concentrazione 100 mg/kg). Si è proceduto alla preparazione delle soluzioni standard di calibrazione aventi le concentrazioni di 10, 20, e 30 μg/kg, diluendo opportunamente la soluzione standard multielemento con olio bianco e con cicloesano in modo da ottenere un rapporto 1:1 (m/m) tra olio e solvente organico. Tali soluzioni erano preparate di fresco ogni volta ed iniettate prima di ogni serie di analisi. Per la determinazione dell As e del Co, non essendo inclusi nello standard multielemento dei metalli, si è proceduto analogamente, partendo dalle rispettive soluzioni concentrate a 100 mg/kg per l As e 1000 mg/kg per il Co. Per la determinazione di Cd e Pb, le soluzioni di calibrazione sono state preparate come descritto precedentemente sostituendo il cicloesano con una soluzione di lecitina da soia al 2% in cicloesano. Per l analisi dei campioni di olio extra vergine di oliva si sono pesati 1 g in un vial da 15 ml in polipropilene e si è aggiunto 1 g di cicloesano o di modificante di matrice nel caso di Cd e Pb, mantenendo un rapporto 1:1 (m/m) tra olio e solvente organico. Le soluzioni sono state poi omogeneizzate ed analizzate direttamente. Nel caso di concentrazioni dei metalli non comprese nell intervallo di calibrazione, i campioni sono stati diluiti con olio bianco e successivamente addizionati di cicloesano o di modificante di matrice, mantenendo sempre un rapporto 1:1 (m/m) tra olio e solvente organico ESPRESSIONE DEI RISULTATI I diversi metalli contenuti nel campione sono stati quantificati mediante una calibrazione con standard esterni. Le soluzioni standard sono state analizzate giornalmente e impiegate per la costruzione della retta di calibrazione, riportando in ascisse il valore di concentrazione dell elemento in esame in μg/kg ed in ordinate l area del picco transiente sottratta per il valore del bianco. La concentrazione dell elemento nel campione è stata poi calcolata considerando gli eventuali fattori di diluizione ed esprimendo il risultato finale in mg/kg di olio come media di due determinazioni indipendenti effettuate sullo stesso campione. 3. RISULTATI E DISCUSSIONE 3.1. OTTIMIZZAZIONE DEI METODI DI ANALISI PER I METALLI NEGLI OLI La determinazione dei metalli negli oli vegetali è un analisi difficoltosa in quanto alcuni di essi sono presenti in concentrazioni molto basse, dell ordine dei μg/kg. A seconda delle tecniche strumentali 155

22 156 utilizzate per la quantificazione dei metalli, il pretrattamento del campione è un passaggio obbligato per avere risultati attendibili e riproducibili. Il metodo più utilizzato è la digestione o mineralizzazione del campione effettuata sia in contenitori aperti che chiusi aggiungendo acidi o miscele di acidi e con l ausilio delle microonde. Tuttavia questo procedimento, se non correttamente applicato e controllato, può provocare una ulteriore contaminazione del campione in esame con metalli provenienti dai reattivi e/o dai materiali [10]. In letteratura sono presenti alcuni studi effettuati su oli alimentari in cui il campione è diluito con solventi organici (i più utilizzati sono il metil-isobutil chetone, il n-eptano e il cicloesano) ed analizzato direttamente con uno spettrofotometro ad assorbimento atomico [11, 12]. Questo procedimento ha il vantaggio di analizzare direttamente il campione, riducendo il rischio di contaminazioni, e comporta una minima diluizione del campione necessaria per ottenere dei risultati attendibili soprattutto per elementi metallici presenti in concentrazioni di sub-ppb. Tale metodologia è anche ripresa in alcuni metodi ufficiali di analisi per la determinazione del Fe, Cu

23 e Ni (ISO 8294:1994), Pb (ISO 12193:2004) e Cd (ISO 15774:2001) negli oli e grassi vegetali ed animali [18-20]. La scelta da noi effettuata è stata quella di ottimizzare le condizioni analitiche e strumentali per l analisi di una serie di metalli (Al, As, Cd, Co, Cr, Cu, Fe, Mn, Mo, Ni, Pb, Sn, Zn e V) diluendo il campione di olio in cicloesano ed analizzando i singoli elementi con uno spettrofotometro ad assorbimento atomico con fornetto di grafite. Questo strumento garantisce una elevata sensibilità, richiesta per l analisi di alcuni metalli, e permette l introduzione diretta del campione riducendo o eliminando l effetto matrice provocato dall olio stesso. A differenza delle analisi condotte in matrice acquosa sui campioni mineralizzati, la presenza del solvente organico e della matrice grassa ha richiesto una modifica dei programmi standard di temperatura del fornetto di grafite. Infatti l introduzione del campione è stata effettuata a 50 C e un primo riscaldamento a 200 C ha permesso l evaporazione del solvente e l omogenea distribuzione del campione sulla piattaforma integrata del tubicino di grafite. Il riscaldamento successivo a 450 C eliminava la matrice oleosa senza provocare la perdita degli elementi metallici. Le successive temperature di pirolisi e di atomizzazione erano invece caratteristiche per ogni elemento analizzato, ed alcune di esse sono state ulteriormente modificate rispetto a quelle raccomandate dal costruttore, al fine di ottenere un segnale più intenso e contemporaneamente ridurre il background prodotto dalla matrice. Le migliori condizioni strumentali sono riportate nella Tabella II per ogni singolo metallo e sono state ottenute iniettando una soluzione di calibrazione alla concentrazione di 40 μg/kg contenente tutti i metalli in olio e diluita con cicloesano (o modificante di matrice) in rapporto 1:1 (m/m). L utilizzo di un tubicino di grafite con piattaforma integrata ha portato ad ottenere una buona ripetibilità dell analisi e alla completa mineralizzazione del campione introdotto, comportando una ridotta manutenzione strumentale e una buona durata del tubicino stesso (fino a 900 iniezioni). Alcuni metalli necessitano della presenza di un modificante per essere analizzati e in particolare per quegli elementi aventi punto di ebollizione relativamente basso. Per il Pb e il Cd è necessaria la presenza di ioni fosfato che formano un composto stabile ad elevate temperature, sufficiente a garantire l eliminazione della matrice senza la perdita dei metalli. Per quanto riguarda As e Sn, la presenza di Pd permette la formazione di un composto stabile termicamente permettendo la loro determinazione anche a basse concentrazioni. Per poter eseguire l analisi direttamente sul campione di olio diluito, anche i modificanti di matrice devono essere solubili nei solventi organici. Nel caso dell analisi di Cd e Pb la scelta è stata quella di preparare una soluzione di cicloesano contenente lecitina da soia alla concentrazione di 2%. Questo ha permesso l analisi diretta dei campioni semplicemente diluendoli in questa miscela in sostituzione del solo cicloesano e, al fine di evitare problemi dovuti alla matrice, anche le soluzioni di calibrazione sono state preparate analogamente. Per quanto riguarda l analisi di As e Sn, in cui è richiesta la presenza del Pd, trovare un composto organico contenente Pd e solubile in solventi organici non è stato semplice. Si è quindi preparata una 157

24 158 soluzione in 2-propanolo del modificante di matrice utilizzato normalmente in soluzioni acquose, il Pd(NO3)2 in 15% HNO3 (10000 mg/l di Pd) ad una concentrazione di 1000 mg/l. Tale soluzione è stata iniettata nel fornetto insieme al campione di analisi VALIDAZIONE DEI METODI DI ANALISI I metodi di analisi ottimizzati sono stati poi validati internamente mediante la definizione dei seguenti parametri statistici: linearità, espressa in termini di intervallo di linearità della risposta di soluzioni standard preparate in olio; precisione, espressa in ter-

25 mini di deviazione standard della ripetibilità; accuratezza, calcolata mediante l analisi di un materiale di riferimento certificato; sensibilità espressa in termini di limite di rilevabilità (LOD) e limite di quantificazione (LOQ). La linearità del metodo è stata valutata mediante l analisi di soluzioni standard preparate direttamente in olio bianco e diluendole con cicloesano o con modificante di matrice in proporzione 1:1 (m/m). L intervallo di concentrazione analizzato è stato da μg/kg di olio per tutti i metalli ad eccezione del Cd e Pb per cui l intervallo di concentrazione analizzato è stato di μg/kg di olio. La precisione dei metodi è stata determinata effettuando 8 determinazioni su un campione di olio vegetale addizionato a tre diverse concentrazioni di metalli, in condizioni di ripetibilità. I risultati ottenuti sono stati sottoposti ad analisi della varianza per calcolare la deviazione standard relativa percentuale e la ripetibilità. L accuratezza del metodo è stata determinata analizzando un materiale di riferimento certificato. Il campione in esame era un olio esausto EnviroMAT (Conostan) contenente tutti i metalli da noi analizzati ad eccezione dell As e del Co, per i quali sono stati preparati dei campioni addizionati in olio extra vergine di oliva. Il limite di rilevabilità rappresenta il minimo segnale rilevabile con un errore accettabile, solitamente definito come il rapporto tra segnale e rumore uguale a 3. Il limite di quantificazione è definito come il rapporto tra segnale e rumore uguale a 10. Per il calcolo del LOD e LOQ è stato analizzato 8 volte un campione di olio bianco. Si è poi calcolata la deviazione standard delle 8 prove e i corrispondenti valori di LOD e LOQ come 3 volte e 10 volte il valore della deviazione standard. I risultati della validazione dei metodi di analisi sono riportati in Tabella IV. La linearità della risposta è molto buona nell intervallo di concentrazioni analizzato, coprendo tuttavia solo un ordine di grandezza (da 20 a 60 μg/kg); tale comportamento è tipico della tecnica strumentale da noi utilizzata. La deviazione standard relativa di ripetibilità dell analisi è compresa tra 1.1 e 13.2% per tutti i metalli analizzati, e il recupero si attesta tra %. I valori di LOD e LOQ sono compresi rispettivamente tra mg/kg e tra mg/kg, ampiamente inferiori ai limiti di legge previsti per alcuni metalli negli oli di oliva. Inoltre tali limiti sono in accordo con quelli riportati da altri autori che hanno impiegato un metodo di analisi analogo a quello da noi ottimizzato [11, 14] CONFRONTO DEI METODI DI ANALISI PER FE, CU, NI E PB CON I METODI DI RIFERIMENTO ISO La norma ISO 8294:1994 descrive il metodo di analisi per la determinazione di Fe, Cu e Ni in grassi e oli vegetali ed animali mediante assorbimento atomico con fornetto di grafite, mentre la norma ISO 12193:2004 riporta il metodo di analisi per il Pb nelle medesime matrici. Entrambe le norme riportano i limiti di ripetibilità e di riproducibilità che devono essere soddisfatti per l analisi di questi elementi nei campioni di oli e grassi. In Tabella V è riportato il confronto tra i parametri sperimentali dei metodi di analisi da noi sviluppati e quelli calcolati applicando le formule riportate nelle rispettive norme ISO. Come si può notare dai dati riportati in Tabella V, i valori di ripetibilità e riproducibilità sperimentali da noi misurati sono di molto inferiori rispetto a quelli teorici, calcolati a partire dalle formule riportate nelle norme ISO per Fe, Cu e Ni; sono invece in accordo per quanto riguarda l analisi del Pb. 159

26 160

27 Questo si spiega anche dal fatto che l intervallo di concentrazione considerato dalla norma ISO 8294:1994 per l analisi di Cu, Fe e Ni era di mg/kg per il Cu e mg/kg per il Fe e il Ni, molto più alto rispetto a quello da noi impiegato ( mg/kg), fornendo di conseguenza dati differenti rispetto a quelli da noi trovati ANALISI DEI METALLI CONTENUTI NEGLI OLI EXTRA VERGINI DI OLIVA I metodi di analisi ottimizzati sono stati poi utilizzati per determinare il contenuto delle 14 specie metalliche nei diversi campioni di oli extra vergini di oliva di diversa provenienza geografica. I risultati ottenuti sono riportati in Tabella VI. Come si può notare dai dati riportati in Tabella, in tutti i campioni analizzati il contenuto di As, Cd, Co, Cr, Mo, Pb, Sn e V è inferiore al limite di rilevabilità, attestando l assenza di questi metalli tossici negli oli extra vergini di oliva. Inoltre il contenuto di Fe è inferiore al limite di 3.0 mg/kg e il Cu è inferiore a 0.1 mg/kg, conformemente ai valori massimi ammissibili per questi elementi riportati nelle legislazioni europee e mondiali. I principali metalli presenti negli oli risultano essere Al (max di mg/kg), Cu (max di mg/kg), Fe (max di mg/kg), Mn (max di mg/kg) e Zn (max mg/kg). Tali valori sono anche in accordo con i dati riportati nella letteratura per gli oli extra vergini di oliva. Il contenuto di metalli negli oli extra vergini di oliva di differente origine geografica è stato poi analizzato mediante tecniche chemiometriche allo scopo di individuare delle relazioni tra i campioni e le provenienze geografiche. Infatti, la presenza di alcune specie metalliche potrebbe essere messa in relazione con l origine geografica dell olio in quanto caratteristica di un certo tipo di suolo e/o ambiente, oppure di un particolare trattamento agricolo applicato negli oliveti (uso di fertilizzanti quale il calcio fosfato o di pesticidi contenenti elementi metallici). I campioni sono stati considerati come singoli oggetti, mentre il contenuto dei metalli è risultato essere la variabile quantitativa, inoltre la provenienza è stata inserita come classe predefinita. I metalli considerati sono stati Al, Cu, Fe, Mn, Ni e Zn in quanto gli altri presentavano valori inferiori al limite di rilevabilità dei rispettivi metodi. Le tecniche chemiometriche utilizzate sono state l analisi delle componenti principali (PCA) e l analisi discriminante lineare (LDA). Come primo approccio è stata applicata l analisi delle componenti principali, la quale fornisce delle nuove variabili, indipendenti tra loro, che massimizzano la varianza dell intero sistema. Le prime due componenti principali da sole spiegano il 79.5% dell intera varianza del sistema. I campioni di oli extra vergini di oliva di diversa provenienza geografica non si differenziano tra loro. L analisi discriminante canonica o lineare calcola delle combinazioni lineari (definite variabili canoniche) delle variabili quantitative che meglio sintetizzano la diversità tra le classi, massimizzando la distanza tra le classi stesse. Anche in questo caso, i campioni relativi agli oli extra vergini di oliva analizzati non si differenziano tra loro. Una prima considerazione sugli scarsi risultati ottenuti applicando i metodi chemiometrici è la bassa numerosità dei campioni analizzati e la non omogeneità dei campioni stessi in quanto alcuni di essi si presentavano molto limpidi, mentre altri erano torbidi, indice di avvenuta decantazione per alcuni prima del campionamento. Lavori presenti in letteratura mostrano come le tecniche chemiometriche applicate all analisi dei metalli negli oli permettono la classificazione geografica degli oli stessi [16, 17]; quindi è auspicabile una nuova sperimentazione analizzando un maggior numero di campioni di oli extra vergini di oliva di diversa origine geografica, analizzati ad inizio campagna olearia in modo da uniformare anche la campionatura. 4. CONCLUSIONI In questo studio sono stati ottimizzati i metodi per l analisi di 14 specie metalliche negli oli extra vergini di oliva mediante diluizione del campione in un solvente organico e successiva iniezione in uno spettrofotometro ad assorbimento atomico dotato di fornetto di grafite. I metodi sono stati poi validati internamente mediante la definizione dell intervallo di linearità, della precisione (in termini di ripetibilità), dell accuratezza analizzando materiali a concentrazione nota di metalli e della sensibilità, espressa dal valore del limite di rilevabilità e di quantificazione. Inoltre i metodi di analisi sono stati confrontati con le norme ISO, aventi il medesimo campo di applicazione e tecnica analitica, fornendo ottimi risultati. I metodi così validati sono stati successivamente impiegati per l analisi di campioni di oli extra vergini di oliva di differenti origini geografiche. In tutti i campioni la concentrazione dei metalli tossici è inferiore al limite di rilevabilità dei metodi di analisi, e per gli altri metalli (in particolare per Fe e Cu) le concentrazioni sono inferiori ai limiti riportati dalle legislazioni europee e mondiali. Il contenuto di metalli negli oli extra vergini di oliva è stato poi analizzato mediante tecniche chemiometriche allo scopo di individuare delle relazioni tra i campioni e le provenienze geografiche. I primi risultati ottenuti non sono stati soddisfacenti a causa della bassa numerosità dei campioni e della 161

28 162 non omogenea campionatura degli stessi. E quindi auspicabile una nuova indagine prelevando i campioni ad inizio campagna olearia e in un numero più cospicuo. 5. RINGRAZIAMENTI Si ringraziano le ditte Fratelli Carli e Carapelli Firenze per aver fornito i campioni di oli extra vergini di oliva oggetto di questo studio. 6. BIBLIOGRAFIA [1] E. Underwood, W. Mertz, Trace elements needs and tolerances. In W. Mertz (Ed.), Trace elements in human and animal nutrition (pp ), 1987, London: Academic Press. [2] E. Pehlivan, G. Arslan, F. Gode, T. Altun, M. M. Özcan, Determination of some inorganic metals in edible vegetable oils by inductively coupled plasma atomic emission spectroscopy (ICP-AES), Grasas y Aceites 59, , (2008). [3] A. Angioni, M. Cabitza, M. T. Russo, P. Caboni, Influence of olive cultivars and period of harvest on the contents of Cu, Cd, Pb, and Zn in virgin olive oils, Food Chemistry 99, , (2006). [4] CERCLA priority list of hazardous substances. Regolamento della Commissione (CE) No. 1989/2003 del 6 Novembre [5] E. J. Llorent-Martínez, P. Ortega-Barrales, M. L. Fernández-de Córdova, A. Domínguez- Vidal, A. Ruiz-Medina, Investigation by ICP- MS of trace element levels in vegetable edible oils produced in Spain, Food Chemistry 127, , (2011). [6] E. J. Llorent-Martínez, P. Ortega-Barrales, M. L. Fernández-de Córdova, A. Ruiz-Medina, Analysis of the legislated metals in different categories of olive and olive-pomace oils, Food Control 22, , (2011). [7] Regolamento (CE) N. 1881/2006 della Commissione del 19 dicembre 2006 che definisce i tenori massimi di alcuni contaminanti nei prodotti alimentari. GU L 364 del , pagg [8] COI/T.15/NC No 3/Rev. 6, November 2011, Trade standard applying to olive oils and olive-pomace oils. [9] CODEX STAN , Codex Standard for olive oils and olive pomace oils. [10] S. Ba dat Ya ar, E. Köse Baran, M. Alkan, Metal determinations in olive oil. In Olive Oil Constituents, quality, health properties and bioconversions, editor Boskou Dimitrios, publisher InTech, February, (2012). [11] C. M. Canário, D. A. Katskov, Direct determination of Cd and Pb in edible oils by atomic absorption spectrometry with transverse heated filter atomizer, J. Anal. At. Spectrom. 20, , (2005). [12] G. Dugo, S. Lo Curto, V. Lo Turco, L. La Torre, F. Salvo, Valutazione del contenuto di Cu(II), Zn(II), Cd(II), e Pb(II) in oli di oliva prodotti nella Valle del Belice, Riv. Ital. Sostanze Grasse 79, , (2002). [13] M. S. Jimenez, R. Velarte, M. T. Gomez, J. R. Castillo, Multielement determination using online emulsion formation and ICP-MS/FAAS for the characterization of virgin olive oils by principal component analysis, Atomic Spectroscopy 25, 1-12, (2004). [14] M. Martin-Polvillo, T. Albi, A. Guinda, Determination of trace elements in edible vegetable oils by atomic absorption spectrophotometry, JAOCS 71, , (1994). [15] L. La Pera, S. Lo Curto, A. Visco, L. La Torre, G. Dugo, Derivative potentiometric stripping analysis (dpsa) used for the determination of Cadmium, Copper, Lead, and Zinc in Sicilian olive oils, J. Agric. Food Chem. 50, , (2002). [16] M. Zeiner, I. Steffan, I. J. Cindric, Determination of trace elements in olive oil by ICP-AES and ETA-AAS: a pilot study on the geographical characterization, Microchemical Journal 81, , (2005). [17] C. Benincasa, J. Lewis, E. Perri, G. Sindona, A. Tagarelli, Determination of trace element in Italian virgin olive oils and their characterization according to geographical origin by statistical analysis, Analytica Chimica Acta 585, , (2007). [18] ISO 8294:1994, Animal and vegetable fats and oils Determination of copper, iron and nickel contents Graphite furnace atomic absorption method. [19] ISO 12193:2004, Animal and vegetable fats and oils Determination of lead by direct graphite furnace atomic absorption spectrometry. [20] ISO 15774:2001, Animal and vegetable fats and oils Determination of cadmium by direct graphite furnace atomic absorption spectrometry.

29 Quality at destination: simulating shipment of three bottled edible oils from Italy to Taiwan E. Valli 1 R. Manzini 2 R. Accorsi 2 M. Bortolini 2 M. Gamberi 3 A. Bendini 1, 4 * G. Lercker 4 T. Gallina Toschi 1, 4 1 Interdepartmental Centre for Agri-Food Industrial Research (CIRI Agroalimentare) Alma Mater Studiorum, Università di Bologna (Italy) 2 Department of Industrial Engineering, Alma Mater Studiorum, Università di Bologna, (Italy) 3 Department of Management and Engineering, Università di Padova (Italy) 4 Department of Agricultural and Food Sciences (DISTAL) Alma Mater Studiorum, Università di Bologna Cesena (FC), Italy The effects on quality and safety of foodstuffs after transportation process are important for both the producers and the consumers. Herein, a shipment of different bottled vegetable oils (olive oil, extra virgin olive oil and grape seed oils) from Italy to Taiwan, has been simulated within a climate-controlled chamber. The treated samples have been chemically and sensory analyzed, considering basic quality parameters; then, the results were compared with the non-simulated oils from the same production batches. The analyses demonstrate that there is a risk of oxidation due to the shipment to be taken into account. Qualità al consumo: simulazione di trasporto dall Italia a Taiwan di tre bottiglie di oli destinati al consumo umano L effetto del trasporto sulla qualità e salubrità degli alimenti è un aspetto importante da valutare, d interesse sia per i produttori che per i consumatori finali. In questo lavoro si è voluto simulare il trasporto di diverse tipologie di oli vegetali (olio di oliva, olio extravergine di oliva ed olio di semi di vinaccioli) dall Italia a Taiwan impiegando una camera climatica a condizioni di temperatura controllata. I campioni trattati sono stati analizzati sotto il profilo chimico e sensoriale, considerando i parametri fondamentali di qualità ed i risultati sono stati comparati con quelli ottenuti sui campioni controllo. Le analisi dimostrano che esiste un rischio associato all ossidazione lipidica legata alle condizioni di trasporto che deve essere tenuto in considerazione. 163 *CORRESPONDING AUTHOR Alessandra Bendini Piazza Goidanich Cesena (FC), Italy alessandra.bendini@unibo.it

30 164 INTRODUCTION It is well-known that the shelf-life of a bottled vegetable oil is limited by two main processes, namely lipolysis and oxidation. Endogenous and exogenous lipases, responsible for initial degradation, act when the oil is still in the fruit, before extraction. This is especially true if olives are damaged, injured or not well-preserved, and gives rise to the formation of free fatty acids [1]. On the other hand, oxidation occurs mainly during extraction and storage [2]. The degree of unsaturation of fatty acids in a vegetable oil is directly proportional to the rate of oxidation. In fact, auto-oxidation and photo-oxidation of unsaturated fatty acids yield hydroperoxides (primary oxidation products), which are easily decomposed into different compounds (secondary oxidation compounds). Some of these are volatile and are responsible for the sensory degradation of oil, especially rancidity [3]. Extra virgin olive oil is renowned as an excellent foodstuff since it shows a high oxidative stability [4]. This particular behavior is strictly related to its high content of monounsaturated and saturated fatty acids and to the low amounts of polyunsaturated fatty acids, together with a high concentration of antioxidant compounds, especially phenols. In addition, olive oils are blends between refined and virgin olive oils [5], and for this reason they generally show a lower overall quality than extra virgin olive oil. To date, the impact of several factors such as temperature, light, pigments, oxygen availability, enzymes, metal contamination and microorganisms on oxidation have been studied. In particular, several investigations have assessed the effect of different storage conditions on the quality of olive oils [6, 7, 8, 9]. The effect of packaging material on the oxidation process of different vegetable oils, especially virgin olive oil, has also been assessed [10, 11], adopting also a predictive approach [12]. In this regard, several types of materials have been used for packaging vegetable oils, including glass, metals (tin-coated steel) and more recently plastics (PET, LDPE, PP), brick-type cartons, bag-in-box pouches and plastics coated paperboard/ alufoil laminates [13]. The main aim of the Food Supply Chain project at Bologna University is to trace and study the conditions of transportation of relevant foodstuffs. The project focuses on the analysis of the supply chain of wine, vegetable/olive oil and other foodstuffs to identify weaknesses and opportunities to improve the quality and safety of transportation processes. In particular, environmental factors of stress (i.e. temperature, humidity, vibrations, and light) are being analyzed during many shipments from Italy to generic consumers located in the EU or worldwide. The project, for the first time in Italy, involves several food companies throughout the country with the aim to safeguard and promote exports of local products, and ensure quality and traceability to protect consumers. The main role of the project is to identify critical logistic nodes or activities that affect the quality and safety of food products. In this report, the preliminary results obtained by monitoring the temperature of oil bottles during transportation from the producer to the consumer are inquired. The study herein simulates a journey from Italy to Taiwan (grapeseed oils, olive oil and extravirgin olive oil of medium-low quality, different temperature changes). MATERIALS AND METHODS SAMPLES One extra virgin (EV), one olive oil (OL) and two grape seed oils (GA and GB) were subjected to simulated shipping and were analyzed as described below. Samples were blinded as reported in Table I. SIMULATION OF SHIPPING This study is based on tracking and monitoring of the temperature profile of bottles of oil during shipment from Italy to consumers in Taiwan. Such a hypothetical profile has been simulated on "time zero samples" within a climate-controlled chamber. The climate chamber was designed and developed to simulate heating and cooling stress cycles that foodstuffs can experience during handling and shipping activities. Particular attention was paid to transportation and storage conditions where high or low temperatures can be reached and maintained for long periods. Furthermore, the system

31 approaches and realizes accelerated life thermal stress tests to study and assess the reliability and properties of particular property of products or packages, e.g. the maximum or minimum temperature where the packaging is not damaged and the quality/safety of the product is maintained. Consequently, the climate room was designed to: (1) heat or cool a sample of product to reach a specific temperature level, (2) automatically reproduce a given temperature profile measured during transportation or storage, (3) stress a product sample with accelerated thermal levels, i.e. accelerated life testing (ALT). The climate room can produce repeatable temperature cycles, with an average error of less than ±2 C, considering the air temperature inside the device, over any thermal profile between -10 and 65 C. The integrated cooling system consists of an evaporator utilizing 21 g of R600a iso-butane as a refrigerant. The voltage was 220 V AC with a nominal input power of 90 W; the lowest temperature obtainable is -10 C. In order to increase the temperature in the climate chamber a heating system was added using two electrical resistors with 75 W power each. A closed-loop algorithm, developed with LabView National Instrument software, controlled the actuators so that the chamber temperature reached a defined setpoint. INSTRUMENTATION Determination of K232 and K270 were carried out using a UV-vis 1610 spectrophotometer (Shimadzu Co., Kyoto, Japan) with a six-slot shuttle and a temperature control system. Gas chromatography analyses for the determination of the fatty acid composition were performed using a Carlo Erba MFC 500 instrument (Carlo Erba, Milan, Italy). REAGENTS AND STANDARDS Gallic acid was acquired from Fluka (Buchs, Switzerland). All solvents were of analytical grade and obtained from Merck (Darmstadt, Germany). ANALYSIS PLAN Free acidity, peroxide value and determination of fatty acids were evaluated for all the analyzed samples. UV spectrophotometric indexes (K232, K270), extraction of phenolic compounds and determination of their total amount and that of ortho-diphenols were performed to evaluate the effect of the simulated journey on chemical properties. BASIC QUALITY INDEXES Free acidity, peroxide value and UV spectrophotometric indices (K232, K270) were measured according to the official methods described in EC Reg. 2568/91 and subsequent amendments of the European Union. All parameters were determined in duplicate for each sample. FATTY ACID COMPOSITION Fatty acid composition of oil samples was determined as fatty acid methyl esters (FAMEs) after alkaline treatment, obtained by mixing 0.05 g of oil dissolved in 2 ml of n-hexane with 1 ml of 2N potassium hydroxide in methanol, and subsequent gas chromatographic analysis, according to Bendini et al. [14], with slight modifications. The results were expressed as a percentage of fatty acid of the total fatty acid content. EXTRACTION OF POLAR PHENOLIC EXTRACTS The phenolic fraction was extracted from the oil by liquid/liquid extraction according to Pirisi et al. [15]. The dry extracts were redissolved in 5 ml of methanol/water (50:50, vol/vol) in a 5 ml flask. Extracts were stored at -43 C before spectrophotometric analysis. SPECTROPHOTOMETRIC DETERMINATION OF TOTAL PHENOL AND ORTHO-DIPHENOL CONTENT The total phenol (TP) content of extracts was measured spectrophotometrically using Folin-Ciocalteu reagent and absorbance determined at 750 nm [16]. The ortho-diphenol content was determined as described by Bendini et al. [17]. Total phenols and ortho-diphenols were both quantified using two different gallic acid calibration curves (TP: r 2 = 0.997; ortho-diphenols: r 2 = 0.994). The results were expressed as mg gallic acid kg -1 of oil. SENSORY ANALYSIS Sensory analysis was carried out only on the EV0 and EV1 samples in accordance with EC Reg. 2568/91 and subsequent amendments, since it is mandatory only for extra virgin olive oil. The other samples (refined oils) were not subjected to this analysis. The olive oils were tasted, in two replicates, by 8 trained and experts panelists, in the sensory room of the Campus of Food Science of the University of Bologna (Cesena, Italy). STATISTICAL ANALYSIS Means and standard deviations were calculated with Statistica 6.0 (2001, Starsoft, Tulsa, OK) software. Statistica was used to perform a one-way analysis of variance, and Tukey s honest significant difference test at a 95% confidence level (p<0.05) to identify differences between groups. RESULTS AND DISCUSSIONS RESULTS The Food Supply Chain (FSC) is a research project to: 1) measure the effects of transportation and stor- 165

32 166 age issues on quality and safety of food products, 2) identify and develop effective solutions to control both quality and safety, especially in the presence of critical journeys from the place of origin and/or production to the consumer. In particular, the FSC project involves the Department of Industrial Mechanical Plants at the Faculty of Engineering and the Department of Food Science at the Faculty of Agriculture. This is the first study on the chemical analysis of oil for food in relation to the journey and transportation/packaging. The investigation simulated shipment of oil bottles from Italy to Taiwan with the aid of a company that is a leader in the worldwide distribution of edible oils. The study is described below. Monitoring temperature during shipment to the consumer. This was performed using a data logger and tracking technologies (e.g. black box) in several shipments of goods from different starting points, e.g. sites of origin and/or production of food products, to different destinations worldwide. Analysis of data. Simulation of transport/shipment conditions in a laboratory using a simulator developed ad-hoc to simulate historical and monitored temperature profiles. The simulation was conducted on the so-called zero-time bottles of the same production lots of products shipped to consumer locations and whose temperature profile has been properly monitored. Only temperature values were collected and simulated. Chemical and sensory analysis in a food science laboratory was performed to measure the impact on product quality due to the simulated transport conditions. A JOURNEY FROM ITALY TO TAIWAN The study discussed in this paper refers to bottled edible oils shipped from Italy to Taiwan, and the temperature profile during this journey was tracked for the overall processes up to the final consumer. In particular, oil bottles were monitored after packing, sorting and loading at manufacturing facilities. Figure 1 shows the temperature profile during shipment. The first critical step, as shown by the peaks in temperature, was the delay for loading at the departing port (Italy). The freight container was maintained at a fairly constant temperature, between C, during ocean transhipment. The most critical process was waiting for delivery of the container at the arrival dock (Taiwan). It can be seen that the temperature increased up to 56 C, perhaps affecting the quality of oil and/or packaging. The fatty acids compositions, link to the plant origin of the oils, are reported in Table II and III, for all the analyzed sample, before the simulation. Other chemical analyses were performed to determine the effects of shipment on quality and safety of oil (Table IV and V).

33 DISCUSSIONS The oil samples showed a typical fatty acid composition as expected (Table II and III), and were in the compositional range suggested by previous publications and the Codex Alimentarius [18]. For grape seed oil samples (GA and GB), the free acidity values obtained by the official method (and expressed as g oleic acid in 100 g of oil) were converted in mg KOH/g of oil, in order to standardize and compare the results with the limits reported by the Codex Alimentarius for vegetable oils [18] (Table IV). The acidity of the grape seed oil samples GA and GB before the journey were below the limits adopted by the Codex Alimentarius for vegetable oils, which is 0.6 mg KOH/g for refined oils [18]. For samples EV and OL, free acidity values were also below the legal limit for extra virgin and olive oils [5], respectively 0.8% and 1% (expressed as oleic acid). For all samples except for GA, no significant variation in free acidity was observed after the simulation of the journey, suggesting that substantial hydrolysis did not occur (Table IV). Regarding oxidation, for grape seed oil samples (GA and GB) the peroxide value, an index of the primary oxidation products, was within the range adopted by the Codex Alimentarius [18], which is fixed at 10 meq O2/kg oil for refined oils, both before (GA0 and GB0) and after (GA1 and GB1) simulation. EV0 showed a high peroxide value, which was however below the legal limit for extra virgin olive oil of 20 meq O2/kg oil [5]. For samples EV, GA and GB, the simulation apparently caused a small increase (not significant) of the peroxide value; all remained below the legal limit after simulation of transport (EV1, GA1 and GB1). Before transport, olive oil sample OL0 showed a peroxide value that exceeded the legal limit for olive oil (15 meq O2/kg oil) [5], indicating an advanced stage of oxidation; after simulation, a significant decrease in the peroxide value was observed. It should be mentioned that the peroxide value is an index measuring the rate of primary oxidation products; its reduction can be explained by fol- 167

34 168 lowing the Gaussian curve describing the trend of primary products during oxidation: when oxidation progresses, peroxides generate secondary degradation products [3]. Thus, taken alone the peroxide value does not reflect the oxidative quality of an oil. The advanced oxidation of OL0 and its transport-simulated counterpart OL1 was confirmed by the high values of K232 and K270 indices (Table V), even if K270 was below the legal limit for olive oils, which is 0.9 [5]. For both extra virgin olive oil samples EV1 and OL1, the K232 values decreased significantly after simulation, probably due to conversion of dienes into secondary products of oxidation, such as aldehydes and ketones, as previously reported [19]. The sensory analysis required for classification of the oil as extra virgin classified the sample EV0 as extra virgin and the sample (transport-simulated) EV1 as virgin, with a rancid defect. Total phenols and ortho-diphenols (Table V) were low in both olive oils (extra virgin and refined) from the beginning, especially for OL. During simulated transport, this small amount of antioxidants was not able to protect the oil and the simulation lead to measurable oxidation. No decreases in phenols were observed after transport simulation (Table V). In conclusion, this first simulation performed on different oils in terms of quality and saturation index (some of medium-low quality) did not result in a significant increase in the peroxide value, and did not show significant progression of the first phase of oxidation (from acylglycerols to peroxides). Nevertheless, it accelerated oxidation and produced (in one case) a slight defect of rancidity in oils that had already reached an advanced level of primary oxidation (high peroxide value before simulated transport). When long and critical transport is planned, it is useful to protect the oil from light (visible, infrared and ultraviolet) to limit oxidation with the aim to commercialize oils possibly protected by phenols (virgin olive oils) as natural antioxidants. In fact, transport can accelerate oxidation, and give rise to a product that is no longer within legal limits. The grape seed oil GA0 and the corresponding transport-simulated GA1, which were respectively comparable to the samples of grape seed oil in samples GB0 and GB1, did not differ significantly before or after transport simulation. Moreover, samples GA1 and GB1 did not have significantly different peroxide values. Therefore, it would appear that, in the specific case of simulation of transport and considering the analytical tests performed, the different packaging used did not affect final quality. Further research is warranted on the monitoring of shipments of different kinds of oils from Italy to destinations worldwide with attention given not only to temperature, but also vibrations, light exposure, and humidity. Towards this end, the research group at Bologna University is working on the development of a chamber that can simulate multiple stresses, including vibrations. CONFLICT OF INTEREST The authors have no conflict of interest to declare. ABBREVIATIONS: EV: Extra Virgin olive oil OL: Olive oil GA and GB: Grape seed oils K232, K270: UV spectrophotometric indexes FAMEs: Fatty Acid Methyl Esters TP: Total Phenol content FSC: Food Supply Chain. REFERENCES [1] D. Boskou, Olive Oil: Chemistry and Technology, AOCS Press, Champaign, IL. (1996). [2] M.T. Morales, R. Przybylski, Olive oil oxidation. In: Handbook of Olive Oil. (J.L. Harwood and R. Aparicio, eds.), Aspen Publications, Gaithersburg, MD., (2000). [3] E.N. Frankel, Recent advances in lipid oxidation. J. Sci. Food Agric. 54, (1991). [4] J. Velasco, C. Dobarganes, Oxidative stability of virgin olive oil. Eur. J. Lipid Sci. Technol. 104, (2002). [5] Commission Regulation 2568/91, July 11. Official Journal European Communities, L248, 1-82 (1991). [6] A. De Leonardis, V. Macciola, Evaluation of the shelf-life of virgin olive oils. Riv. Ital. Sostanze Grasse 75, (1998). [7] L. Cinquanta, M. Esti, M. Di Matteo, Oxidative stability of virgin olive oils. J. Am. Oil Chem. Soc. 78, (2001). [8] F. Caponio, M.T. Bilancia, A. Pasqualone, E. Sikorska, T. Gomes, Influence of the exposure to light on extra virgin olive oil quality during storage. Eur. Food Res. Technol. 221, (2005). [9] E. Stefanoudaki, M. Williams, J. Harwood, Changes in virgin olive oil characteristics during different storage conditions, according to light exposion and storage temperature. Eur. J. Lipid Sci. Technol. 112, (2010). [10] A.I. Méndez, E. Falqué, Effect of storage time and container type on the quality of extra-virgin olive oil. Food Control. 18, (2007). [11] R. Sacchi, M. Savarese, A. Del Regno, A.

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37 Studies in the transformations of lipid components of cocoa butter and palm kernel oil under different temperature processing conditions E.I. Adeyeye* R.O. Akinyeye Department of Chemistry Ekiti State University Ado Ekiti-Nigeria *CORRESPONDING AUTHOR Telephone: The levels of fatty acids, phospholipids, phytosterols and glycerol were determined in the cocoa butter samples at room temperature (25 C), 60 C (1h), 105 C (1h) and palm kernel oil at 25 C. Results showed that in cocoa butter sfa increased at 25 C (64.2%) < 60 C (67.1%) < 105 C (68.5%); these parameters followed opposite trends in: mufa, pufa, mufa+pufa, pufa/sfa, mufa/sfa and 2n-6/3n-3, that is, mufa 25 C (32.1%) > 60 C (31.1%) > 105 C (29.7%), etc. At chi-square analysis, sfa, mufa, pufa, mufa+pufa, pufa/sfa, mufa/sfa and 2n-6/3n-3 were significantly different among themselves at 25 C and 105 C but not significantly different among the three temperatures at α = the sfa, mufa and pufa values were close in cocoa butter and palm kernel oil, hence no significant difference existed between them at 25 C and r = Phospholipid levels of all types in the cocoa butter got reduced from 25 C down to 105 C to the value > 97% with cephalin, lecithin and phytoglycolipid showing significant differences between the tempetatures whereas the phospholipids showed a significant difference between themselves only at 25 C at α = Phospholipid levels were significantly different at r = 0.05 between cocoa butter and palm kernel oil at 25 C. temperature variations affected the cocoa butter phospholipids seen in the results: 25 C (100 mg/g) > 60 C (2.52 mg/g) > 105 C (2.18 mg/g). Among the phytosterol members, their concentration followed these trends in both cocoa butter (at all tempratures) and palm kernel oil: sitosterol > stig-masterol > campesterol > cholestanol > cholesterol; significant differences existed among the sitosterol levels at different temperatures and among the phytosterols at 25 C, 60 C and 105 C at α = temperature variations affected the levels of the phytosterols reducing them between 0.463% %. The phytosterol levels in cocoa butter at 25 C was 1267 mg/kg and 1101 mg/kg in palm kernel oil, these values were significantly different at r = 0.05.The glycerol levels were all very low with values ranging from e-5 to e-5 mg/kg in both cocoa butter and palm kernel oil and like in the sfa, higher temperature treatments led to the positive enhancement of the levels of glycerol in cocoa butter. Keywords: High temperature transformations, Lipid levels, Cocoa butter, Palm kernel oil Studi delle trasformazioni dei componenti lipidici del burro di cacao e olio di palmisto in diverse condizioni di temperatura di lavorazione Sono stati determinati i livelli di acidi grassi, fosfolipidi, fitosteroli e glicerolo in campioni di burro di cacao a temperatura ambiente (25 C), 60 C (1h), 105 C (1h) e a 25 C in olio di palmisto. I risultati mostrano che nel burro di cacao SFA aumenta a 25 C (64,2%) < 60 C (67,1%) < 105 C (68,5%); questi parametri hanno seguito tendenze opposte in: MUFA, PUFA, MUFA + PUFA, PUFA/SFA, MUFA/SFA e2n-6/3n-3, cioè MUFA 25 C (32,1%) > 60 C (31,1%) > 105 C (29,7%), etc., all analisi chi-square, SFA, MUFA, PUFA, MUFA + PUFA, PUFA / SFA, MUFA / SFA e 2n-6/3n-3 erano significativamente differenti tra di loro a 25 C e 105 C ma non significativamente differenti tra le tre temperature a α = 0,05. I valori di SFA, MUFA e PUFA erano vicini nel burro di cacao e nell olio di palmisto, per cui 171

38 nessuna differenza significativa esiste fra loro a 25 C e r = 0,05. I livelli di fosfolipidi nel burro di cacao si sono ridotti da 25 C fino a 105 C al valore > 97% in cefalina, lecitina e fitoglicolipidi mostrando significative differenze tra le temperature, mentre i fosfolipidi mostrano differenze significative tra loro solo a 25 C a α = 0,05. I livelli di fosfolipidi sono significativamente differenti at r = 0,05 tra burro di cacao e olio di palmisto a 25 C. Le variazioni di temperatura interessanti i fosfolipidi del burro di cacao si rilevano nei risultati: 25 C (100 mg/g) > 60 C (2,52 mg/g) > 105 C (2,18 mg/g). Per quanto riguarda i componenti dei fitosteroli, la loro concentrazione segue queste tendenze sia nel burro di cacao (a tutte le temperature) che nell olio di palmisto: sitosterolo > stigmasterolo > campesterolo > colestanolo > colesterolo; significative differenze esistono tra i livelli di sitosterolo a differenti temperature e tra i fitosteroli a 25 C, 60 C e 105 C e α= 0,05. Le variazioni di temperatura hanno influito sui livelli di fitosteroli riducendoli tra 0,463% - 35,2%. I livelli di fitosterolo a 25 C erano 1267 mg/kg nel burro di cacao e 1101 mg/kg nell olio di palmisto, tali valori sono risultati significativamente differenti a r = 0,05. I livelli di glicerolo erano tutti molto bassi con valori compresi tra 1,20185 e-5 e 1,37702 e-5 mg/kg sia nel burro di cacao che nell olio di palmisto e come nel SFA, trattamenti a temperature più elevate hanno portato ad un incremento positivo dei livelli di glicerolo nel burro di cacao. Parole chiave: Trasformazioni ad alte temperature, livelli di lipidi, burro di cacao, olio di palmisto 172

39 INTRODUCTION The African oil palm, traditionally is a native of West Africa and was first illustrated by Nicholas Jacquin in 1763, hence its name, Elaeis quineensis Jacq. The oil palm tree is one of the most important cash crops in the region and the main source of vegetable oil. Palm oil is the primary product whilst palm kernel oil is considered to be a secondary source of world supplies of palm kernels and palm kernel oil, providing approximately half of the quantities entering the world market. The export value of palm kernel is much greater than that of palm oil. The varieties of oil palm trees indigenous to West Africa tend to produce fruits which contain relatively large kernels surrounded by a thin, fleshy pericarp from which palm oil is extracted. These varieties belong to the Dura type. The fruit of the Dura is richer in kernel than in pericarp in contrast to the Tenera, the fruit of which is characterized by a thick oil-containing pericarp which inside has embedded a small nut[1]. The kernel, by local methods, is freed from the oilcontaining fibrous materials of the pericarp by exposure to weather conditions for a period varying from one to three months. It is now possible, by mechanical methods, to separate the fibre within few minutes. Traditionally, nuts are cracked with stones to separate the kernel which forms between 20-25% of the fibre-free nut. Simple machines are now available to quicken the process of cracking and to diminish the proportion of damaged kernels. According to the current regulations of Nigeria, the palm kernel is exported on average oil content of 49% and an FFA not exceeding 4% when it arrives in the United Kingdom [1]. The oil from the kernel is extracted, leaving the residual cake which is widely utilised as a source of concentrate ration for various classes of livestock. Palm kernel oil is light yellow in colour and it resembles coconut oil in taste and odour although it is less pungent. While the fatty acids predominating in palm oil are oleic and palmitic, those in palm kernel oil are lauric, myristic and oleic [1]. The thin testa surrounding the seed endosperm similarly contains fats. The iodine value of palm kernel oil varies between 15 and 18 [1] or 19.0 and 20.2 [2], and the saponification value between 243 and 250 [3] or 245 and 247 [2]. The oil is easily hydrolysed and thus tends to go rapidly rancid. It is used as edible oil, for margarine, soap and for various other purposes. In Nigeria, it is occasionally used for cooking, more often as hair oil and in certain parts for soap making. It is sometimes used for medicinal purposes. Cocoa (or Theobroma cacao L); the tree is called cacao while the bean is called cocoa [4]. Cocoa, a low altitude crop was introduced into Nigeria in about 1894 by Squiss Ibaningo though commercial planting did not start until around 1914 [5]. With particular reference to Nigeria, cocoa is the most valuable agricultural export produce obtained in exportable quantities in many southern states of Nigeria. Nigeria s current annual production was about 170,000 tonnes in 2007 and increased to 280,000 tonnes in Ondo and Ekiti States account for over 60% (that is, 102,000 tonnes) of Nigerian cocoa. It was 869,000 tonnes in mid- March 2010 in Côte d Ivoire. The type of cocoa grown in Nigeria is the Amelonado (melon shaped), a variety of Forastero [6]. Cocoa harvesting can be done yearly but the bulk of the crop is gathered in two flush periods occurring between October to February and from May to August. The ripe pods are cut from the tree and split open with matchets. The beans are then removed from the pod with their surrounding pulp and collected in leaf covered heaps or in large shallow boxes having perforated bottoms to provide drainage. It is then allowed to ferment for 5-7 days. During the fermentation period, the temperature rises due to microbial activity and the sugary pulp is converted to alcohol and carbon dioxide. The germ in the seed is killed by the increased heat and flavour of the beans developed. The interior part of the beans developed a reddish brown colour and the sharp fragrance and the astringency disappears. The fermented beans are then sundried to reduce the moisture content to 6.7% and bagged for exportation or processing [7]. Cocoa has contributed immensely to the economic development of some cocoa producing countries especially in West Africa. It is regarded as the Golden Tree because it s worth more than gold to many countries [8]. Cocoa is a source of income to farmers and for the upkeep of their families, it also serves as a raw material for the production of numerous consumable products such as chocolate drinks, confectioneries which have high nutritive values making it a supplement to a balanced diet. Cocoa products (like cocoa butter) are also being used in cosmetics, ointments, lipsticks and pharmaceutical industries. Cocoa also generates foreign exchange for the government. Cocoa butter is a fatty pale yellow oil. It has a solid property at room temperature as it contains tristearine and melts at a temperature of C [9]. A processing flow chart for the production of cocoa butter is shown in Figure 1. Some works have reported on the cocoa beans and the palm kernel fruits. Olaofe et al. [10] reported on the metal contents of some cocoa beans produced in Ondo State, Nigeria, Adeyeye et al. [11] reported on the effect of farm and industrial processing on the amino acid profile of cocoa beans; proximate and mineral compositions of nibs 173

40 174 and shells of processed ungerminated and germinated cocoa beans [4]; Oyenuga [1] reported on the composition of cocoa beans, cocoa husks, cocoa shell and defatted cocoa cake. Some work had also reported on the palm fruit products by both Oyenuga [1] and Akinyeye et al. [2]. The present work reports on the analysis of phytosterols, phospholipids, fatty acids and glycerol in cocoa butter and palm kernel oil under different temperature processing conditions. MATERIALS AND METHODS The 200 ml cocoa butter (CB) used for the investigation was prime pressed from liquor from a sample of fresh cocoa beans collected from the laboratory of Cocoa Product Company Ltd (Ile Oluji), Ondo State in October The pressing was done using a Laboratory 10 Ton Hydraulic Press Instrument. The CB obtained was filtered using a 100 mm Whatman filter paper and 50 ml portions and 3 x 50 ml portions were set aside for subsequent laboratory treatment. Each portion was put in different ovens pre-set and equilibrated at room temperature 25 C, 60 C and 105 C respectively. After 1 h of exposure of each sample at different temperatures, they were taken out, cooled to room temperature and transferred into polyethylene sample bottles for subsequent chromatographic analysis. The 200 ml of palm kernel oil (PKO) used for the investigation was obtained from a PKO oil extrusion factory at Ido in Ekiti State. The oil is from a batch of fresh palm kernel under extrusion at the time of the visit in October, The PKO was similarly filtered and treated as described for CB above. It should be noted that the temperatures used were chosen to represent the usual storage conditions, that is, room temperature, warming temperature of end products during short heating (60 C) and the cooking temperature in aqueous medium of 105 C. The oil obtained from the differently processed temperature conditions above was converted to the fatty acid methyl ester (FAME) using the boron trifluoride method [12]. The gas chromatographic conditions for the analyses of FAME were as follows: the GC was the HP 5890 powered with HP ChemStation rev A09.01 [1206] software [GMI, Inc, Minnesota, USA] fitted with a flame ionisation detector (FID). A split injection with split ratio of 20:1 was used. GC inlet temperature was 250 C with an oven program of initial temperature at 60 C, first ramping at 10 C /min for 20 min (maintained for 4 min), second ramping at 15 C /min for 4 min (maintained for 10 min) and detector temperature of 320 C. A capillary column (30 m x 0.25 mm) packed with a polar compound (HP INNOWAX) with a diameter (0.25 μm) was used to separate the esters. The peaks were identified by comparison with standard fatty acid methyl esters. The phytosterol analysis was as described by AOAC [13]. The aliquots of the processed fat were added to the screw-capped test tubes. The samples were saponified at 95 C for 30 min, using 3 ml of 10% KOH in ethanol, to which 0.20 ml of benzene had been added to ensure miscibility. Deionised water (3 ml) was added and 2 ml of hexane was added in extracting the non-saponifiable materials. Three extractions, each with 2 ml of hexane, were carried out for 1 h, 30 min and 30 min respectively. The hexane was concentrated to 1 ml in the vial for gas chromatography analysis and 1 μl was injected into the injection pot of GC. The GC conditions of the analyses were similar to the GC conditions for methyl esters analyses. The peaks were identified by comparisons with standard sterols. The method of Raheja et al. [14] was employed in the analyses of the processed fat phospholipids content determination. The GC conditions for analyses of phospholipids were similar to FAME analyses except in the following: Column type was HP5, oven program initial temperature at 50 C, second ramping at 15 C/min for 4 min, maintained for 5 min and the detector was pulse flame photometric detector (PFPD). The GC conditions for glycerol profile resemble the GC conditions for phospholipid except in GC where HP 6890 Powered with HP ChemStation Rev. A [1206] software, oven program was isothermal at 240 C, detector was FID, detector temperature was 300 C, hydrogen pressure was 28 psi and compressed air was 40 psi.

41 For the purpose of ensuring the accuracy of the results obtained, the following were prepared for phytosterols, phospholipids, glycerol and fatty acid methyl esters which were then compared with respective analytical results; calibration curves were prepared for all the standard mixtures and correlation coefficient determined for fatty acids, phytosterols, glycerol and phospholipids. Correlation is a statistical index that shows the quality assurance of the calibration curve performed. It was prepared with the Hewlett Packard Chemistry (HPCHEM) software (GMI, Inc 6511 Bunker Lake Blud Ramsey, Minnesota, 55303, USA). Statistical analyses [15] were carried out to determine mean, standard deviation, coefficient of variation in per cent, linear correlation coefficient (rxy), coefficient of determination (rxy 2 ), linear regression coefficient (Rxy), coefficient of alienation (CA), and index of forecasting efficiency (IFE). The rxy was subjected to the table (critical) value at r = Further statistical analysis was carried out using the chi-square (X 2 ) method as appropriate, the α value for the X 2 was also α = Some Figures were also generated to explain some relationships between the results of the samples. RESULTS AND DISCUSSION The FAME detected in the samples were: capric acid (C10:0), lauric acid (C12:0), myristic acid (14:0), palmitic acid (C16:0), stearic acid (C18:0), arachidic acid (C20:0), behenic acid, (C22:0) and lignoceric acid (C24:0), all being in the group of saturated fatty acid (SFA). Other FAME detected were palmitoleic acid (C16:1 cis-9), oleic acid (C18:1 cis-9), all being in the group of monounsaturated fatty acid (MUFA); linoleic acid (C18:2 cis-9, 12), the only n-6 fatty acid and α-linolenic acid (C18:3 cis-9, 12, 15), the only n-3 fatty acid. In Figure 2 the fatty acids distribution in CB at different temperatures were shown. There was upward movement of the SFA, that is, SFA at 25 C < SFA at 60 C < SFA at 105 C. On the other hand, the MUFA and PUFA progressively decreased in values as the temperature increased: MUFA and PUFA values at 25 C > at 60 C > 105 C. In Table I, the distribution of SFA, PUFA, MUFA + PUFA, PUFA/SFA, MUFA/SFA, 2n-6/3n-3 was shown. All these values were also subjected to chi-square (X 2 ) analysis setting the critical level at α = 0.05; the distribution involved only the CB at 25 C, 60 C and 105 C. The coefficient of variation per cent (CV %) was low in SFA (3.28%), MUFA (3.95%), MUFA + PUFA (6.54%) and MUFA/SFA (7.20%) showing the closeness of these values at 25 C, 60 C and 105 C in the CB; however, PUFA (42.9%), PUFA/SFA 175

42 176 (46.4%) and 2n-6/3n-3 (39.4%) were slightly high showing the level of disparity of the values at 25 C, 60 C, 105 C of the CB. The SFA values at 25 C, 60 C, 105 C did not have significant differences at α = 0.05 when subjected to X 2, this similar observation was noted for MUFA and PUFA. On the other hand the various parameters SFA, MUFA, etc. were significantly different for the column group at α = 0.05 for each temperature group. The highest SFA levels in all the CB samples were stearic acid > palmitic acid >> lauric acid; on temperature basis, SFA levels trend was 25 C < 60 C < 105 C. Since the results were calculated on percentage basis, if other FAME parameters were reduced in values, this reduction would be compensated for by the increase in the SFA values. The highest MUFA value was oleic acid (C18:1cis-9) having this trend: at 25 C < at 60 C < at 105 C. On comparison with the highest SFA levels, the following were observed: respective levels of stearic acid were 38.4% (25 C), 40.3% (60 C) and 41.1% (105 C); for palmitic acid 25.8% (25 C), 26.7% (60 C) and 27.3% (105 C); for lauric acid (25 C), (60 C) and (105 C). In MUFA oleic acid: 32.1% (25 C), 31.1% (60 C) and 29.7% (105 C). Other minor SFA levels in the CB were capric acid 0.004% %, lauric acid %, myristic acid %, arachidic %, behenic acid % and lignoceric acid %. The other MUFA outside oleic acid was very low in the samples, the palmitoleic ranged from 0.001% down to %. Linoleic acid progressively decreased as the temperature increased in the CB as: 3.68% (25 C), 1.88% (60 C) and 1.82% (105 C); also in α- linolenic acid the values were 0.007% (25 C) > 0.003% (60 C) > 0.002% (105 C). The percentage differences between 25 C/60 C and 25 C/105 C of the CB were shown in Table II. The PUFA percentage difference ranged from to +50.4% whereas others ranged from % to %. Deep frying oil and baking fats that are high in saturated fats, like palm oil, tallow or lard, can withstand extreme heat (of C) are resistant to oxidation. A 2001 parallel review of 20-year dietary fat studies in the United Kingdom, the United States of America and Spain [16] concluded that polyunsaturated oils like soya, canola, sunflower and corn degrade easily to toxic compounds and trans fat when heated up. Prolonged consumption of trans fat-laden oxidized oils can lead to atherosclerosis, inflammatory joint disease and development of birth defects. The scientists also questioned global health authorities wilful recommendation of large amounts of polyunsaturated fats into the human diet without accompanying measures to ensure the protection of these fatty acids against heat-and oxidative-degradation. The tendency of the oil/fat to undergo oxidative rancidity is a chemically induced autolysis (self-deteriorative process) in which non-conjugated polyunsaturated oils react with oxygen to give the system to produce hydroperoxides that build up and consequently breakdown to produce odourous aldehydes, ketones, alcohols and acids which cause the offflavour in oxidized fats and oils [17]. Polyunsaturated oil + O2 Peroxide H + Hydroperoxides CHO + >C = COOH + R-OH aldehyde ketone acid alcohol The process is accelerated by temperature, ultraviolet light and some divalent metals [17]. In Table III, the statistical analysis of the correlation coefficient between CB and PKO at 25 C was depicted. Compared between the two samples were SFA, MUFA and PUFA, the result being not significantly different at r = The correlation coefficient (rxy) was high at and coefficient of determination (rxy 2 ) of The regression coefficient of showed that for every unit increase in the CB, there was a corresponding reduction of in the FAME of the PKO. The coefficient of alienation (CA) was low at 28.6% whereas the index of forecasting efficiency (71.4%) was high. Since the IFE was high it meant the relationship between the CB and PKO could easily be predicted, the IFE is the reduction in the error of relationship which was or 28.6%. High IFE level meant that all the physiological activities that are due to the CB could also be carried out instead by the PKO. All fats and oils, whether of vegetable or animal origin, are some combination of SFA, MUFA and polyunsaturated linoleic acid and linolenic acid. Vegetable oils from northern climates contain a preponderance of polyunsaturated fatty acids and are liquid at room temperature. But vegetable oils from the tropics are highly saturated. Coconut oil, for example, is 92% saturated. These fats are liquid in the tropics but hard as butter in northern climates. Vegetable oils are more saturated in hot climates because the increased saturation helps maintain stiffness in plant leaves. Olive oil with its preponderance of oleic acid is the product of a temperate climate. At 25 C, SFA in CB was 64.2%

43 and in PKO it was 79.8% both behaving like typical oils of hot climates. The PKO FAME showed that unlike the CB, lauric acid was the most concentrated acid; SFA trend was lauric (47.8%) > myristic (15.7%) > palmitic (9.46%) > stearic (2.80%). Fat composition (%) in different cooking oils in respective saturated, monounsaturated, polyunsaturated was: coconut [92, 6, 2], soybean oil [15, 24, 58], olive oil [13, 74, 8], corn [13, 24, 59] and canola oil [7, 59, 29] [18]. The relative proportion of SFA to MUFA is an important aspect of phospholipid compositions and changes to this ratio have been claimed to have effects on such disease states as cardiovascular disease, obesity, diabetes, neuropathological conditions and cancer. For example, they have been shown to have cyto-protective actions in pancreatic β-cells. cis-monoenoic acids have desirable physical properties for membrane lipids in that they are liquid at body temperature, yet are relatively resistant to oxidation. They are now recognised by nutritionists as being beneficial in the human diet. For example, oleic acid comprises of a high proportion of the fatty acids of olive oil, a major fat component of the Mediterranean diet [19]. The bar chart representation of phospholipid types in CB at different temperatures was shown in Figure 3. In all the three CB samples, the progressive reduction from temperature-temperature was 25 C > 60 C > 105 C. Among the phospholipids, the levels of concentration were lecithin ( mg/g) > phytoglycolipid ( mg/g) > cephalin ( mg/g), lysophosphatidylcholine ( mg/g) > phosphatidylinositol ( mg/g) > phosphatydylserine ( mg/g). Table IV showed the statistical analysis of the results depicted in Figure 3. The percentage level of each phospholipid in each sample was shown. The coefficient of variation per cent of each phospholipid under the three temperature conditions showed that the CV% was generally high and varied from Table IV also showed that the X 2 values were significant at the three temperature conditions for cephalin, lecithin and phytoglycolipid at α = 0.05 whereas only the 25 C vertical column for all the phospholipids was significantly different at α =

44 178 In Table V, the differences between the phospholipid levels at 25 C/60 C and 25 C/105 C treatments were depicted. The value at 25 C was reduced in each of the phospholipid to the level of 97.3% %. The heat effect on the phospholipid was much more drastic than what was observed among the fatty acid esters. The values of phospholipids in the CB at 25 C were compared to their levels in PKO at 25 C as shown in Table VI. Generally, all the phospholipids were much more concentrated in the CB than in the PKO correspondingly. For the three major phospholipids we have mg/g: cephalin [18.4 (CB), (PKO)], lecithin [44.4 (CB), 1.10 (PKO)], phytoglycolipid [33.1(CB), (PKO)]. The rxy was high (0.9807) and significant, rxy 2 was high at 0.96, Rxy showed that for every unit increase in the value of phospholipid in CB there was a corresponding reduction of unit in the PKO. Whilst the CA was low, the IFE was high (80.5%). Phosphatidylcholine (lecithin) is a major constituent of cell membranes. Lecithin is more commonly found in the exoplasmic or outer leaflet of a cell membrane. It is thought to be transported between membranes within the cell by phosphatidylcholine transfer protein (PCTP) [20]. Lecithin also plays a role in membrane-mediated cell signalling and PCTP activation of other enzymes [21]. Lecithin formed the most concentrated phospholipid among the samples with percentage levels of 43.4% % in the CB. Complex phosphorylated glycolipids were discovered in 1958 in soy bean extracts [22] and during the 1960s in several plants [23]. These compounds were named in 1958 phytoglycolipids and were shown to consist of ceramides (based mainly on phytosphingosine) linked to a phosphoinositol group which may be itself linked to a complex oligosaccharide. This later residue may be composed of inositol, mannose, fructose, arabinose, hexuronic acid, glucosamine, and xylose. The complexity and the diversity of these molecules led specialists to consider them as glycolipids more than phospholipids. Further investigations have shown that these compounds are not restricted to plants but are found also in bacteria, yeast, fungi, and protozoans, while being absent in animals [24]. Thus, the trivial term phytoglycolipids, used only in cosmetics, has been replaced by the generally accepted term inositol phosphoprylceramides. Phosphoglycolipids formed the second largest phospholipid in the CB samples. The third largest phospholipid was phosphatidylethanolamine (cephalin or PE) is a lipid found in biological membranes. Whereas lecithin is the principal phospholipid in animals, cephalin is the principal one in bacteria. As a polar head group, phosphatidylethanolamine (PE) creates a more viscous lipid membrane compared to phosphatidylcholine (PC). For example, the melting temperature of di-oleoyl-pe is -16 C whilst the melting temperature of

45 di-oleoyl-pc is-20 C. If the lipids had two palmitoyl chains, PE would melt at 63 C whilst PC would melt already at 41 C. Lower melting temperature corresponds, in a simplistic view, to more fluid membranes. Phytosterols, more commonly known as plant sterols, have been shown in clinical trials to block cholesterol absorption sites in the human intestine, thus helping to reduce cholesterol in humans [25]. They are currently approved by the US Food and Drug Administration for use as a food additive; however, there are some concerns that they may block absorption, not only of cholesterol, but of other important nutrients as well. At present the American Heart Association has recommended that supplemental plant sterols be taken only by those diagnosed with elevated cholesterol, and has particularly recommended that they not be taken by pregnant women or nursing mothers [26]. The bar chart in Figure 4 showed the levels of the various sterols in the CB between 25 C-105 C. In Table VII, the percentage levels of each type of phytosterol at 25 C, 60 C, 105 C in CB were shown. The most concentrated sterol was sitosterol in all samples with levels of %, this was distantly followed by stig-masterol at %, campesterol (third position) at % and lastly by cholesterol at % being in the fifth position after cholestanol. The CV % as observed between each parameter among the various temperature conditions was close with values ranging from Also the X 2 values were significant at the sitosterol level among the three temperature values and at the column levels at 25 C, 60 C, 105 C at α = The differences between values at 25 C/60 C and 25 C/105 C were shown in Table VIII. The heat effect was much lower than in the phospholipids, also treatment at 60 C had values much closer to values at 25 C than what was observed at 105 C; however cholesterol was most affected at 105 C and campesterol was least affected. 179

46 180 In Table IX, the statistical analysis of the results of the phytosterol levels of CB and PKO at 25 C was shown. The rxy was high (0.9967) and significant at r = 0.05, rxy 2 was also high (0.99), Rxy showed that for each unit in the CB, there was a reduction of units in the PKO. Whilst the CA was low (8.12), the IFE was high (91.88) making prediction of relationship in the sterol levels of CB and PKO much easier. The richest natural sources of phytosterols are vegetable oils and products made from them. Nuts, which are rich in phytosterols are often eaten in smaller amounts can still significantly contribute to total phytosterol intake, while cereal products, vegetables, fruit and berries which are not as rich in phytosterols may also be significant sources of phytosterols due to their higher intakes [27]. The intake of naturally occurring phytosterols ranges between ~ mg/day [28] depending on eating habit. In our results the total phytosterol levels ranged from mg/100 g in the CB and 110 mg/100 g in PKO. Specially designed vegetarian experimental diets have been produced yielding upwards of 700 mg/day [27]. The most commonly occurring phytosterols in the human diet are β-sitosterol, compesterol and stig-masterol which account for approximately 65%, 30% and 3 % of diet contents, respectively [30]. In our samples for the CB, sitosterol was 69.7% (25 C), campesterol was 10.4% (25 C) and stig-masterol was 18.4% (25 C). The most common plant stanols in the human diet are sitostanol and campestanol which combined make up about ~5% of dietary phytosterol [31]. Phytosterols lower cholesterol levels by competing with cholesterol for absorption in the intestine [32]. Having a similar structure to cholesterol, phytosterols compete with cholesterol of dietary and biliary origin for incorporation into micelles in the gastrointestinal tract. Cholesterol displaced from the micelles is not absorbed and is destined for fecal excretion. While cholesterol was considered to be nearly absent in vegetal organisms, its presence is now largely accepted in higher plants. It can be detected in vegetal oils in a small proportion (up to 5 % of the total sterols) but remains frequently present in trace amounts. The CB cholesterol levels ranged from 0.457%-0.602% which was in traces. Like fats, cholesterol may be damaged by exposure to heat and oxygen. This damaged or oxidised cholesterol seems to promote both injury to the arterial cells as a well as a pathological build-up of plague in the arteries [33]. Damaged cholesterol is found in powdered eggs, in powdered milk (added to reduced-fat milks to give them body) and in meats and fats that have been heated to high temperatures in frying and other high-temperature processes. The Figure 5 depicted the glycerol levels in CB (25 C, 60 C, 105 C) and the PKO at 25 C. Although the values for all temperatures were low, it was observed that the values increased as follows: 1.14 mg/kg (25 C) < 1.16 mg/kg (60 C) < 1.20 mg/kg (105 C); for PKO, the value was 1.38 mg/kg. This observation might be due to heat effected cleavage of the FAME and increasing the level of glycerol as the temperature increased. Glycerol is used extensively in cosmetics, toiletries and pharmaceutical products. It is used as a component in formulations mainly to provide emolliency and other performance benefits to the formulation. Consumer exposure to glycerol will occur principally through its use in food, cosmetics, toiletries and pharmaceuticals mainly through dermal exposure although oral exposure will occur as a consequence of use in foods as a direct food additive and indirectly from cellulose films used for food applications, orally administered drugs and oral

47 hygiene products. Glycerol has undergone a review and approval for use as a direct food additive, indirect food additive and is recognised as generally safe for use in food. The use in food has been subjected to reviews by expert assessment by organisations such as WHO, JECFA and the European SCF. (Joint FAO/WHO Expert Committee on Food Additives, 19 th report. WHO Food Additive Series ). SCF Reports of the Scientific Committee for Food, 33 rd Series, European Commission, 1995 [34]. CONCLUSION Generally the SFA (%), MUFA (%) and the PUFA (%) amounted to 99.97±0.01 in CB and 99.99% in PKO. The traces in both cases were < 0.03%. There was greater SFA % in the PKO than in the CB. Temperature increase led to increase in SFA (%) and progressive reduction in the MUFA (%) and PUFA (%). About % increase in the SFA (%) was observed when heat treated at 60 C for 1 h. This resulted from the oxidation of the UFA (1.04%) reduction in MUFA and (1.80 %) reduction in PUFA. With a heat temperature at 105 C for 1 h, more oxidation of the UFA took place. About 4.30% increase in the initial SFA was noted. Resulting from the UFA, 2.44% was oxidised into MUFA and 1.86% into PUFA. Progressive contact of the CB with heat led to a progressive increase of the SFA (%) which indicated that the oil was becoming more unhealthy due to accumulation of the SFA. This progressive reduction of parameter levels from 25 C to 105 C was very extensive in the phospholipids where reduction levels ranged between 97.3% %. In the phytosterols, these reductions were low and varied between 0.463% %. It is important to understand that, of all substances ingested by the body, it is polyunsaturated oils that are most easily rendered dangerous by food processing, especially unstable omega-3 linolenic acid. This general observation may be less obvious in the fatty acids when compared with the phospholipids as observed in the present report. REFERENCES [1] V.A. Oyenuga, Nigeria s foods and feedingstuffs. Ibadan University Press, Ibadan, Nigeria. (1968). [2] R.O. Akinyeye, E.I. Adeyeye, O. Faskin, A. Agboola, Physico- chemical properties and anti-nutritional factors of palm fruit products (Elaeis guineensis Jacq.) from Ekiti State, Nigeria. EJEACHe 10(5), (2002). [3] T.P. Hilditch, P.N. Williams, The chemical constitution of natural fats (4 th Ed.). Chapman and Hall, London, (1964). [4] E.I. Adeyeye, O.O. Ayejuyo, Proximate and mineral compositions of nibs and shells of processed ungerminated and germinated cocoa beans. Int. J. Chem. Sci. 3 (1), (2010). [5] L.K. Opeke, Tropical tree crops. Spectrum Books Ltd., Ibadan, Nigeria, (1992). [6] G.A.R. Wood, Cocoa (3 rd Ed.). Longman Group Ltd., London, (1975). [7] The New Encyclooaedia. Britannica Int. (Vol.19, 15 th Ed.). University of Chicago Press, Suh-Shiaw, Lo, Chicago, (1992). [8] L.A. Are, D.R.G. Gwyne-Jones, Cocoa in West Africa (1st Ed.). Oxford University Press, Oxford, (1974). [9] D. Pearson, Chemical analysis of food (8 th Ed.). J. and A. Churchill, London, (1976). [10] O. Olaofe, E.O. Oladimeji, O.I. Ayodeji, Metal contents of some cocoa beans produced in Ondo State, Nigeria. J. Sci. Food Agric. 41, (1987). [11] E.I. Adeyeye, R.O. Akinyeye, I. Ogunlade, O. Olaofe, J.O. Boluwade, Effect of farm and industrial processing on the amino acid profile of cocoa beans. Food Chem. 118, (2010). [12] A.O.A.C. Official Analytical Chemists, Washington DC, USA, and , (2005). [13] A.O.A.C. Official Methods of Analysis (18 th Ed.). Ass. of Official Analytical Chemists, Washington DC, USA, , (2005). [14] R.K. Raheja, C. Kaur, A. Singh, I.S. Bhatia, New colorimetric method for the quantitative estimation of phospholipids without acid gigestion. Journal of Lipid Research 14, (1973). [15] R.A. Oloyo, Fundamentals of research methodology for social and applied sciences. ROA Educational Press, Ilaro, Nigeria, (2001). [16] G. Martin, C.J.L. Silwood, P. Addis, A. Claxson, B.B. Serra, M. Viana, Health effects of oxidized heated oils. Food Service Research International 13, (2001). [17] J.C. Okaka, A.N.C. Okaka, Spoilage of Foods. In: Foods-composition, Spoilage, Shelf-Life Extension. 1 st Ed. OC JANCO Academic Publishers, Independent Layout, Enugu. pp (2001). [18] Feinberg School -Nutrition - Nutrition Fact Sheet: Lipids ( Northwestern University. Retrieved on August 24, (2009). [19] F.D. Gunstone, J.L. Harwood, A.J. Dijkstra, The lipid handbook (3rd Ed.). CRC Press, Boca Raton, (2007). [20] K.W. Wirtz, Phospholipid transfer proteins. 181

48 Ann. Rev. Biochem. 60(13), (1991). [21] K.Kanno, M.K.Wu, D.A. Agate, B.K. Fanelli, N. Wagle, E.F. Scapa, C. Ukomadu, D.E. Cohen, Interacting proteins dictate function of the mimimal START domain phosphatidylcholine transfer protein/star D2. J. Biol. Chem. 282(42), (2007). [22] H.E. Carter, R.H. Gigg, J.H. Law, T. Nakayama, E. Weber, Biochemistry of the sphingolipides. XI. Structure of phytoglycolipide. J. Biol. Chem. 233 (6), (1958). [23] H.E. Carter, D.R. Strobach, J.M. Hawthorne, Biochemistry of Spingolipids. XVIII. Complete structure of tetrasaccharide phytoglycolipid. Biochemistry 8(1), (1969). [24] R.L. Lester, R.C. Dickson, Spingolipids with inositolphosphate-containing head groups. Adv. Lipid Res. 26, (1993). [25] R.E. Ostlund, S. B. Racette, W.F. Stenson, Inhibition of cholesterol absorption by phytosterol-replete wheat germ compared with phytosterol-depleted wheat germ. Am. J. Clin. Nutr. 77(6), (2003). [26] Medical News Today, Do healthy people need to eat plant sterols? Retrieved [27] L.M. Valsta, A. Lemström, M.L. Ovaskainen, A.M. Lampi, J. Toivo, T. Korhonen, V. Piironen, Estimation of plant sterol and cholesterol intake in Finland: quality of new values and their effect on intake. The British Journal of Nutrition 92(4), (2004). [28] R.E. Ostlund Jr, Phytosterols in human nutrition. Ann. Rev. Nutr. 22, (2002). [29] J.J. Agren, E. Tvrzicha, M.T. Nenonen, T. Helve, O. Hännien, Divergent changes in serum sterols during a strict uncooked vegan diet in patients with rheumatoid arthritis. The British Journal of Nutrition 85 (2), (2001). [30] J.L. Weihrauch, J.M. Gardner, Sterol content of plant origin. Journal of the American Dietetic Association 73 (1), (1978). [31] S.W. Andersson, J. Skinner, L. Ellegård, A.A. Welch, S. Bingbam, A. Mulligan, H. Andersson, K.T. Khaw, Intake of dietary plant sterols is inversely related to serum cholesterol concentration in men and women in the EPIC Norfolk population: a cross-sectional study. Eur. J. Clin. Nutr. 58(10), (2004). [32] R.E. Ostlund, Jr, Phytosterols, cholesterol absorption and healthy diets. Lipids 42(1), (2007). [33] C.A. Daley, A. Abbott, P.S. Dovie, G.A. Nader, S. Larson, Grass fed versus grain fed beef: fatty acid profiles, antioxidant content and taste. Nutrition Journal 9, (2010). [34] UNEP Publications, Glycerol. UNEP Publications, United Kingdom, (2002). Received, April 6, 2012 Accepted, April 12,

49 Effects of microwave heating on some oil seeds nutrient contents and colour change H.E. Samli 1 * V. Nalbant 1 A. Agma Okur 1 1 Namik Kemal University Faculty of Agriculture Dept. of Animal Science Tekirdag, Turkey In the present study, the effects of various microwave power levels and processing times on colour change, nutrient contents of oilseeds (soybean, sunflower and canola seeds) were investigated. The samples were placed on a rotary plate of the microwave oven and heated for 2.5 or 5 minutes at two microwave output powers (540 or 900 W). After heating, the samples were examined by means of a stereo-microscope and their images were captured by means of a digital camera attached to the microscope. Lightness (L*) and yellowness (b*) of the feedstuffs used in the experiment were significantly lower, depending on the increase in power levels and durations. However, redness (a*) values were significantly higher. Also, photos of the feedstuffs samples were taken under a stereo microscope and the images showed similar results with the colour analysis. Keywords: Microwave, oil seeds, colour change, microscopic images Effetti del riscaldamento a microonde su alcuni contenuti nutrizionali di semi oleaginosi e cambio di colore Nel presente lavoro, sono stati studiati gli effetti di diversi livelli di potenza a microonde e tempi di lavorazione sul cambiamento di colore e su alcuni contenuti nutrizionali di semi oleaginosi (soia, girasole e semi di colza). I campioni sono stati posti su un piatto rotante del forno a microonde riscaldati per 2,5 o 5 minuti, con due potenze di uscita (540 o 900 W). Dopo il riscaldamento, i campioni sono stati esaminati per mezzo di uno stereomicroscopio e le loro immagini sono state ottenute per mezzo di una telecamera digitale collegata al microscopio. Luminosità (L*) e giallo (b*) dei mangimi usati nell'esperimento erano significativamente inferiori, a secondo dell aumento dei livelli di potenza e durata. Tuttavia, valori di rossore (a*) erano significativamente più alti. Inoltre, foto di campioni di mangimi sono state prese sotto uno stereo-microscopio e le immagini hanno mostrato risultati simili con l'analisi del colore. Parole chiave: Forno a microonde, semi oleaginosi, cambiamento di colore, immagini microscopiche 183 *CORRESPONDING AUTHOR ersinsamli@yahoo.com

50 184 INTRODUCTION Soybean, sunflower and canola are major global raw materials for poultry and other animal diets. The use of soybean, sunflower and canola seeds, provide an appropriate package for the nutrients. However, raw soybean, sunflower and canola seeds have some active biological compounds called anti-nutritional factors such as trypsin inhibitors and hemaglutinins, which must be inactivated before they can be safely used in diets [1, 2]. Hernández-Infante et al. [2] concluded that microwave heating is an adequate method to destroy hemagglutinins and trypsin inhibitors in soybean without affecting the protein quality. Heating of legumes to destroy anti-nutritional factors is required in order for them to support nutrient needs. Microwave (MW) heating destroys haemagglutinins and trypsin inhibitors without affecting the protein quality of most legume seeds. As an alternative to conventional thermal treatment methods, microwave heating can be used to remove the anti-nutritional factors [2, 3]. Microwaves transmit energy in a different way compared to the conventional heating, where heat is usually transferred from the surface to the interior. Heat is passed through the material in microwave ovens, leading to rapid heating rates and shorter processing times [2, 4, 5, 6]. Non ionizing microwave energy (MW) is sufficient to move the atoms of a molecule, but insufficient to change it chemically. MW travel moves essentially at the same speed as light waves. Metallic objects reflect them; some dielectric materials absorb them while others transmit them. Water, carbon and foods which are high in water are good absorbers, while thermoplastics, glass and ceramics allow them to pass through, absorbing little or no energy [3]. Water is the one of the major ingredients affecting the dielectric properties of a material [7]. Low moisture products generally heat more evenly due to their low heat capacity [3]. Also there are some other advantages, such as space savings and energy efficiency, since most of the electro-magnetic energy is transformed to heat. It should be noted that the major handicap in microwave heating is a non-uniform temperature distribution, causing hot and cold stains in the heated material [2, 5, 8, 9]. Conservation of product colour is important for the quality parameters [3]. Heating time and power levels affects colour. Because of that it is one of the parameters that is used for the process control during heating [10]. The development of colour in foods is a characteristic of the Mailard reaction [11]. The purpose of the present study was to examine the effects of changes in different microwave powers and times on chemical composition and colour changes of raw soybean, sunflower and canola seeds. MATERIALS AND METHODS RAW MATERIAL The soybean (Glycine max), sunflower (Helianthus annus) and canola (Brassica oleifera) seed samples were obtained from industrial plants and were stored in a cold room. The seed samples were analyzed (3 replicates for each sample) for dry matter (AOAC ), crude protein (AOAC , A-D), crude fiber (AOAC ), fat crude content (AOAC A) and crude ash (AOAC ) using standard methods [12]. HEATING PROCEDURE Heating treatments were performed in a domestic microwave oven (Arcelik MD 584, Turkey). The seed samples (200 g) for each treatment were placed in oven cooking bags. The samples were placed on a 25 cm diameter circumference on a rotary plate of the microwave oven and heated for 2.5 or 5 minutes at two microwave power levels (540 or 900 W). COLOUR EVALUATION After the microwave heating, the seed samples were removed from the oven and the colour of the samples was measured using a HunterLab D25LT (USA). L*, a* and b* indicates lightness, redness and yellowness values, respectively. A standard white colour was used as a reference. Six replicate readings were carried out. LIGHT MICROSCOPY OF THE SEED SAMPLES After the microwave heating, the samples were examined by means of a Leica stereo-microscope (Model Leica S8APO, Leica Microsystems Ltd., Wetzlar, Germany) and their images were captured by means of a digital camera attached to the microscope. STATISTICAL ANALYSIS Main effects (heating time and microwave heating power) levels and their interactions were analyzed by variance analysis using the procedure described by the Statistica for Windows [13]. Comparisons of the treatment means were performed with Duncan s multiple range tests. The statistical model used was: Yijk = μ + αi + βj + αβij + eijk where Yijk is the individual observation, μ is the experimental mean, αi is the power level effect, βj is the heating time effect, αβij is the power level x heating time interaction effect, and eijk is the random error.

51 RESULTS AND DISCUSSION Nutrient contents and colour values of ground raw sunflower, soybean and canola seeds were shown in Table I. Table II shows the effects of microwave power and the heating time on nutrient contents and colour values of sunflower. The dry matter (%), ash (%) contents increased with the heating time and power. However, crude protein (%) and ether 185

52 186 extract (%) values significantly improved by power levels (P<0.001). As the microwave power and heating time increased, L* values of the sunflower seeds decreased, meaning that the sunflower seeds had a darker colour (P=0.003). However, the redness (a*) values of the sunflower seeds processed in the microwave at higher power and times were found to be significantly higher (P=0.041). But, b* values did not differ by microwave power levels or heating times (P>0.05). The photos captured in Leica stereo-microscope were found to be darker in colour as the results above show (Figure 1). Effects of microwave processes on nutrient contents and colour values of soybean seeds were presented in Table III. Dry matter (%), ash (%) and ether extract (%) contents were increased by heating times and powers. However, crude fiber content did not differ by treatments (P>0.05). While L* and b* values were decreasing significantly by increasing times and power levels, inversely a* values were increasing (P<0.01). Similar results were obtained from the photos captured (Figure 2). Impacts of treatments on nutrient contents and colour values of canola seeds were shown in Table

53 187 IV and Figure 3. Dry matter, crude fiber and ether extract contents of the samples were significantly influenced by microwave power levels (P<0.05). In addition, ash contents of the canola seed samples were affected by power level and heating time interactions (P=0.025). However, the crude protein contents did not differ by the treatments. Similar results were obtained with the colour analysis of soybean seeds. L* and b* values were decreased by the power level (P<0.001) and heating time (P<0.05), while a* values were increasing. The canola samples were found to be darker at 5 min heating times and 900 W power levels in the microscopic image. However L* value has been found to be at These results were parallel with photos captured in Leica stereo-microscope (Figure 3). Drying methods caused extensive browning in the fruits and the vegetables. This was manifested by a significant drop of the L* parameter and an increase of the a* parameters [14] and our results are in agreement with this conclusion. According to our findings a 2.5 min heating time and 540 W power level is a good process to minimize the colour deterioration in sunflower, soybean and canola meals. Łupińska et al. [15] found a decrease in the moisture content with the increasing of the microwave power. However, these findings are compatible with ours.

54 188 CONCLUSIONS According to our research results, the treatments affected all the feedstuffs in varying proportions. Lightness (L*) and yellowness (b*) of the feedstuffs used in the experiment were found to be significantly lower, depending on the increase in power levels and durations. Redness (a*) values were significantly higher. Also, photos of the feedstuffs samples were taken under a stereo microscope and the images showed similar results with the colour analysis. Colour values of the seed samples were getting darker and less light, depending on the power levels and processing times. REFERENCES [1] M. Parvu, A. Iofciu, D. Grossu and M. Iliescu, Efficiency of toasted fullfat soybeans utilization in broiler feeding. Archiva Zootechnica 6, (2001). [2] M. Hernández-Infante, V. Sousa, I. Montalvo, E. Tena, Impact of microwave heating on hemagglutinins, trypsin inhibitors and protein quality of selected legume seeds. Plant Foods for Human Nutrition 52, (1998). [3] M. Brewer, Microwave processing, nutritional and sensory quality, In: The Microwave Processing of Foods (Schubert H, M Regier, eds):woodhead Publishing in Food Science and Technology, Cambridge, UK, (2010). [4] A.A. Sadeghi, P. Shawrang, Effects of microwave irradiation on ruminal degradability and in vitro digestibility of canola meal. Animal Feed Science and Technology 127, (2006). [5] U. Erle, Drying using microwave processing, In: The Microwave Processing of Foods (H. Schubert, M Regier, eds):woodhead Publishing in Food Science and Technology, Cambridge, UK, (2010). [6] M. Regier, H. Schubert, Drying using microwave processing, In: The Microwave Processing of Foods (Schubert H, M Regier, eds): Woodhead Publishing in Food Science and Technology, Cambridge, UK, 3-21 (2010). [7] B. Wäppling-Raaholt, T. Ohlsson, Improving the heating uniformity in microwave processing, In: The Microwave Processing of Foods (Schubert H, M Regier, eds):woodhead Publishing in Food Science and Technology, Cambridge, UK, (2010). [8] R. Wang, Z. Li, Y. Li, J. Ye, Soybean drying characteristics in microwave rotary dryer with forced convection. Front. Chem. Eng. China 3 (3), (2009). [9] R. Vadivambal, D.S. Jayas, Non-uniform temperature distribution during microwave heating of food materials-a review. Food Bioprocess Technology 3, (2010). [10] T. Kahyaoglu, S. Kaya, Modeling of moisture, color and texture changes in sesame seeds during the conventional roasting. Journal of Food Engineering 75, (2006). [11] G. Grigioni, A. Biolatto, M. Irurueta, A.M. Sancho, R. Páez, N. Pensel, Color changes of milk powder due to heat treatments and season of manufacture. Cienc. Technol. Aliment. 5 (5), (2007). [12] AOAC, Official Methods of Analysis, 4 th ed. Association Official Analytical Chemists, Inc. Arlington, Virginia, USA, (1990). [13] Statistica for the Windows Operating System, Stat Soft Inc., Tulsa, OK, USA, (1999). [14] M.K. Krokida, Z.B. Maroulis, G.D. Saravacos, The effect of the method of drying on the colour of dehydrated products. International Journal of Food Science & Technology 36 (1), (2001). [15] A. Łupińska, A. Kozioł, M. Araszkiewicz, M. Łupiński, The changes of quality in rapeseeds during microwave drying. Drying Technology 27, (2009). Received March 20, 2012 Accepted June 11, 2012

55 The effect of the lime-and-ash debittering and the fermentation with and without starter on the composition in sugars and phenols of table olives B. Lanza 1 * A. Russo 2 M.G. Di Serio 1 C. Benincasa 2 F. Russi 1 M.R. Mucciarella 1 E. Perri 2 1 Consiglio per la Ricerca e la sperimentazione in Agricoltura, CRA-OLI, Centro di Ricerca per l Olivicoltura e l Industria Olearia Città S. Angelo (PE), Italy 2 Consiglio per la Ricerca e la sperimentazione in Agricoltura, CRA-OLI, Centro di Ricerca per l Olivicoltura e l Industria Olearia, Rende (CS), Italy *CORRESPONDING AUTHOR: Barbara Lanza Consiglio per la Ricerca e la sperimentazione in Agricoltura, CRA-OLI, Centro di Ricerca per l Olivicoltura e l Industria Olearia Viale L. Petruzzi 75, I Città S. Angelo (PE), Italy Tel: Fax: barbara.lanza@entecra.it The aim of this work has been to focus on the changes in sugar and phenol levels and the pattern occurring during the lime-and-ash traditional process for table olives. The sugar and phenolic composition was determined by Liquid Chromatography-Multiple Reaction Monitoring (LC-MRM). After the lime-and-ash treatment, fructose and mannitol increase and glucose decreases; with subsequent washings there is a leaching of also all the sugar structures that will be further degraded by the microrganisms involved in the fermentation process. The phenols after lime-and-ash treatment are completely degraded and has show the neo-formation of tyrosol. After 30 days of fermentation, bacteria grown spontaneously or inoculated generates a large amount of luteolin and appreciable amounts of hydroxytyrosol. In the case of olives fermented with Lactobacillus plantarum B124 as a starter culture has also shown an appreciable neo-formation of cathecol. Keywords: lime-and-ash treatment; liquid chromatography-multiple reaction monitoring (LC-MRM); phenolic compounds; sugars; table olives. Effetto del trattamento di deamarizzazione con calce/cenere e della fermentazione con e senza l aggiunta di starter sulla composizione in zuccheri e fenoli delle olive da tavola Lo scopo del presente lavoro è stato quello di focalizzare l attenzione sulle variazioni di zuccheri e fenoli che si verificano durante il processo di trasformazione delle olive da tavola denominato calce e cenere. La composizione in zuccheri e polioli e la composizione fenolica sono state determinate mediante cromatografia liquida-multiple Reaction Monitoring (LC-MRM). Per quanto riguarda zuccheri e polioli, dopo il trattamento con calce e cenere, fruttosio e mannitolo aumentano mentre diminuisce il glucosio. In seguito ai successivi lavaggi si ha invece una lisciviazione di tutte le strutture zuccherine che saranno ulteriormente degradate dai microrganismi coinvolti nel processo di fermentazione. Per quanto riguarda i fenoli, dopo il trattamento con calce e cenere la maggior parte di questi composti viene degradata mentre si osserva la neo-formazione di tirosolo. Dopo 30 giorni di fermentazione, sia la microflora spontanea che i batteri lattici inoculati generano grandi quantità di luteolina e quantità apprezzabili di idrossitirosolo. Nel caso delle olive fermentate con l aggiunta di Lactobacillus plantarum B124 quale coltura starter si apprezza anche la neo-formazione di catecolo. Parole chiave: trattamento calce e cenere, LC-MRM, fenoli, zuccheri, olive da tavola. 189

56 190 INTRODUCTION Sugars are the main soluble components in olive tissues and play an important role, providing energy for metabolic changes. The main simple sugars in raw olive flesh are glucose, fructose, sucrose and mannitol (sugar alcohol) [1]. Glucose and fructose are reducing sugars, while sucrose is a non-reducing disaccharide. Both soluble reducing and non-reducing sugars have an important role in oil biosynthesis [2-4]. In table olives processing sugars act as a carbon source to microorganisms for producing secondary metabolites responsible for good characteristics and a distinctive flavour of the commodities. In addition to the free reducing sugars, olive flesh is also rich in numerous glycosides, which can be a supplementary source of carbohydrates for olive fermentation when hydrolyzed. A series of transformations occur in olive fruit during processing. The analysis of sugars, sugar alcohols and other carbohydrates in different types of matrices are of major interest. Different analytical approaches have been used, like gas chromatography or HPLC technique [1, 5, 6], anion-exchange chromatography [7], gas chromatography - tandem mass spectrometry [8] or, more recently, ion trap mass spectrometry [9]. Although sugar composition in olive tissues has been studied [10-14], only little information exists on the effect of the variety, origin and maturity and the changes related to the processing are still rather meagre, so a better knowledge of these components may contribute to a significant development of technology, safety and quality of table olives. Table olives have also a different qualitative and quantitative phenolic composition than the raw olive fruits from which they are prepared [15-19]. The reason is the diffusion of phenols and other water soluble constituents from the olive fruit to the surrounding medium (water, brine or lye) and the lye treatment and hydrolysis during fermentation [20]. Table olives are analyzed for individual phenols by GC [18] and HPLC [21, 22]. Few data are available for other techniques. In some Italian regions, olives are prepared with an ancient and traditional method that includes a debittering phase obtained using a lime-and-ash mixture, preparing these treated green olives by mixing CaO (lime) with olive wood ash and adding water to a paste, leaving submerged the green olives for some hours at room temperature. After alkaline treatment and washing, olives are placed in a solution of NaCl. The proof that it was a popular method in the whole of Italy is the fact that recognition was given by The Italian Ministry of Agriculture (MIPAAF) of "lime-and-ash olives" in different regions (Lazio, Calabria, Campania and Puglia) when they reviewed all of those items whose preparation had been passed down from generation to generation, and so they became "Traditional AgriFood Products" (Decree of the Italian Ministry of Agriculture 18 July 2000; XII Revision of 7 June 2012). This trade preparation is in accord with the "Trade Standard Applying to Table Olives" [23] as Treated olives: Green olives, olives turning colour or black olives that have undergone alkaline treatment, then packed in brine in which they undergo complete or partial fermentation, and preserved or not by the addition of acidifying agents. The action of lime-ash is similar to the action of NaOH. The aim of this work was to focus on the changes in sugars and phenols occurring during this traditional processing technology for a table olive cultivar, Olea europaea L. cv. Mele (synonyms: "Dolce- Sweet" and "Dolce Mele-Sweet Mele"), which has a low content of oleuropein and a high content of reducing sugars. The sugar and phenolic composition was determined by Liquid Chromatography- Multiple Reaction Monitoring (LC-MRM). 2. EXPERIMENTAL PLANT MATERIAL AND PROCESSING The olive fruits (Olea europaea L. cv Mele ) were hand-harvested at their mature-green stage of ripening (in mid-september), when they were suitable for table olive consumption. The treated green olives in brines are green olives that have undergone alkaline treatment, then packed in brine in which they undergo complete or partial fermentation [24]. In the present study, we have prepared these treated green olives by mixing 0.5 kg of CaO (lime) with 5 kg of olive wood ash and adding water (10 L) to a paste, leaving submerged 10 kg of olives for 2 h at room temperature. The optimal alkaline-mixture penetration is between 2/3 and 3/4 of the distance between skin and pit. To verify a correct lye we cut with a particularly sharp blade such as a razor blade or scalpel some olives near the pit, checking the surface after air exposure. After alkaline treatment, the olives were washed with potable water. The washing was used to eliminate the residual lye. The sequences of washing are the following: - the first one is a strong wash with potable water made using a shower lasting min in order to eliminate the lye attached to the fruit surface; the olives washed are then left in the final washing water - after 2-3 h there took place a second faster and simpler wash using a filling-emptying procedure - in the following h we carried out another 3-4 washes, always using a filling-emptying procedure.

57 After washing, the olives were placed in an initial brine solution of NaCl (8% w/v) NaCl concentration which was then carefully monitored during this phase. The brine concentration decreased quickly as a consequence of the osmotic phenomena between brine and the water of the fruits from 8% to about 5% in h. For this reason after 4-5 days from the brine placement we added ground salt to the brine to restore the initial concentration. After a week of brining, a lot had been inoculated with a starter culture of Lactobacillus plantarum B124, present in the Italian National Collection COLMIA WDCM945 ( that include lactic acid bacteria isolated from fermentation brines, epicuticular layer of fruit (carposphera) and olive phylloplane, useful in table olive processing. This strain has been characterized from a physiological and technological point of view (unpublished data). In this work we reported the growth at different ph to justify the choice of this starter culture in this process. The test was carried out inoculating the strain in MRS broth (Oxoid LTD, Basingstoke, Hampshire, England) at ph 2, 4, 6, 8 and 10. After 48 h of incubation at 30 C, the bacterial growth was measured by reading the optical density at 600 nm (O.D.600). The other batch was left to ferment spontaneously. All fermentation processes were carried out at a controlled temperature of 28±2 C. The flowchart of processing is shown in Figure 1. CHEMICAL MONITORING During processing, ph and titratable acidity of the olive brine and ph, titratable acidity, reducing sugar and total polyphenol content of the olive flesh, were monitored. The ph of pulp and brine was measured with a Istek ph Meter 730P model (Istek, Inc. Seoul, Korea South). The titratable acidity of pulp was determined by titrating 20 g of pulp (added with 20 ml of water) with NaOH 0.1 N solution using phenolphthalein as an indicator 1% (w/v) solution in ethanol, and expressed in grams of citric acid per 100 g of fresh olive flesh. Titratable acidity of brine was determined by titrating 30 ml of brine with NaOH 0.1N solution using phenolphthalein as an indicator 1% (w/v) solution in ethanol, and expressed in grams of lactic acid per litre of brine. REDUCING SUGARS Reducing sugar content was determined by Fehling s method and expressed as grams of glucose per 100 g of fresh olive flesh. TOTAL POLYPHENOLS Total polyphenol content was quantified by the Folin-Ciocalteu assay a method based on the reduction of phosphomolybdic acid by phenols in aqueous alkali and currently used to determine the total free phenolic groups in a sample. Five grams of olive pulp were extracted 3 times with methanol. An aliquot (0.5 ml) of methanolic extract was intro- 191

58 192 duced into a test tube and mixed with 0.5 ml of Folin-Ciocalteu s phenol reagent (Sigma-Aldrich, Buchs, CH). The mixture was added of 3 ml of a Na2CO3 saturated solution and brought up to 10 ml with distilled water. The solution was allowed to stand for 30 min at room temperature. The mixture was then centrifuged for 10 min at 3000 g and the absorbance of the surpernatant measured at 725 nm on a Perkin-Elmer Lambda 2 UV/VIS Spectrophotometer (Norwalk, CT). Total phenolics were expressed as mg of caffeic acid/kg of fresh olive flesh. SUGAR AND POLYOL COMPOSITION BY LIQUID CHROMA- TOGRAPHY-MULTIPLE REACTION MONITORING (LC-MRM) The olives were pitted and minced. 100 mg of flesh for each sample were dissolved in 6 ml of a hydroalcoholic solution ethanol:water (8:2, v/v) and left in an ultrasonic bath for 15 min. Subsequently the samples were centrifuged at 3500 rpm for 20 min. 100 μl of supernatant were added to 900 μl of the acetonitrile: H2O elution solution (8:2, v/v) containing CsCl (40 μm). Samples were introduced by direct infusion (10 μl/min) at the optimum ion spray (IS) voltage of 5500V in a mass spectrometer API 4000 Q-Trap (Applied Biosystems, Toronto, Canada). The source nitrogen (GS1), the curtain gas (CUR) and the collision gas (CAD) flows were set at pressures of 12, 10 and 9 psi, respectively, whereas the declustering potential (DP), the entrance potential (EP), the collision energy (CE), the collision cell exit potential (CXP) were kept at 100, 10, 25 and 11V, respectively. The standards used were fructose, glucose, galactose, mannitol and sucrose (Sigma Aldrich, St. Louis, MO). To verify the retention times they were prepared for each compound the respective stock solution, using as a solvent a mixture of acetonitrile: H2O (8:2, v/v) containing CsCl (40 μm). The retention times obtained for each analyte are the following: fructose 7 min. (stock solution 552,4 ppm); mannitol 8 min. (s.s. 127,6 ppm); glucose 9 min. (s.s. 273,6 ppm); sucrose 14 min. (s.s. 193,6 ppm). For chromatographic separation we used the Chromegabond carbohydrate column 5 μm, 15 cm x 2.1 mm (ES Industries, West Berlin, New Jersey, USA). PHENOLIC COMPOSITION BY LIQUID CHROMATOGRA- PHY-MULTIPLE REACTION MONITORING (LC-MRM) The olives were pitted and minced. 10 g of flesh for each sample were dissolved in 20 ml of methanol and filtered. Methanolic extract was evaporated in a Rotavapor and extracted with acetonitrile:esan (1:1, v/v; 30 ml for 3 times). The extract was resuspended in 1ml of methanol, diluted 1:100 and introduced by direct infusion (10 μl/min) at the optimum ion spray (IS) voltage of 4500V in a mass spectrometer API 4000 Q-Trap (Applied Biosystems, Toronto, Canada). The source nitrogen (GS1) and the curtain gas (CUR) flows were set at pressures of 6 and 10 psi, respectively, whereas the declustering potential (DP), the entrance potential (EP) and the collision energy (CE) were kept at 120, 10 and 25 V, respectively. The standards used are siringic acid, vanillic acid, ferulic acid, gallic acid, caffeic acid, tyrosol and hydroxytyrosol (Extrasynthèse, Genay, France) dissolved in a hydroalcoholic solution of 0.1% NH4OH. For chromatographic separation we used the Phenomenex C18 column reversed phase 3 μm, 15 cm x 2.1 mm (Torrance, California, USA). 3. RESULTS AND DISCUSSION THE EFFECT OF LIME-AND-ASH TREATMENT AND THE FERMENTATION ON SUGAR COMPOSITION Reducing sugars and glucosides, the basic sources of carbon needed in the development of lactobacilli and other microrganisms, pass from olive flesh to the brine, where they are used by het-

59 erofermentative or homofermentative microrganisms to trasform in lactic acid. Homofermentative lactic acid bacteria generally converts more than 90% of fermented sugars to lactate. Traces of volatile acids, largely acetate, and neutral compounds such as acetoin and diacetyl are also produced. These trace catabolites have been postulated to arise from a secondary fermentation or from oxidation of lactate. The ph of raw fruit is around 4.5 (Table I). After lime-ash debittering the ph of olive flesh reaches the value of 13.1 up to the value of 9.3 after the repeated washing. In the first phase of fermentation, when Gram-negative bacteria take prevalence, the ph ranges from to about 6.0. This low ph promotes the growth of lactic acid bacteria that is aciduric with an optimal growth of between ph 5.5 and 5.8. Lactobacillus plantarum B124, used as a starter culture, showed an optimal growth at ph 6 and grows well at alkaline ph (8 and 10); its growth decreased (but not inhibited) at ph 4 while it was drastically reduced only at ph 2 (Fig. 2). At the end of the lactic fermentation, the ph reaches values of <4.0 and acidity increases, thus ensuring the preservation of the product. The lactic fermentation ends with the exhaustion of available carbohydrates [25-27]. The evolution of the reducing sugar content (Table II) was monitored because glucose and fructose play an important role during olive fermentation acting as a carbon source for microorganisms. Reducing sugars decreased to about 44% of their initial content (5.40 g/100 g) during debittering and washing steps, whereas in fermented olives, spontaneous and inoculated, about 90 and 94% of the reducing sugars were respectively consumed after just 15 days of fermentation. The titratable acidity in the brine after 15 days of fermentation reaches 8.72 g/l in the inoculated olives and 6.05 g/l in spontaneous olives and ph levels in the brine

60 194 and 3.9 respectively (Table I). Therefore, lactic acid bacteria used as inoculants increased the sugar consumption and consequently the acidification rate, so ensuring that any change of olive composition did not compromise the quality of the finished product. In Table III we reported the changes in the sugar composition during processing. Glucose and fructose were the main reducing sugars found in olive pulp (2,24 and 1,56 g/100 g of olive flesh, respectively); appreciable quantities of mannitol were also present (1,05 g/100 g of olive flesh); sucrose was present in very low concentrations. After the lime-ash treatment, fructose and mannitol increase (2,19 and 1,67 g/100 g of olive flesh, respectively) and glucose decreases, probably due to the isomerisation in alkaline ambient. The relative amount of mannitol in the fruit might indicate the potential of a cultivar for oil biosynthesis. Thus, the mannitol in the olive, as well as other polyols in many other higher plants, might be of specific importance in the metabolic transformation and synthesis of the fruit storage material. A linear trend between mannitol and oil content in olive fruit was observed [1, 4]. With subsequent washing it instead has a leaching of all the sugar structures that will be further degraded by the microrganisms involved in the fermentation process. The olive flesh at the end of fermentation is practically sugar free (Table II and III). THE EFFECT OF LIME-AND-ASH TREATMENT AND THE FERMENTATION ON PHENOLIC COMPOSITION Olive flesh is also rich in numerous glycosides, which can be a supplementary source of carbohydrates for olive fermentation when hydrolyzed [28]. Glucose is present in the molecular structure of principal glucosides (oleuropein, demethyl-oleuropein, verbascoside, ligstroside, elenolic acid glucoside or oleoside 11-methyl ester, hydroxytyrosol glucoside, tyrosol glucoside or salidroside and cornoside) and flavonoids (luteolin-7o-glucoside, luteolin-4'o-glucoside, isoquercetin, rutin, apigenin). There are also present no-glucosidic phenolic compounds such as luteolin. The phenolic acids deriving by cinnamic acid (p-cumaric, o- cumaric, caffeic, ferulic and sinapinic acids), benzoic acid (gallic, vanillic, syringic, gentisic, 3- hydroxybenzoic, 4-hydroxybenzoic and 3,4-dihydroxybenzoic acids) and the phenyl-alcohols (hydroxytyrosol and tyrosol) found in table olives originate both from biochemical processes involving the glucosides of the fruit and enzymes of micro-organisms involved in the fermentation processes, such as β-glucosidase and esterase [29], both by the action of alkaline substances used for the chemical debittering (NaOH or limeash mixture). In Table II and in Table IV we reported the changes in the phenolic composition during processing. The fruits of this cultivar is rich in luteolin (2912 mg/kg of olive flesh), rutin (264 mg/kg of olive flesh) and cynaroside (103 mg/kg of olive flesh); appreciable amount of hydrotyrosol (36 mg/kg of olive flesh) and verbascoside (57 mg/kg of olive flesh) are also present. After lime-ash treatment these compounds are completely degraded and is showed by the neo-formation of tyrosol (303 mg/kg of olive flesh). With washing the phenolic compounds are further degraded. After 30 days of

61 fermentation the situation changes: bacteria grown spontaneously or inoculated generate large amounts of luteolin (801 and 592 mg/kg of olive flesh, respectively) and appreciable amounts of hydroxytyrosol (98 and 140 mg/kg of olive flesh, respectively). In Spanish-style green olives in brine Blekas et al. [16] found high level of hydroxytyrosol (>170 mg/kg) as the prevailing phenolic compound. Remarkable levels of luteolin were determined also in Greek-style naturally black olives (25-75 mg/kg) [16, 30]. In the case of Mele olives fermented with the starter culture there is also shown an appreciable neo-formation of cathecol (26 mg/kg of olive flesh). CONCLUSIONS The consumption of a serving size of about 50 g (approximately 10 table olives) of table olive provides about 44 mg (olives spontaneously fermented) and 28 mg (olives fermented by inoculum of L. plantarum) of polyphenols from the flesh (Table II). This result is in agreement with the Intosso variety debittered with NaOH [31]: 65.3 mg/serving size (in this case 45.8 g of olives). Thus, the consumption of table olives in combination with the consumption of olive oil, which are basic components of Mediterranean diet, provide a large amount of natural antioxidants [30]. The table olives are consumed a lot, mainly by the Mediterranean population, and Italian cuisine in general also offers many dishes, aperitifs and appetizer in which olives are an essential ingredient (fish and meat cooked with olives, table olivebased condiments for pasta and pizza, breaddough mixed with green/black olives, bruschetta with olive paste). The gastronomic qualities of olives are perhaps very well-known, but the same cannot be said about the beneficial health and nutraceutical effects of table olives. For these reasons, the changes in sugar and phenolic fractions of table olives merit to be placed under further investigations. ACKNOWLEDGEMENTS This research was supported by grants from the Italian Ministry of Agricultural, Food and Forestry Policies, Projects "RIOM - Ricerca e Innovazione per l'olivicoltura Meridionale" and BIODATI Conservazione biodiversità, gestione banche dati e miglioramento genetico. The authors thank Nicola Cusmai for providing the olives. REFERENCES [1] V. Marsilio, C. Campestre, B. Lanza, M. De Angelis, Sugar and polyol compositions of some European olive fruit varieties (Olea europea L.) suitable for table olive purposes, Food Chemistry, 72, (2000). [2] J.P. Donaire, A.J. Sánchez-Raya, J. López- Gorge, L. Recalde, Etudes physiologiques et biochimiques de l olive. 1. Variation de la concentration de divers metabolites pendant son cycle evolutif, Agrochimica, 21, (1977). [3] J.P. Donaire, J. Lopez-Gorge, Lipid biosynthesis in leaf and fruit of olive, Journal of Experimental Botany, 29, (1978). [4] M. Wodner, S. Lavee, E. Epstein, Identification and seasonal changes of glucose, fructose and mannitol in relation to oil accumulation during fruit development in Olea europaea (L.), Scientia Horticulturae, 36, (1988). [5] G.G. Birch, Gas-liquid chromatography of food carbohydrates with special reference to trimethylsilyl derivatives A review, Journal of Food Science & Technology, 8, (1973). [6] K.M. Brobst, C.E. Lott, Determination of some components in corn syrup by gas-liquid chromatography of trimethylsilyl derivatives, Cereal Chemistry, 43, (1966). [7] T.R.I. Cataldi, G. Margiotta, L. Iasi, B. Di Chio, C. Xiloyannis, S.A. Bufo, Determination of Sugar Compounds in Olive Plant Extracts by Anion-Exchange Chromatography with Pulsed Amperometric Detection, Analytical Chemistry, 72, (2000). [8] S. Gomez-Gonzalez, J. Ruiz-Jimenez, F. Priego-Capote, M.D. Luque de Castro, Qualitative and quantitative sugar profiling in olive fruits, leaves and stems by gas chromatography - tandem mass spectrometry (GC-MS/MS) after ultrasound-assisted leaching, Journal of Agriculture and Food Chemistry, 58, (2010). [9] A. Russo, D. Bartoletti, E. Perri, G. Sindona, Characterization of some olive fruit carbohydrates by different applications of Ion Trap Mass Spectrometry, Proceedings of: XXII Convegno Nazionale della divisione di Chimica Analitica della Società Chimica Italiana, September 2010, Chiostro di Sant' Abbondio, Como, Italy. [10] J.P. Donaire, A.J. Sánchez-Raya, J. López- Gorge, L. Recalde, Metabolic changes in fruits and leaf during ripening in the olive, Phytochemistry, 14, (1975). [11] J. Fernández-Bolaños, M.J. Fernández Díez, M. Rivas Moreno, A. Gil Serrano, T. Pérez Romero, Azucares y polyoles en aceitunas verdes. II. Identificacion y determinacion cuantitativa por cromatografia sobre papel, Grasas y Aceites, 4, (1982). 195

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63 IN BIBLIOTECA ATTIVITÀ EDITORIALE DELLA DIVISIONE SSOG BIENNIO Caratterizzazione dell olio di jojoba utilizzato nel settore cosmetico: sua composizione in esteri A. Gasparoli, S. Tagliabue, C. Mariani Riv. Ital. Sostanze Grasse 87 (1), (2010) È noto che l olio di jojoba, pur essendo definito olio, differisce nettamente dagli altri oli vegetali per la sua composizione chimica, in quanto è una miscela di esteri di alcoli grassi con acidi grassi, con una composizione ben definita, in cui è sempre presente un doppio legame sia nella parte alcolica che in quella acidica. La valutazione della genuinità di questo prodotto è spesso affidata alla sola valutazione della composizione acidica, accanto a parametri chimico fisici che possono tuttavia risultare non significativi nell individuazione di anomalie compositive. In questo lavoro abbiamo voluto affrontare la caratterizzazione di campioni di olio di jojoba presenti in commercio prevalentemente nel settore cosmetico, utilizzando l analisi gascromatografica diretta dell olio in condizioni mirate, ed impiegando la spettrometria di massa come conferma dei risultati rilevati. È possibile richiedere copia del presente articolo a: myriam.scala@mi.camcom.it Gliceroltrieptanoato in sottoprodotti di origine animale. Determinazione HPLC- MS/MS P. Fusari, S. Venturini, P. Rovellini Riv. Ital. Sostanze Grasse 87 (1), (2010) Nel presente lavoro viene illustrata la messa a punto di una nuova metodica analitica per la determinazione di gliceroltrieptanoato (GHT) in sottoprodotti di origine animale (ABP animal by-product), attraverso l utilizzo della tecnica di cromatografia liquida abbinata alla rivelazione in spettrometria di massa con analizzatore a trappola ionica. Per la ionizzazione di tale composto è stata selezionata un interfaccia di tipo APCI con ionizzazione in modalità positiva, su singola transizione. Il metodo è stato sottoposto a procedura di validazione con la valutazione della precisione in termini di ripetibilità. I risultati ottenuti per un livello di GHT hanno mostrato per un valore di 350 mg/kg, un limite di ripetibilità pari a 48 mg/kg con una RSD (%) pari a 4,1%. La tecnica è risultata quindi selettiva, specifica e accurata per il proposito di applicazione. È possibile richiedere copia del presente articolo a: myriam.scala@mi.camcom.it Oil production by the marine microalga Nannochloropsis sp. F&M-M-24 P. Bondioli, L. Della Bella, G. Rivolta, D. Casini, M. Prussi, D. Chiaramonti, G. Chini Zittelli, N. Bassi, L. Rodolfi, M.R. Tredici Poster/paper presentato al 18 th European Conference Biomass and Exibition: from research to industry and markets. Lione (FR) 3-7 maggio 2010, (2010) Richiedere testo all autore Paolo Bondioli - paolo.bondioli@mi.camcom.it MAMBO: dalle alghe al biodiesel P. Bondioli, G. Rivolta, L. Della Bella Comunicazione presentata al Convegno Biodiesel e Sostenibilità: le alghe. Roma, 22 Giugno 2010 Richiedere testo all autore Paolo Bondioli - paolo.bondioli@mi.camcom.it Natura, problematiche e metodi di misura dei componenti minori del biodiesel P. Bondioli Comunicazione presentata al WS CHIMEC La filtrabilità del gasolio. Grottaferrata (RM), 23 Giugno 2010 Richiedere testo all autore Paolo Bondioli - paolo.bondioli@mi.camcom.it Nutritional-health quality index evaluation of novel extra virgin olive oils. Note I P. Rovellini, N. Cortesi, P. Fusari, P. Zaganelli Riv. Ital. Sostanze Grasse 87 (2), (2010) This research aimed to evaluate the nutritionalhealth quality index of some extra virgin olive oils from different production areas, monitoring their trend over the storage period. The potential of this method was also assessed with regards to the difference between novel extra virgin olive oils and other olive oils commercially available. The innovation of this new concept lies in the quality evaluation using parameters that are able to differentiate between products on the basis of a natural ratio between antioxidants and oxidized status, a positive nutritional aspect for the consumer. È possibile richiedere copia del presente articolo a: myriam.scala@mi.camcom.it Individuazione, mediante idrogenazione, di anomalie compositive dell olio di jojoba utilizzato nel settore cosmetico A. Gasparoli, M.E. Gaboardi, C. Mariani Riv. Ital. Sostanze Grasse 87 (2), (2010) L olio di jojoba, a differenza degli altri oli, è costitui- Notiziario 197

64 198 Notiziario to da esteri di alcoli grassi con acidi grassi, e non da trigliceridi. Per la sua specifica composizione, per la quale è molto utilizzato nel settore cosmetico, possiede un valore commerciale superiore agli altri oli. Per questo motivo l olio di jojoba è soggetto a commistioni con oli di minor pregio o con esteri ottenuti per sintesi. Nel presente lavoro ci si è prefissi di individuare la presenza di anomalie compositive sottoponendo l olio di jojoba ad idrogenazione e a successiva analisi per gascromatografia-spettrometria di massa. L idrogenazione dell olio di jojoba comporta la saturazione dei due doppi legami presenti negli esteri che lo costituiscono. In tal modo la valutazione per spettrometria di massa delle frazioni che eluiscono dall analisi gascromatografica consente di ottenere degli spettri specifici e chiaramente valutabili soprattutto perché ogni gruppo di estere può essere l insieme di più componenti. È possibile richiedere copia del presente articolo a: myriam.scala@mi.camcom.it About the presence of oxidised sterols in biodiesel samples - Short Laboratory Note C. Mariani, P. Bondioli Riv. Ital. Sostanze Grasse 87 (2), (2010) Biodiesel is a renewable fuel that can be prepared from natural oils both from vegetable and animal origin by means of a transesterification reaction with methanol. During these few last years several problems arisen during the biodiesel storage, because of the formation of solid impurities. Numerous studies demonstrated that said solid products are based on different molecules, such as saturated monoglycerides, waxes, citric acid and its salts, steryl glucosides. During the gaschromatographic evaluation of steryl glucosides the presence of peaks having retention times close to the one of free sterols was observed. These compounds were identified in this paper as hydroxysterols having the OH moiety located in position 6 of B ring. È possibile richiedere copia del presente articolo a: myriam.scala@mi.camcom.it Development of tomato seed oil based tomato products S. Porretta, G. Poli, G. Dellapina, V. Moscatelli, L. Palmieri and P. Bondioli Acta Horticulturae, 823, (2009) Abstract: È possibile richiedere copia del presente articolo a: myriam.scala@mi.camcom.it Considerazioni analitiche sul dosaggio del colesterolo A. Gasparoli, M.E. Gaboardi Riv. Ital. Sostanze Grasse 87 (3), (2010) Il dosaggio del colesterolo riveste un significato importante sia dal punto di vista nutrizionale che analitico. Tale valutazione nei grassi idrogenati può essere falsata dall utilizzo di uno standard interno inadatto. Infatti l idrogenazione, in funzione delle condizioni tecnologiche adottate, può comportare la trasformazione di colesterolo nello stanolo saturo 5αcolestan-3β-olo, che in alcune metodiche è previsto come standard interno per il dosaggio degli steroli. In questo lavoro, la presenza di questo composto nei grassi idrogenati è stata indagata e confermata mediante gascromatografia-spettrometria di massa analizzando campioni del commercio. È possibile richiedere copia del presente articolo a: myriam.scala@mi.camcom.it La classificazione merceologica degli oli naturali P. Bondioli, G. Bonardi and E. Patrignani Energie alternative e rinnovabili edizioni IPSOA INDICITALIA, (Milano 2010) Richiedere testo all autore: Paolo Bondioli - paolo.bondioli@mi.camcom.it Biodiesel Evoluzione delle norme Europee P. Bondioli Comunicazione presentata al Convegno UNICHIM Prove Interlaboratorio Prodotti Petroliferi, Milano, 10 novembre 2010 Richiedere testo all autore: Paolo Bondioli - paolo.bondioli@mi.camcom.it Biocarburanti dalle alghe: il progetto MAMBO D. Chiaramonti, M. Prussi, F. Martelli, M. Tredici, L. Rodolfi, N. Bassi, G. Chini-Zitelli, P. Bondioli, L. Della Bella, G. Rivolta Comunicazione presentata al Convegno Milano Greenergy, Fiera di Milano, 19 novembre 2010 Richiedere testo all autore: Paolo Bondioli - paolo.bondioli@mi.camcom.it

65 An innovative multivariate approach for analysis of different chemical-physical properties in biodiesel by FT-NIR spectroscopy F. De Melas, S. Barbero Lodigiani, S. Volonterio, I. Murgia, P. Bondioli, L. Della Bella, G. Rivolta Comunicazione presentata all 8 th Eurofedlipid Congress, Monaco di Baviera (DE), novembre 2010 Richiedere testo all autore: Paolo Bondioli - paolo.bondioli@mi.camcom.it Copaiba oleoresin: evaluation of the presence of polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) W. Gomes da Silva, N. Cortesi, P. Fusari BJPS Brazilian Journal of Pharmaceutical Sciences vol. 46 (3), , jul./set Full Text: Elenolic acid in virgin olive oil P. Rovellini Poster presentato all 8 th Euro Fed Lipid Congress Oils, Fats and Lipids: Health & Nutrition, Chemistry & Energy, Munich, Germany Novembre 2010 Elenolic acid in virgin olive oil: liquid chromatography-mass spectrometry method P. Rovellini Riv. Ital. Sostanze Grasse 85 (1), (2008) The aim of this paper was focused on the principal compound, elenolic acid, derived from oleoside methylester, and an analytical method was studied able to detect its natural and subsequent oxidized forms in virgin olive oil. The qualitative-quantitative methodology was developed by means of a liquidchromatography-mass spectrometry (LC-MS) technique using an electrospray interface operated in positive ionization mode with loganin used as an internal standard. The (d-) natural isomer form of elenolic acid was previously demonstrated to show antiviral activity; accordingly, it is important to determine this compound in virgin olive oils. This antiviral activity, together with previously established antioxidant activity reinforce the relevant physiological and pharmaceutical benefits of extra virgin olive oil for human health. The reported LC-MS method was validated for several principal analytical parameters and a discussion about the content of this secoiridoid compound in different virgin olive oils (i.e. fresh, expired and deodorized) is included in this report. È possibile richiedere copia del presente articolo a: myriam.scala@mi.camcom.it Sul possibile aumento degli alchil esteri negli oli extra vergini di oliva C. Mariani, G. Bellan Riv. Ital. Sostanze Grasse 88 (1), 3-10 (2011) Gli alchil esteri, fondamentalmente esteri metilici ed etilici degli acidi grassi, sono presenti negli oli extravergini di oliva in misura estremamente contenuta, mentre sono presenti in quantità maggiori negli oli di categoria inferiore, come i vergini e i lampanti, tant è vero che il basso contenuto in alchil esteri è stato proposto come parametro di qualità per gli oli extravergini di oliva. Il significato di questa determinazione è stato posto in dubbio in quanto secondo alcuni gli alchil esteri potrebbero aumentare durante la conservazione. In questa esperienza si è voluto verificare se durante la conservazione gli alchil esteri potessero aumentare nel tempo. Dai risultati ottenuti emerge che oli extravergini di oliva con contenuti di alchil esteri molto bassi non incrementano il loro contenuto almeno per tempi accettabili (18-24 mesi). Viceversa, oli che già in partenza mostrano un contenuto elevato in alchil esteri, al di sopra dei limiti fissati, possono incrementarne il contenuto. È interessante inoltre notare come in molti casi negli oli extravergini di oliva con bassi contenuti di alchil esteri gli eventuali incrementi siano a carico soprattutto dei metil esteri. È possibile richiedere copia del presente articolo a: myriam.scala@mi.camcom.it Componente acidica e volatile del latte P. Rovellini, S. Venturini, P. Fusari, C. Gigliotti, O. Bulgari, A. Caroli Comunicazione presentata al Convegno: Latte e Qualita Studio di Biomarcatori: i risultati del progetto BIOLAT, Brescia, 15 marzo 2011 Sito Regione Lombardia - pdf del Convegno rl/37/33/biolat_convegno_brescia_15_03_2011.pdf The evaluation of iodine value in biodiesel samples. A comparison between volumetric and gascromatographic techniques P. Bondioli, L. Della Bella, A. Gallonzelli Riv. Ital. Sostanze Grasse 88 (2), (2011) Iodine Value (I.V.) is one of the parameters contained in EN specification for biodiesel. Its limitation has the meaning to set a barrier for low oxidation stability products. The analytical determination of I.V. represents one of the most ancient test to be done on organic products as well as on fatty materials and can be carried out by means of Notiziario 199

66 200 Notiziario a volumetric test in which iodine chloride (Wijs reactive) is the reactant and sodium thiosulphate the titration solution. It is well known that I.V. can also be calculated from the fatty acids composition as determined by GC. This paper reports about the comparison study in which 104 samples of biodiesel were analyzed using both techniques. The obtained results are here reported and discussed along with some theoretical considerations. È possibile richiedere copia del presente articolo a: myriam.scala@mi.camcom.it New vitamin E isomers (gammatocomonoenol and alpha-tocomonoenol) in seeds, roasted seeds and roasted seed oil from the Slovenian pumpkin variety Slovenska golica B. Butinar, M. Bucar-Miklavcic, C. Mariani, P. Raspor Food Chemistry 128, Issue 2, 15 September 2011, pages Abstract: È possibile richiedere copia del presente articolo a: myriam.scala@mi.camcom.it Biodiesel: vent anni dopo 20 Anni di storia italiana del biodiesel P. Bondioli Comunicazione presentata al Convegno PA Service, trends and solutions. Soragna (PR) 22 Settembre 2011 Richiedere testo all autore: Paolo Bondioli - paolo.bondioli@mi.camcom.it BIOLI: le recenti acquisizioni della ricerca e le condizioni per lo sviluppo della filiera P. Bondioli Comunicazione presentata al Convegno Progetto interregionale NO FOOD Approfondimenti nella filiera bioli Padova 27 Ottobre 2011 Richiedere testo all autore: Paolo Bondioli - paolo.bondioli@mi.camcom.it Analisi HPLC-MS dei composti carbonilici volatili nell olio extra vergine di oliva: correlazione con l analisi sensoriale P. Rovellini, P. Zaganelli Riv. Ital. Sostanze Grasse 88 (3), (2011) Mediante la tecnica di cromatografia liquida e spettrometria di massa, è stata effettuata la determinazione quantitativa dei principali composti car- bonilici volatili, presenti in 43 campioni di olio appartenenti alla categoria olio extra vergine di oliva, olio vergine di oliva e lampante ed in parallelo è stata eseguita la valutazione dell analisi sensoriale mediante panel test. E noto che i composti carbonilici volatili rappresentano la frazione dei prodotti di ossidazione maggiormente percepiti dai consumatori come off-flavor e sono responsabili delle note sensoriali negative. Il presente lavoro vuole analizzare la presenza o meno di una correlazione tra prodotti di neoformazione ossidativa degli acidi grassi e insorgenza dei difetti rivelabili durante la valutazione sensoriale. In particolare sono stati presi in considerazioni i seguenti difetti: muffa, rancido e cetriolo. È possibile richiedere copia del presente articolo a: myriam.scala@mi.camcom.it Caractérisation de dix variétés d huile d olive algérienne: étude du profil en composés phénoliques par HPLC R. Laribi, F. Laincer, A. Tamendjari, P. Rovellini, S. Venturini, S. Keciri, L. Arrar Riv. Ital. Sostanze Grasse 88 (3), (2011) La présente étude est effectuée pour une caractérisation physico-chimique de dix variétés d huile d olive algérienne. Les paramètres de qualité (acidité, indice de peroxyde, K232 et K270), la composition chimique des huiles en acides gras, le dosage des composés phénoliques totaux et ortho-diphénols ainsi que le profil en composés phénoliques par HPLC sont déterminés. Les résultats obtenus montrent que les dix variétés d huile appartiennent à la catégorie d huile d olive vierge extra. Des variations cultivar-dépendantes ont été relevées concernant la composition en acides gras et en composés phénoliques. È possibile richiedere copia del presente articolo a: myriam.scala@mi.camcom.it Individuazione di oli e grassi interesterificati con metodologie diverse C. Mariani, G Bellan Riv. Ital. Sostanze Grasse 88 (3), (2011) La natura produce maggior quantità di oli liquidi che non grassi solidi, ma la richiesta di questi ultimi è molto elevata. In passato per indurire gli oli liquidi si ricorreva al processo di idrogenazione, a seguito del quale i doppi legami venivano saturati. Tuttavia durante il processo di idrogenazione si ha formazione di acidi grassi trans, acidi attualmente banditi negli alimenti. Un altro metodo per produrre grassi concreti è quello dell interesterificazione; tale processo, invece di modificare la struttura molecolare degli acidi grassi presenti sulla molecola del glicerolo,

67 provvede a ridistribuirli all interno dello stesso. Per interesterificare una sostanza grassa esistono due metodiche, una chimica che utilizza un catalizzatore ed una enzimatica. La differenziazione tra i due processi non è semplice in quanto i componenti principali sono identici. Nel presente lavoro si è cercato di differenziare i due processi sulla base dei componenti di neoformazione che si formano durante l interesterificazione chimica. È possibile richiedere copia del presente articolo a: myriam.scala@mi.camcom.it Valutazione analitica di steroli e stanoli nei lipidi idrogenati A. Gasparoli, M.E. Gaboardi Riv. Ital. Sostanze Grasse 88 (4), (2011) Sulla scia delle informazioni rilevate in una precedente ricerca, abbiamo proseguito l indagine su altre frazioni rilevate negli insaponificabili di lipidi idrogenati. Vengono analizzati campioni del commercio relativi a sego, palma, cocco, colza idrogenati. La separazione per cromatografia su strato sottile dell insaponificabile dei campioni esaminati pone in luce la presenza di alcune bande che vengono analizzate per gascromatografia-spettrometria di massa. Si sono in tal modo individuate frammentazioni riconducibili a stanoli che migrano con Rf diverso sulla lastra TLC. Tale comportamento viene confermato analizzando due standard di riferimento 5α colestan 3β olo e 5β colestan 3α olo. Si ipotizza che tale comportamento sia determinato dalla diversa posizione degli idrogeni introdotti dal processo di idrogenazione. Si pone anche in rilievo che effettuando l analisi della sola frazione a Rf degli steroli non si ha un quadro completo, sia dal punto di vista qualitativo che quantitativo, degli steroli realmente presenti nei campioni. È possibile richiedere copia del presente articolo a: myriam.scala@mi.camcom.it Composti carbonilici volatili e acidi grassi coniugati in latte vaccino. Risultati preliminari Poster presentato all VIII Congresso Nazionale di Chimica degli Alimenti, settembre 2010, Marsala (TP) Fatty acids content and carbonylic volatile compounds in cow s milk P. Rovellini, S. Venturini, P. Fusari, O. Bulgari, A.M. Caroli, C. Gigliotti Riv. Ital. Sostanze Grasse 88 (4), (2011) The payment of milk quality is still based in Italy on the legal requirements rather than on parameters related to the needs of processing technologies and dairy product quality. Management models based on technological and nutritional characteristics of milk are increasingly needed. The present work evaluated fatty acid (FA) contents and carbonylic volatile compounds (CVC) in cow s bulk milks produced in different herds of Brescia province (Italy). Milk samples were classified as conventional (CONV) or high quality (HQ) milks on the basis of protein and fat content, total bacteria and somatic cell count. The samples were successfully analysed employing two new high-performance liquid chromatography analytical methods, after a fat microextraction from milk. Significant differences were found for some parameters between the two milk typologies. In particular: C4:0, C5:1, C10:1, C20:1, and conjugated linoleic acids (CLA) were significantly higher in CONV milk, while C18:0, C20:0, C18:4?-3, C20:5 trienic, C18:3 dienic and C18:1 trans were significantly higher in HQ milk. As for CVC, significantly higher contents of C6:1, C7:0, C11:1, C10:0 and C11:0 were found in HQ milks. Several significant correlations were found between FA and CVC. A positive correlation was found between CLA and C10:1 CVC. The same CVC was negatively correlated with C18:3 and C18:4. In conclusion, these preliminary results focus on the real possibility to take into account FA and CVC biomarkers in addition to legal requirements for the qualification of milk as a function of its final destination. È possibile richiedere copia del presente articolo a: myriam.scala@mi.camcom.it Optimisation of the algae production in innovative ponds The MAMBO project M. Prussi, D. Chiaramonti, D. Casini, L. Rodolfi, N. Bassi, F. Bacci, P. Bondioli, L. Della Bella, G. Rivolta, G. Chini Zittelli, M.R. Tredici Comunicazione presentata alla 19 th European Biomass Conference and Exibition Berlino (DE) 6 9 Giugno Atti Richiedere testo all autore: Paolo Bondioli - paolo.bondioli@mi.camcom.it Improved raceway ponds for microalgae production M. Prussi, D. Chiaramonti, D. Casini, L. Rodolfi, N. Bassi, F. Bacci, P. Bondioli, L. Della Bella, G. Rivolta, G. Chini Zittelli, M.R. Tredici Comunicazione presentata al 19 th International Symposium on Alcohol Fuels - Verona Ottobre Atti Richiedere testo all autore: Paolo Bondioli - paolo.bondioli@mi.camcom.it Notiziario 201

68 202 Notiziario LIBRI Glycerol: The Platform Biochemical of the Chemical Industry ebook, by Mario Pagliaro Simplicissimus Book Farm, (April 2013) ISBN: (13 digit) - Price: Format: epub Extent: 158 pages + VII, heavily illustrated in color Synopsis Aimed to professionals in the chemical and oleochemical industries, this digital book answers the three main questions of the bioglycerol issue: - Is glycerol as a platform chemical here to stay? - Which are the glycerol derivatives capable to absorb a significant fraction of the large (and increasing) glycerol global surplus? - What is unique to the glycerin market, and what are the real strategic options of the chemical industry concerning this versatile feedstock? This book provides arguments offering a critical answer to each of the above questions, putting the bioglycerol issue in the context of the biodiesel and oleochemicals markets. Leading practitioners of the oleochemicals industry, researchers and consultants have been interviewed for producing this book. Their comments and unique insight is widely reported therein. The digital and hypertextual nature of the e-book provides readers with a number of advantages that are well suited to the business and technology readership. Instead than full references, the e-book shows links enabling rapid access to updated, reliable information. The e-book is searchable so that the reader can easily search for information of interest, instead of turning page after page. Moreover, readers will be able to carry this book in light portable devices that are perfectly suited, for example, for reading onboard during long airplane business trips. Table of Contents Preface 1 Glycerol: Properties and Direct Uses - Properties of Glycerol - Traditional Applications - Greening the Construction Industry with Bioglycerol - Bioglycerol as Anticorrosive Lubricant - Glycerol as Natural Antifreeze and Heat Fluid - Glycerol as a Solvent in Organic Synthesis - Glycerol as Bunker Fuel Additive 2 Understanding the Glycerol Market - Glycerol as a Platform for Green Fuels - Production of Hydrogen via Aqueous Phase Reforming - Production of Hydrocarbon Fuels via Aqueous Phase Reforming - Industrial Applications - References 3 Epichlorohydrin - Production of Epichlorohydrin - The Chemical Route to Epichlorohydrin 4 Glycols and Alcohols - Reduction of Glycerol - Achievements in Glycerol Upgrading to Propylene Glycol - Glycerol Hydrogenolysis - Biological reduction to PDO - Bioethanol and Biomethanol 5 Glycerol Ethers - Etherification of Glycerol - Conversion to Glycerol tert-butyl Ether (GTBE) - Etherification of Gycerol with Ethanol - Dehydration to 3-Hydroxypropionaldehyde - Polymerization to Polyglycerols - Direct Telomerization 6 Acrolein and Acrylic Acids - Dehydration of Glycerol - Glycerol-Derived Acrolein and Acrylonitriles - Oxydehydration to Acrylic Acid - Glycerol Dehydration to Acrolein - Glycerol-Derived 3 Hydroxypropionaldehyde 7 Glycerol Esters - Esterification of Glycerol - Acylglycerols - Carboxylation to Glycerol Carbonate - Esterification of Glycerol with Carboxylic Acids - Carboxylation to Glycerol Carbonate - Glyceryl Nitrate 8 Sustainability of Bioglycerol - An Insight into the Biodiesel Market - An Insight into the Oleochemicals Market - Is Bioglycerol Here to Stay? NOTIZIA IN BREVE Customers and user of lubricants and hydraulic oils gain access to a wealth of information on environmentally friendly alternatives. With the launch of the website interested parties have access to unbiased information on lubricants and hydraulic oils that are less toxic and better biodegradable than products based on mineral raw materials. The website has been developed by IVAM research and consultancy UvA BV of the University of Amsterdam and the Product Board for Margarine, Fats and Oils in cooperation with Rijkswaterstaat.

69 CONGRESSI 15 th AOCS Latin American Congress and Exposition on Fats and Oils September 20-23, Santiago, Chile Le aree tematiche generali saranno le seguenti: Analytical techniques and applications Biotechnology of lipids Chemistry and lipid synthesis Detergent and soaps Lipid oxidation and antioxidants Norms, regulations and food safety Oils, fats and lipids in human and animal health and nutrition Production statistics of fats and oils Specialty fats and oils Technological development and innovations in the processing of oil seeds, fats and oils SciX 2013 The Great SCIentific exchange Sept. 29-Oct. 4, Milwaukee, Wisconsin, USA Sostenibilità e minimizzazione dell'impatto ambientale sono diventati i driver di innovazione ampiamente riconosciuti nel settore della chimica. Aree tematiche: - Atomic Spectroscopy - Surface Science - Bioanalytical Analysis - Chemometrics - Nanotechnology - Process Analytical Chemistry - Vibrational Spectroscopy - Pharmaceutical Analysis - Chromatography - LIBS - Mass Spectrometry - Electrophoresis & Microfluidics - Raman Spectroscopy - Low-Field NMR - Security & Forensics - Surface Plasmon Resonance - Microscopy - Biomedical & Clinical Analyses - Environmental Analysis - Separation Science - Agricultural and Food Chemistry - Chemical Imaging Sono comunque accettate presentazioni riguardanti tutti i settori della chimica analitica. Il programma tecnico sarà caratterizzato da sessioni orali e sessioni poster. Practical Short Course on Vegetable Oil Processing and Products of Vegetable Oil / Biodiesel Sept. 29-Oct. 4, 2013 Texas A&M, College Station, Texas, USA Questo breve corso è un must per chiunque sia coinvolto in materia di trattamento di olio vegetale e interessato agli ultimi sviluppi in decolorazione, idrogenazione, interesterificazione, deodorizzazione, produzione di biodiesel e grassi trans free. L obiettivo del corso è formare il personale di produzione in principi e pratiche di: - Nuovi metodi di raffinazione di olio vegetale e di trasformazione - Metodi di decolorazione, idrogenazione, interesterificazione e deodorizzazione degli oli vegetali più importanti - Produzione di biocarburanti - Produzione di grassi trans free - Sistemi di filtrazione. Per informazioni aggiornate: 7 th Annual Algae Biomass Summit Sept. 30-Oct. 03, Orlando, Florida, USA The 7 th annual Algae Biomass Summit will take place Sept Oct. 3, 2013 at the Hilton Orlando in Orlando, Florida. This dynamic event unites industry professionals from all sectors of the world s algae utilization industries including, but not limited to, financing, algal ecology, genetic systems, carbon partitioning, engineering & analysis, biofuels, animal feeds, fertilizers, bioplastics, supplements and foods. Organized by the Algae Biomass Organization and coproduced by BBI International, this event brings current and future producers of biobased products and energy together with algae crop growers, municipal leaders, technology providers, equipment manufacturers, project developers, investors and policy makers. It s a true one-stop shop the world s premier educational and networking junction for all algae industries. The Algae Biomass Summit is where future and existing producers of algae products go to network with other industry suppliers and technology providers. It s where project developers converse with utility executives; and where researchers and technology developers rub elbows with venture capitalists. The Algae Biomass Summit is the largest, fastestgrowing algae event of its kind. In 2012, this event is expected to draw nearly 900 attendees and exceed the previous year s attendance by almost 20%. This growth is powered by the current strength of the industry and the positive outlook for future algae producers. Notiziario 203

70 204 Notiziario Summit tracks focus on the following: - Biology - Engineering - Analysis - Commercial Activities - Policy - Financing American Association for Aerosol Research (AAAR) 32 nd Annual Conference Sept. 30-Oct. 4, Oregon Convention Center Portland, Oregon, USA Il meeting offre una significativa opportunità per promuovere e divulgare i progressi tecnici nel campo della ricerca aerosol, fornendo un'eccellente piattaforma internazionale di scambio tra esperti nel campo della ricerca e dell'industria. Al momento non sono disponibili informazioni sul programma scientifico e sulle modalità d iscrizione th Sepawa Congress and European Detergents Conference October 08-11, Fulda, Germany The SEPAWA congress, which takes place annually in October, has become a central event for the detergents/cleansers, cosmetics and perfume industries. Numerous lectures by international experts provide new knowledge and experience. The comprehensive options for company presentations create a trade fair-like environment at the congress. An attractive supporting programme specifically supports and promotes social and personal contacts. 3 rd MS-Food Day 9-11 ottobre Trento, Italia Dopo il successo della prima e seconda edizione è un piacere annunciare la 3 a edizione MS-Food Day, che si terrà nei giorni dal 9 all 11 ottobre 2013, nella città di Trento, organizzata dalla Fondazione Edmund Mach e dalla Divisione di Spettrometria di Massa della Società Chimica Italiana. Oggi, diventano sempre più importanti alimenti sicuri e di alta qualità, con buone caratteristiche nutrizionali e sensoriali. La caratterizzazione di componenti alimentari, l'autenticazione e la tracciabilità dei prodotti alimentari, il controllo di qualità, l'identificazione e la quantificazione di additivi, allergeni, contaminanti chimici e microbiologici, la conservazione di componen- ti alimentari durante lo stoccaggio e la trasformazione, le tecnologie per il packaging, le determinazioni nutrizionali e le proprietà sensoriali, hanno conseguenze diffuse in materia di agricoltura, industria e sanità. La Spettrometria di massa gioca un ruolo fondamentale in tutti questi aspetti. In effetti, i miglioramenti tecnologici e metodologici della spettrometria di massa e il suo accoppiamento con processi di separazione molecolare resa altamente sensibile, metodi veloci e validati sono strumenti fondamentali nel campo della scienza e della tecnologia alimentare. La 3 a Conferenza MS-Food Day è un'ottima occasione per presentare lo stato di avanguardia della spettrometria di massa in chimica degli alimenti, insieme con le più recenti innovazioni nella strumentazione e nelle applicazioni. Occasione ottimale per soddisfare le esigenze e le offerte delle istituzioni accademiche, industrie alimentari e di strumentazione. Gli argomenti principali sono: - Innovations in food science applications of MS - Food safety - Quality control/traceability - Food integrity - Functional food - Metabolomics/Foodomic - Sensory quality: linking sensory and MS data - Packaging - Process monitoring - Methodological and instrumental developments - Recent trends in mass spectrometry - Ion sources and mass analysers - High resolution mass spectrometry - Ambient Mass Spectrometry - Direct Injection/Infusion Mass-pectrometry - High-throughput techniques - Data Analysis La Conferenza sarà caratterizzata da sessioni orali e sessioni di poster. Per informazioni aggiornate: American Fats & Oils Association Annual Meeting October 9-10, Grand Hyatt, NYC, NY The American Fats and Oils Association is a nonprofit organization. Our purpose is to foster trade and commerce within the United States and throughout the world for animal, fish and vegetable fats, oils and proteins. The AFOA works to promote uniformity and certainty in the standards of such products and in the customs and usages of the trade; to promote friendship, sociability and culture. This year s annual meeting will again be held at the

71 Grand Hyatt in New York City. Please save the date October 9-10, 2013 so you can be sure to attend what is expected to be another highly anticipated event. Home and Personal Care Ingredients Central and Eastern Europe Exhibition & Conference October 15-16, Warsaw, Poland Due giorni di Convegno scientifico e seminari tecnici per fornire le informazioni su nuovi servizi e prodotti; piattaforma ideale per confrontarsi con i rappresentanti, fornitori di prodotti, tecnici di laboratori, service provider su problematiche inerenti il settore. Per informazioni: Oilseed & Grain Trade Summit October 21-23, Minneapolis, Minnesota, USA Join close to 1,000 oilseed and grain importers and exporters at the must-attend Oilseed & Grain Trade Summit - October 21-23, 2013 in Minneapolis, MN What issues will be covered in the 2013 agenda? - Shifts in trade flows and emerging trends in the global oilseed and grains supply chain - New developments in vegetable oil usage for food, fuel and industrial applications - New oil traits: addressing the needs of the supply chain - New tools for managing grain and oilseed price risk - Burgeoning demand for vegetable meal and feed grain usage in the aquaculture industry In addition to expanded content, an exciting lineup of speakers will share their insights on a range of key issues for the industry: - Keynote Speaker: Carl Casale, President and CEO, CHS, Inc. who will address Staying Relevant in a Rapidly Changing World - Thomas Mielke, Editor-in-Chief, OIL WORLD Publications will present his Global Meat and Veg Oil Outlook - New Processing Technologies for Ag Commodities - Bluford (Blu) Putnam, Managing Director and Chief Economist, CME Group will speak on the Impact of Global Financial Markets on Global Agriculture Who Should Attend? Input providers, service providers, handlers and intermediaries, producers, processors, transportation, animal feed, food, biofuel and bio-industrial manufacturers, animal protein and aquaculture producers, plant operations management, industry trade associations, governmental agencies and academia. summary5ea67d8c547e41289e 19754c70abe4cb.aspx IFIB 2013 Italian Forum on Industrial Biotechnology and Bioeconomy ottobre 2013 Napoli, Italia Assobiotec (Associazione italiana per lo sviluppo delle biotecnologie) che fa parte di Federchimica, InnovHub SSI e Italian Biocatalysis Center invitano aziende e centri di ricerca alla terza edizione dell'italian Forum on Industrial Biotechnology and Bioeconomy (IFIB), che si terrà il 22 e 23 Ottobre 2013 a Napoli, presso la Camera di Commercio in via S. Aspreno 2. Il workshop ha l'obiettivo di presentare progetti di ricerca nel campo della biotecnologia industriale e di rafforzare la rete nell'area euro-mediterranea, promuovendo partenariati tra industria e università. La rete Enterprise Europe Network si occuperà di gestire la sessione di incontri one to one che si terrà presso IFIB ( Per visualizzare ulteriori informazioni e aggiornamenti: (consulatre il calendario) 004ec461dbb5f9f7319fd52df3/IFIB+2013+Brochu re.pdf?mod=ajperes Global Algae Biodiesel World Day Algae Fuel State of Art International Workshop Ottobre Jaipur, India Le Alghe sono una delle più promettenti fonti di biodiesel, combustibile biodegradabile che può essere prodotto utilizzando mare e acque reflue senza sfruttare le risorse di acqua dolce. Gli argomenti sono accuratamente selezionati ed esaminano gli aspetti biologici, di ingegneria, di marketing e finanziari per la commercializzazione delle alghe. Si tratta di una importante piattaforma per gli scambi produttivi tra le comunità accademiche, commerciali e di investimento. Guidati da questioni legate al cambiamento climatico e l'aumento del costo del petrolio, le aziende e gli enti governativi stanno sviluppando l'uso dei biocarburanti derivati dalle alghe, per ridurre le emissioni di carbonio dalle centrali elettriche e generare carburanti rinnovabili nei trasporti. Notiziario 205

72 206 Notiziario Il Global Algae Biodiesel World 2013 esamina il vasto potenziale mercato mondiale di biocarburante prodotto dalle alghe. Esplora la tecnologia, nuove ricerche, e la conoscenza per lo sviluppo di questa nuova generazione di biocarburanti. Offre una singola piattaforma, le migliori competenze per discutere e analizzare le dinamiche presenti e future dal punto di vista tecnologico ed economico. Programma del workshop: Il passato, presente e futuro della produzione delle alghe. Commercializing Algae Biodiesel: Prospects and Priorities Algae Growing, Harvesting and Extraction Technologies Scaling Up Algae Production to Commercially Viable Levels Optimizing Efficiency in Algae Harvesting and Dewatering Identifying and Creating the Ideal Strain Algae Carbon Values: Perspectives from The Carbon Market Developing a low cost novel & High Productivity Enclosed Hybrid System for algae farming for oil Demonstration of Algae Photo bioreactor and Biodiesel Making Per iscrizioni, informazioni e aggiornamenti contattare: algaebdiesel@gmail.com tel th Euro Fed Lipid Congress Ottobre Antalya, Turkey Il congresso affronterà temi diversi riguardanti i grassi, gli oli di colza, palma, girasole. I partecipanti provenienti dall'industria, dalla ricerca e da associazioni di consumatori, si incontreranno per discutere le conoscenze e le applicazioni in ampia gamma di discipline correlate ai lipidi. Conferenze plenarie - European Lipid Science Award Lecture - European Lipid Technology Award Lecture - Chevreul Medal Lecture - Wilhelm Normann Medal Lecture - H.P. Kaufmann Memorial Lecture Argomenti principali - Analytics, Authenticity, Lipidomics - Health and Diseases - Bioscience, Biocatalysis, Biochemistry - Physical Chemistry - Processing - Oxidation, Antioxidants and Deep Frying - Oilseeds, Plant Breeding and Plant Lipids - Lipids in Animal Science - Olive Oil - Rapeseed Oil - Palm Oil - Sunflower Oil - Soybean Oil - Marine Oils, Micobial Lipids and Microalgae Oils - Oleochemistry, Biodiesel - Sustainability Per aggiornamenti: index.php 22 nd IFSCC Conference Oct Nov. 1, Rio de Janeiro, Brazil Annotare l evento. Per informazioni e aggiornamenti: SCS Formulate November 12-13, 2013 Ricoh Arena, Coventry UK SCS Formulate is the UK s largest event of its kind, focusing on raw materials, ingredients and formulation services for personal care and cosmetic products. In the exhibition you will be able to find every conceivable ingredient, raw material and other vital tool of your trade. It is a unique opportunity to see the new, the innovative, the proven, the everyday and the obscure everything you need to create, make and market cosmetics for today and tomorrow. Attendees will have the opportunity to enhance formulation techniques, learn about the latest and future trends, get advice on the regulatory and scientific issues in the market place. We are putting the finishing touches to the Knowledge programme and will be publishing it shortly. Please contact benkyte@stepex.com if you would like to be notified when the programme is published. For more information about each exhibitor and to discover what technologies they will be presenting at SCS Formulate: Opening Times: Tue 12 Nov: Wed 13 Nov: Contact the Organiser For more information about exhibiting please contact Ben Kyte at scsformulate@stepex.com or by calling +44(0) International Dairy Show 2013 November 3-6, Chicago, Illinois La fiera Dairy Show International torna in formato biennale e propone temi sulla trasformazione lattiero-casearia, alimentare e delle bevande. Affronterà temi riguardanti la tecnologia, le innova-

73 zioni nelle formulazioni, trasformazione, imballaggio, distribuzione, sicurezza alimentare e altro ancora. Un team di vendita e di marketing sarà presente per valutare le tendenze, innovazioni e soluzioni per ridurre i costi e per fornire più valore ai clienti. Practical Short Course on Trends in Margarine and Shortening Manufacture, Non-Trans Products November 03-07, Texas A&M, College Station, Texas, USA Objectives of Short Course Train production personnel in principles and practices of: Production of margarines, low fat and non-trans spreads Processing techniques Ensuring product quality Product demonstrations using soybean, cottonseed, corn, and palm oils Program Sunday, November 3, :00 PM Registration - College Station Hilton 5:15 PM Welcoming Remarks & Review of Workshop Plan - Short Course Staff, Food Protein R&D Center 6:00 PM Dinner - Rudy's BBQ Monday, November 4, :30 AM Bus leaves hotel for Research Oil Mill, Riverside Campus 8:00 AM Chemistry Of Vegetable Oils - M.S. Alam 9:00 AM Review of Processing and Functional Properties of Fats and Oils - E. Hernandez 10:00 AM Break 10:15 AM Introduction to Practical Pilot Plant Sessions - K.F. Hoyer & B.H. Buchert 11:00 AM Group Photo 11:15 AM Lunch 12:15 PM Margarine, Spreads, and Shortening- Analytical Technique - TBA 1:15 PM Automatic Bulk Filling & Packaging of Margarine & Shortening Products - L.Nielsen 2:15 PM Break 2:30 PM Formulation and Technologies for Non-trans Products Non-trans ingredients - B. Wainwright 3:30 PM High Throughput Margarine & Shorten-ing Product Development, Process Control & Shelf-life Prediction Using TD-NMR Technology - W. Samaniego 4:30 PM Bus leaves for hotel Tuesday, November 5, :30 AM Bus leaves hotel for Research Oil Mill, Riverside Campus 8:00 AM Crystallization and processing technology - K.F. Hoyer 9:30 AM Functional Ingredients for Margarines and Shortenings - J. Neddersen 10:30 AM Break 10:45 AM Crystallization of Fats/Crystallizer - J. Neddersen 11:45 AM Lunch 12:45 PM Demo (Soft tables Margarines) - K.F. Hoyer & B.H. Büchert 1:45 PM Break 2:00 PM General advantages by use of palm oil - J. Fine 3:00 PM Lecithin & Its Application in Margarine and Shortenings - A.Rumayor 4:00 PM Bus leaves for hotel Wednesday, November 6, :30 AM Bus leaves hotel for Research Oil Mill, Riverside Campus 8:00 AM Processing Equipment Evaluation - B.H. Büchert 9:00 AM Demo (Puff Pastry margarine) - B.H. Büchert/K.F. Hoyer 10:30 AM Break 10:45 AM Introduction to DSC, NMR, and TA - K.F. Hoyer 11:45 AM Graduation Lunch 1:15 PM Use of Enzymatic Interesterification for the Production of Non-trans Maragrines - TBA 2:15 PM Demo (Optimization Trials Table Margarine) - K.F. Hoyer & B.H. Büchert 3:15 PM Break 3:30 PM Antioxidants for Margarine/Shortenings - N. Senanayake 4:30 PM Bus leaves for hotel Thursday, November 7, :30 AM Bus leaves for Research Oil Mill, Riverside Campus 8:00 AM Demo (N2 incorporation in Margarine/Shortening Products) and Demo (Process understanding) - K.F. Hoyer & B.H. Bücher 9:30 AM Break 9:45 AM Product Evaluation - K.F. Hoyer & B.H. Büchert 10:45 AM Final Remarks and Questions from Participants - M.S. Alam 11:00 AM Short Course Adjourns - Bus leaves for hotel Notiziario 207

74 208 Notiziario OFI Asia 2013 November 5-6, Bangkok, Thailand OFI Asia 2013 si terrà in Thailandia presso il Landmark Hotel di Bangkok nelle giornate dal 5 al 6 novembre Una conferenza di due giorni dove esperti del settore esamineranno le tendenze di mercato che riguardano gli oli thailandesi e regionali, tra cui i grassi di palma, olio di soia; le prospettive di mercato per i biocarburanti, la domanda potenziale globale di olio di palma sostenibile, mercati di esportazione, e gli ultimi progressi tecnologici per aumentarne la produttività. Progetto di programma della conferenza: Sessione commerciale: - Supply and demand trends in the global and ASEAN markets - Export markets Sessione tecnica: - Advances in technology and applications Il programma è soggetto a cambiamenti. Per informazioni contattare: Serena Lim, Editor, Oils & Fats International, UK Tel: ; serenalim@quartzltd.com Australasian Section AOCS Biennial Meeting & Workshops November 6-8, New South Wales, Australia AAOCS 2013 darà l'opportunità di conoscere il progresso dell'industria relativo gli aspetti riguardanti gli oli e i grassi. Il tema di quest'anno concentra il dibattito sulla produzione di oli per uso alimentare contro il loro maggiore uso di biocarburanti. Condurranno la discussione maggiori esperti delle industrie alimentari e di biocarburanti che esporranno la loro visione in tema di produzione di olio e l'uso futuro. Sulla stessa linea, parteciperanno esperti leader nella nuova area di biomateriali per discutere lo sviluppo della ricerca e come questo influenza il futuro degli oli commestibili e grassi industriali. La gamma di argomenti in questo incontro prevede: Food industry and Processing New Analytical Methods Agriculture Aquaculture Lipemic Index Lipid Oxidation and Antioxidants Omega-3 Fatty Acids Fatty Acids, Lipids, and Health Nutrition and Health Lipids and Metabolic Syndrome Lipids and Cognitive Function Novel Foods and Supplements Olive Oil and Other Vegetable Oils Biotechnology Per aggiornamenti consultare: mnumber=936 American Cleaning Institute Annual Meeting & Industry Convention Jan. 27-Feb. 1, Orlando, Florida, USA La Convention offre la possibilità di esaminare opportunità di business, strategie di marketing e scambio di informazioni. Al momento non sono disponibili ulteriori informazioni. Per aggiornamenti: Pittcon March 2-7, 2014 Chicago, Illinois, USA The 2014 comprehensive Technical Program will include, but not limited to; areas of analytical chemistry, applied spectroscopy, life sciences, bioanalysis, food sciences and related disciplines such as: Instrumental Analysis Chromatography Molecular and Atomic Spectroscopy Portable Instruments Electrochemistry Mass Spectrometry Lab-on-Chip technology Novel Application of Measurement Science Nanotechnology Biomedicine Shale Energy Informatics Pharmaceutical Environmental Genomics, Proteomics Metabolomics, Metabonomics Forensics Polymer Food Science Biofuels aspx?id= info@pittcon.org

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76 INNOVHUB - Stazioni Sperimentali per l Industria Azienda Speciale della Camera di Commercio di Milano Divisione SSOG Via Giuseppe Colombo MILANO Tel Fax info@ssog.it - sito web: