MECCANISMI DI REGOLAZIONE DELL OMEOSTASI DEL FERRO NEL DIFFERENZIAMENTO ERITROIDE NORMALE E TALASSEMICO

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1 UNIVERSITÀ DEGLI STUDI DI MILANO SCUOLA DI DOTTORATO IN MEDICINA MOLECOLARE DIPARTIMENTO DI SCIENZE E TECNOLOGIE BIOMEDICHE CURRICULA GENOMICA-PROTEOMICA/CICLO XXIV TESI DI DOTTORATO DI RICERCA MECCANISMI DI REGOLAZIONE DELL OMEOSTASI DEL FERRO NEL DIFFERENZIAMENTO ERITROIDE NORMALE E TALASSEMICO DOTTORANDO: ALESSANDRA COLANCECCO TUTOR: Prof.ssa MARIA DOMENICA CAPPELLINI COORDINATORE DEL DOTTORATO: Ch.ma Prof. MARIO CLERICI ANNO ACCADEMICO

2 INDICE INTRODUZIONE... 4 CAPITOLO 1: IL METABOLISMO DEL FERRO... 4 Assorbimento intestinale di ferro...7 Il Riciclo del Ferro Ematico...10 Il ferro nella circolazione...11 Il ferro di deposito...16 Meccanismi di rilascio dal macrofago...16 Regolazione dell omeostasi intracellulare di ferro...17 L epcidina: il gene e la proteina...20 Regolazione dell espressione dell epcidina...23 La ferroportina: il gene e la proteina...29 Regolazione dell'espressione della ferroportina...31 Ferroportina ed eritropoiesi...32 Ferroportina e macrofagi...34 Regolazione dell epcidina dall ossigeno, dall anemia e dall eritropoiesi: GDF15 e HIF...37 GDF HIF...40 Bone Morphogenetic Protein Emojuvelina (HJV)...43 Matriptasi 2 (TMPRSS6)...45 Emocromatosi Ereditaria (HH)...47 Anemie da sovraccarico di ferro: CDA e β-talassemie...50 CAPITOLO 2: LE SINDROMI TALASSEMICHE La β - Talassemia...51 Talassemia Major...54 La Terapia della β Talassemia...56 Talassemia Intermedia...58 L Eritropoiesi inefficace...58 CAPITOLO 3: IL DIFFERENZIAMENTO ERITROIDE L emopoiesi...61 L eritropoiesi...64 Fattori di crescita regolanti l eritropoiesi

3 L eritropoietina...68 Fattori trascrizionali regolanti l eritropoiesi...70 Switch di sintesi delle globine...74 SCOPO MATERIALI E METODI Colture di cellule CD34+ derivate da sangue periferico...81 Valutazione della morfologia cellulare...83 Analisi al citofluorimetro...84 Conta cellulare...85 Colture di macrofagi...86 Analisi dell espressione genica...87 REAL-TIME PCR...90 Dosaggio Proteico...93 Composti utilizzati...94 Analisi al citofluorimetro del ferro intracellulare...95 RISULTATI Analisi del GDF15 durante il differenziamento eritroide in colture controllo...97 Analisi genica e proteica del GDF15: confronto tra colture controllo, TM e TI durante il differenziamento eritroide Analisi genica dell epcidina (HAMP): confronto tra colture controllo, TM e TI durante il differenziamento eritroide Analisi del GDF15 in colture controllo, TM e TI trattate con DFO e con FAC Analisi molecolare della ferroportina totale FPN e delle isoforme FPN1A e FPN1B in colture controllo, TM e TI durante il differenziamento eritroide Analisi molecolare della ferroportina totale FPN e delle isoforme FPN1A e FPN1B in colture controllo, TM e TI trattate con DFO e FAC Analisi del GDF15 in macrofagi controllo, TM e TI trattati con DFO e FAC Analisi molecolare della ferroportina totale FPN e delle isoforme FPN1A e FPN1B in macrofagi controllo, TM e TI trattati con DFO e FAC Analisi dell espressione del recettore della Transferrina (TFR) in cellule CD34 controllo, TM e TI 118 DISCUSSIONE BIBLIOGRAFIA

4 Introduzione: capitolo 1 INTRODUZIONE CAPITOLO 1: IL METABOLISMO DEL FERRO Il ferro è quantitativamente il metallo più importante dell organismo. Gli organismi viventi, dalle forme di vita primitive alle più complesse, necessitano di ferro per sostenere molte reazioni biologiche, quali la respirazione mitocondriale, la proliferazione cellulare (attraverso il controllo dell enzima ribonucleotide reduttasi) e la sintesi di proteine come l emoglobina e la mioglobina (1). Le funzioni biologiche del ferro si basano sulle sue proprietà chimiche, come la sua capacità di formare complessi con numerosi ligandi organici secondo modalità flessibili e dinamiche, e la sua capacità di interconversione ossidoriduttiva tra la forma ferrosa (Fe 2+ ) e la forma ferrica (Fe 3+ ). L efficienza del Fe 2+ come donatore di elettroni e del Fe 3+ come accettore di elettroni, è fondamentale per molte reazioni biochimiche e rende il ferro un componente indispensabile per la vita. Tuttavia le stesse proprietà che rendono utile il ferro lo rendono anche tossico, in quanto capace di generare radicali liberi che possono promuovere l ossidazione delle proteine, la perossidazione dei lipidi di membrana e la modificazione degli acidi nucleici. L aumento delle specie reattive dell ossigeno oltre la capacità antiossidante dell organismo viene chiamato stress ossidativo e si verifica in numerose condizioni patologiche: infiammazione cronica, danno da ischemia di riperfusione e neurodegenerazione. L eccesso di ferro aggrava lo stress ossidativo e accelera la degenerazione tissutale, come dimostrato nelle patologie da sovraccarico di ferro primario o secondario. I livelli di ferro devono quindi essere finemente regolati tramite un omeostasi adeguata che permetta alle cellule di utilizzare il ferro evitandone gli effetti dannosi. L organismo umano contiene circa 3-5 g di ferro, la maggior parte del quale (~60 70%) contenuto nell emoglobina dei globuli rossi circolanti (2), altri organi ricchi in ferro sono il fegato e i muscoli. Circa il 20 30% del 4

5 Introduzione: capitolo 1 ferro corporeo è immagazzinato negli epatociti e nei macrofagi reticoloendoteliali, dove il ferro è complessato alla ferritina. La quota restante di ferro si trova nella mioglobina, nei citocromi e negli enzimi contenenti ferro (ossidasi, catalasi, perossidasi, etc). Inoltre il ferro viene riciclato (circa 20 mg/die) dall emoglobina degli eritrociti senescenti nei macrofagi reticoloendoteliali per far fronte alle continue esigenze eritropoietiche. La distribuzione del ferro nell organismo è mostrata in Figura 1. Figura 1 - Assorbimento, Distribuzione ed Eliminazione del Ferro da Parte dell Organismo. 5

6 Introduzione: capitolo 1 L omeostasi del ferro è essenzialmente un sistema chiuso. Nel soggetto adulto sano la quantità totale di ferro (circa 4-5 grammi) è mantenuta costante grazie al bilancio tra ferro assorbito e ferro eliminato. Le perdite sono di circa 0,8 mg/die nell uomo e 1,4 mg/die nella donna in età fertile ed avvengono tramite meccanismi non specifici quali la desquamazione cellulare o il ciclo mestruale. La stessa quantità di ferro viene assorbita ogni giorno nel tratto gastroenterico, prevalentemente a livello del duodeno e del tratto superiore del digiuno, dove il ph acido ne consente la solubilizzazione. L assorbimento quotidiano è di solito piuttosto limitato (0,7-1 mg) e corrispondente soltanto al 5-10% del ferro totale ingerito. Data la sua importanza, sia la carenza, sia l eccesso di ferro nell organismo producono danni rilevanti dal punto di vista clinico. La manifestazione clinica più nota associata alla carenza di ferro è l anemia mentre la condizione opposta, ossia un sovraccarico di ferro, provoca ossidazione, morte cellulare, e danno d organo dovuti all effetto tossico che questo metallo, in forma libera, esercita. I primi studi molecolari sul metabolismo del ferro si concentrarono su due molecole abbondanti e facili da isolare. Nel 1937, la ferritina splenica di cavallo fu la seconda di tutte le proteine ad essere cristallizzata (3). Una decade più tardi la transferrina fu identificata come un abbondante proteina del plasma trasportatrice del ferro (4). Queste molecole sono entrambe utilizzate in clinica per valutare lo stato del ferro. Con meccanismi diversi sia la ferritina che la transferrina sequestrano il ferro per renderlo non reattivo, evitando così la formazione di radicali dell ossigeno con la reazione di Fenton: Fe 3+ + H 2 O 2 Fe 2+ + OOH + H + 6

7 Introduzione: capitolo 1 ASSORBIMENTO INTESTINALE DI FERRO In individui non trasfusi, il ferro proviene esclusivamente dalla dieta. Poiché non esistono meccanismi specifici di escrezione del ferro attraverso il fegato o i reni, l equilibrio del ferro è principalmente controllato a livello intestinale. Lo studio di modelli animali mutanti spontanei creati in laboratorio ha determinato un importante avanzamento delle conoscenze sui meccanismi di assorbimento del ferro (5). Figura 2 - Assorbimento di ferro nell enterocita. L assorbimento di ferro proveniente dalla dieta avviene nell intestino e principalmente nella porzione prossimale del duodeno (Figura 2), dove cellule polarizzate disposte in villi, gli enterociti, protrudono nel lume intestinale per massimizzare la superficie di assorbimento. Il ferro della dieta è presente come ferro eme e non-eme. Il ferro eme costituisce solo una piccola frazione del ferro ingerito con la dieta, ma è altamente biodisponibile: è captato tramite un meccanismo non ancora ben identificato che coinvolge uno specifico trasportatore e richiede il rilascio del ferro dall eme all interno dell enterocita. Al contrario l assorbimento del ferro non-eme è basso e strettamente regolato nella prima porzione del duodeno. Il ferro ferrico Fe 3+ proveniente dalla dieta 7

8 Introduzione: capitolo 1 viene ridotto a ferro ferroso a livello del lume per l azione di una reduttasi dell orletto a spazzola, denominata citocromo b duodenale (Dcytb), un omologo del citocromo B561 che può usare l acido ascorbico come un cofattore (6). La regolazione dell assorbimento del ferro avviene a livello delle 2 interfacce dell epitelio intestinale: la membrana apicale e la membrana basolaterale. Il ferro Fe 2+ entra negli enterociti assorbenti attraverso il DMT1, lo stesso trasportatore di ferro usato per il trasferimento endosomale nel ciclo della trasferrina. La forma intestinale del DMT1 è prodotta da una differente isoforma di splicing del mrna, che dà origine ad una proteina con un estremità C-terminale alterata (7,8). Il DMT1 intestinale è localizzato principalmente sulla membrana apicale e sugli endosomi subapicali (9). I protoni necessari per il cotrasporto del metallo, forniti dall acido gastrico, affluiscono nella porzione prossimale del duodeno dove il DMT1 è maggiormanete espresso e più attivo. La richiesta di protoni come cotrasportatori spiega perché il trattamento con antiacidi o bloccanti di istamina H2 interferisca con l assorbimento di ferro. L espressione di DMT1 aumenta in mancanza di ferro (10) ed è regolata a livello post-trascrizionale da un 3 IRE presente nell isoforma espressa nell intestino (7). Il DMT1 permette l entrata anche di altri cationi divalenti come Mn 2+, Co 2+, Zn 2+, Cu 2+, e Pb 2+, sebbene la sua importanza sia stata dimostrata in vivo solo per il Fe 2+ (11). Topi knock-out per il gene codificante il DMT1 hanno confermato che questa proteina è il principale trasportatore transmembrana di ferro nelle cellule epiteliali intestinali e, attraverso il ciclo della transferrina, nei precursori eritroidi (12). Ciò nonostante, altri tipi di cellule non richiedono DMT1 per l uptake di ferro e questo suggerisce l esistenza di altri importatori transmembrana di ferro. Ad eccezione dei canali del calcio di tipo L, che hanno capacità di trasportare ferro (13), non è stato identificato ad oggi nessun candidato in grado di importare atomi di ferro nelle cellule. 8

9 Introduzione: capitolo 1 Il gene SLC11A2 che codifica il trasportatore DMT1 genera quattro isoforme per splicing alternativo che differiscono tra loro all estremità 3 o 5 non tradotta (UTR) per la presenza o l assenza di una sequenza IRE (14). Studi comparativi delle varianti di DMT1 hanno indicato che le isoforme +IRE localizzate principalmente a livello della membrana plasmatica hanno una cinetica di internalizzazione più lenta rispetto alle isoforme IRE e sono indirizzate ai lisosomi. In contrasto la regione C-terminale delle varianti IRE contiene peptidi segnale richiesti per un endocitosi efficiente e localizzazione successiva negli endosomi di riciclo (15). Per questo motivo, è probabile che le isoforme +IRE siano principalmente coinvolte nel trasporto di ferro attraverso la membrana plasmatica, mentre le isoforme IRE nel trasporto endosomiale. Sembra che il DMT1 sia regolato dai livelli di ferro con aumentata espressione della proteina negli epatociti ricchi di ferro, bassa espressione nel fegato normale e assenza di espressione negli epatociti ferro-carenti (16). Quest osservazione è confermata dalla presenza di una sequenza IRE localizzata al 3 UTR del trascritto che potrebbe portare a una diminuzione della stabilità del mrna in condizioni di sovraccarico di ferro e conseguente diminuzione nell espressione di DMT1. Tuttavia, la regolazione di DMT1 è complessa ed è possibile che la regione 5 UTR del trascritto o il dominio N-terminale della proteina possano modificare gli effetti regolatori con un meccanismo tessuto-specifico. Mutazioni di DMT1 sono state descritte per la prima volta in modelli animali (10) che presentavano anemia ipocromica microcitica non correggibile con ferro orale o parentale. La prima mutazione nell uomo è stata trovata allo stato omozigote in un paziente Ceco con anemia congenita greve e livelli di ferritina normali o lievemente aumentati (17). Le mutazioni descritte comprendono mutazioni puntiformi (E399D, G212V, R416C), delezioni che portano a perdita di esoni (V114del) o ad alterazioni dello splicing (delctt nell introne 4). 9

10 Introduzione: capitolo 1 Una volta all interno della cellula epiteliale intestinale il ferro ha due possibili destini. Il ferro può essere utilizzato per le esigenze della cellula, o, se non necessario, stivato nella ferritina, in questi casi sarà eliminato assieme all enterocita per desquamazione nel lume intestinale. Alternativamente, se necessario all organismo, il ferro passerà attraverso la membrana basolaterale alla transferrina: il passaggio dipenderebbe dall esportatore del ferro IREG, o ferroportina1 (anche chiamata FPN1, IREG1, MTP1, SCL39A1, e ora SCL40A1) ( ) che è l unico esportatore di ferro conosciuto ad oggi. IL RICICLO DEL FERRO EMATICO La maggior parte del ferro presente nell organismo si trova legato all emoglobina e la fagocitosi degli eritrociti senescenti da parte dei macrofagi garantisce un efficiente riciclo del ferro. Al giorno vengono recuperati da questa via di riciclo circa mg di ferro che verranno poi utilizzati per la produzione di nuova emoglobina durante l eritropoiesi midollare (Figura 3). I macrofagi deputati alla degradazione dei globuli rossi senescenti si trovano principalmente nella milza, nel midollo osseo e nelle cellule del Kupffer. Durante la loro permanenza nel circolo sanguigno (120 giorni circa), i globuli rossi subiscono delle modificazioni biochimiche a livello della loro membrana: esternalizzazione di fosfatidil serina, perossidazione delle lipoproteine, perdita di residui di acido sialico ed espressione degli antigeni di senescenza che costituiscono dei segnali per i macrofagi che vanno così ad identificare le cellule che devono essere degradate mediante un processo di fagocitosi. Il gruppo eme viene distrutto ed il ferro ad esso legato viene rilasciato nel citoplasma del monocita, ora lo ione può intraprendere diverse vie: complessarsi alla ferritina e rimanere all interno della cellula, oppure fuoriuscire da essa mediante la ferroportina per poi essere captato dalla transferrina plasmatica. 10

11 Introduzione: capitolo 1 Figura 3 - Riciclo del ferro ematico. IL FERRO NELLA CIRCOLAZIONE La transferrina è una glicoproteina monometrica che funge da trasportatore di ferro plasmatico mantenendolo in forma solubile e non tossica, incapace di innescare la reazione di Fenton/Haber-Weiss (18). È prodotta e secreta principalmente dagli epatociti, e possiede due domini omologhi leganti ognuno un atomo di ferro allo stato trivalente (Fe 3+ ). Negli individui sani, soltanto il 30% della transferrina circolante lega il ferro, mentre nelle condizioni patologiche di sovraccarico, il ferro satura gradualmente la capacità legante della transferrina e forma complessi a basso peso molecolare attivi dal punto di vista ossidativo. Il ferro non legato alla transferrina (non-transferrin-bound iron, NTBI) viene internalizzato dai tessuti tramite meccanismi non ancora identificati e causa danni cellulari e lesioni tissutali. La transferrina ha tre funzioni principali: solubilizza il Fe 3+, altrimenti insolubile a ph fisiologico, lega il ferro con elevata affinità impedendogli di generare radicali tossici, 11

12 Introduzione: capitolo 1 permette l internalizzazione del ferro nella cellula attraverso l interazione con il suo recettore (TfR1) (Figura 4). Figura 4 Metabolismo del ferro. TfR1 è un omodimero costituito da due subunità identiche di circa 90 KDa, in grado di legare due molecole di transferrina con un affinità molto alta (18). Il TfR1 è presente in tutte le cellule nucleate dell organismo, ma è espresso ad alti livelli nei precursori eritroidi, nei linfociti attivati, nelle cellule cerebrali placentari e nei tumori. L espressione elevata del recettore è correlata alla necessità di captare il ferro in modo massivo per sostenere la sintesi di emoglobina ed eme (nelle cellule eritroidi), il trasporto di ferro (nelle cellule placentari) e la proliferazione cellulare. In molti tessuti, la captazione del ferro avviene attraverso un meccanismo noto come ciclo della transferrina (Figura 5). 12

13 Introduzione: capitolo 1 Figura 5 - Ciclo della transferrina. Durante tale ciclo, i frammenti di membrana cellulare che trasportano complessi TfR1- transferrina vanno incontro ad endocitosi tramite endosomi ricoperti di clatrina. Rimosso il rivestimento di clatrina, gli endosomi subiscono acidificazione con l ingresso di protoni, causando un cambiamento conformazionale nel complesso TfR1-transferrina e promuovendo il rilascio di ferro. Sebbene molti tessuti esprimano TfR1 a bassi livelli, pochi tipi di cellule sono strettamente dipendenti dal ciclo della transferrina per la captazione del ferro. Ciò nonostante, l inattivazione del gene di TfR1 (Tfr1) nel topo è incompatibile con la vita: topi Tfr1 -/- (o knock out) muoiono per grave anemia e alterazioni neurologiche al dodicesimo giorno di vita embrionaria (19). In accordo con la funzione indispensabile di TfR1, nell uomo non sono note patologie da deficit di TfR1. Topi eterozigoti per l inattivazione di Tfr (Tfr1 -/+ ) presentano un quadro di lieve ipocromia, ma depositi di ferro aumentati nei macrofagi midollari e splenici. Da queste osservazioni si deduce che il TfR1 è indispensabile per l eritropoiesi, oltre che per lo sviluppo del SNC, ma sembra non essenziale per l uptake del ferro di altre cellule dell organismo. 13

14 Introduzione: capitolo 1 Un nuovo membro della famiglia dei recettori della transferrina (TfR2) è stato clonato e sequenziato qualche anno fa (20). L analisi di sequenza proteica ha rivelato che il TfR2, come il TfR1, è una glicoproteina transmembrana, il cui dominio extracellulare mostra il 66% di omologia con il TfR1, ma la cui distribuzione tissutale appare ristretta agli epatociti e alle cellule eritroidi. Il TfR2 ha una funzione simile al TfR1, ossia interagisce con la transferrina in determinate condizioni di ph. Tuttavia l affinità di questo recettore per la transferrina legata al ferro è 25 volte più bassa rispetto a quella del TfR1. Inoltre i pattern di espressione dei due recettori della transferrina sono distinti. Mutazioni nel recettore 2 della transferrina sono responsabili di una rara forma di emocromatosi ereditaria, chiamata HFE3 (21). All interno dell endosoma, il ferro inorganico liberato è ridotto dalla ferroreduttasi STEAP3 a Fe2+ (24-10), e diventa substrato per il trasportatore transmembrana di metalli divalenti DMT1 (divalent metal transport 1 o SCL11A2), formalmente chiamato NRAMP2, DCT1 (10,11) (Figura 6). Figura 6 Destino del ferro all interno dell eritrocita. 14

15 Introduzione: capitolo 1 Attraverso modelli animali (22), è stato dimostrato che il DMT1 è elettrogenico, poiché richiede il cotrasporto di protoni per esportare il Fe 2+ attraverso la membrana. Questo è reso possibile dal basso ph ambientale degli endosomi (~ 5.5). Nel citoplasma, il ferro è incorporato nella protoporfirina per produrre il gruppo eme oppure viene trattenuto nelle forme di deposito. Al contempo, gli endosomi che contengono la transferrina e il suo recettore riportano le proteine sulla superficie cellulare affinché siano riutilizzati. Per produrre eme è indispensabile che il ferro oltrepassi la membrana mitocondriale impermeabile agli ioni. Recentemente è stato identificato l importatore mitocondriale di ferro chiamato mitoferrina (anche conosciuta come SLC25A37), una proteina transmembrana fondamentale per la cessazione di ferro alla ferrochelatasi e per il suo inserimento nella protoporfiria IX. È interessante notare che mutazioni della mitoferrina provocano un disordine clinico simile alla protoporfiria eritropoietica causata da mutazioni nel gene della ferrochelatasi (23). In passato è stato ipotizzato che il ferro assimilato dai precursori eritroidi venisse incorporato nell emoglobina e rimanesse all interno della cellula fino alla senescenza dell eritrocita. Recentemente, Quigley e colleghi (24) hanno descritto un esportatore di eme, FLVCR, che sembra necessario per il normale sviluppo eritroide. Tale studio ipotizza che gli eritroblasti necessitino di un meccanismo di esporto dell eme in eccesso per evitarne la tossicità. Topi knock-out per il gene codificante FLVCR (25) non completano l eritropoiesi con conseguente morte fetale. Quando invece il gene FLVCR viene inattivato dopo la nascita, gli animali sviluppano anemia microcitica grave, dimostrando che l esporto di eme è indispensabile alla normale eritropoiesi. 15

16 Introduzione: capitolo 1 IL FERRO DI DEPOSITO La molecola di ferritina è formata da una struttura apoproteica (costituita da 24 subunità di 44 KDa) con una cavità (26), nella quale possono essere ospitati fino a 4500 atomi di ferro. Il diametro della ferritina può raggiungere i A sotto forma di complesso inorganico. Il processo di cattura del ferro è rilevante dal punto di vista biologico, in quanto gli atomi di ferro sono resi non tossici ed insieme biologicamente accessibili, se richiesti. Esiste una ferritina tissutale (intracellulare o citoplasmatica) che funge da deposito di ferro all interno della cellula, ed una ferritina sierica destinata alla glicosilazione e al rilascio del ferro nel siero. I livelli di ferritina sierica sono strettamente correlati con l entità dei depositi marziali di ferro, tanto da comportare l utilizzo della ferritina stessa come indice di valutazione dei depositi marziali, assumendo che a 1 µg/l di ferritina corrispondono 8-10 mg di ferro. Nelle condizioni di deficit di ferro la concentrazione della ferritina può scendere fino al di sotto di 10 µg/litro, mentre in condizioni di sovraccarico ha valori elevati da 1000 a µg/litro. MECCANISMI DI RILASCIO DAL MACROFAGO La maggior parte del ferro viene riutilizzata grazie al catabolismo dell emoglobina: a fronte di 1-2 mg di ferro ricambiati ogni giorno vengono riutilizzati circa mg rilasciati dal macrofago. Bisogna quindi ipotizzare che segnali analoghi a quelli destinati all intestino arrivino al macrofago per regolarne il rilascio di ferro in base alle richieste dell eritropoiesi. L importanza del rilascio si evidenzia in situazioni in cui il rilascio di ferro al macrofago è bloccato per difetti genetici di proteine dell esporto o per l azione di citochine infiammatorie. Tuttavia i meccanismi di rilascio non sono stati del tutto chiariti. 16

17 Introduzione: capitolo 1 Un ruolo chiave è certamente svolto da ceruloplasmina e da ferroportina, come dimostrato da studi sulle rispettive patologie. REGOLAZIONE DELL OMEOSTASI INTRACELLULARE DI FERRO Poiché i mammiferi non possiedono meccanismi fisiologici di escrezione del ferro, l omeostasi del ferro è regolata principalmente a livello dell assorbimento intestinale. Secondo studi recenti, sono tre i segnali regolatori che contribuiscono al mantenimento dell omeostasi del ferro (2). Il primo è chiamato regolatore della dieta e deriva dall evidenza, nota da lungo tempo, che dopo l ingestione di ferro gli enterociti preposti all assorbimento intestinale di ferro risultano resistenti ad acquisire ferro per molti giorni. Questo fenomeno, descritto anche come blocco della mucosa, viene probabilmente causato dall accumulo intracellulare di ferro, che a sua volta sopprime l espressione delle proteine di trasporto del ferro che si trovano a livello delle cripte duodenali (DMT1 e ferroportina) tramite un meccanismo mediato dalle iron-regulation proteins, IRPs (27). Un secondo segnale, chiamato regolatore dei depositi controlla la captazione di ferro come risposta alle fluttuazioni di ferro nell organismo. È noto che in condizioni di carenza di ferro, l assorbimento dello stesso a livello duodenale aumenta di due-tre volte, fino a quando i depositi di ferro non sono ripristinati. È stato ipotizzato che questo tipo di regolazione richieda la programmazione delle cellule precursori delle cripte (28) nell epitelio duodenale a seguito della saturazione della transferrina plasmatica. Il terzo segnale, chiamato regolatore eritropoietico modula l assorbimento di ferro in risposta alle esigenze dell eritropoiesi. Dal momento che la maggior parte del ferro dell organismo è richiesto dal midollo osseo per l emoglobinizzazione dei globuli rossi, non sorprende che questo segnale abbia una funzione dominante sul controllo dell omeostasi del ferro. Inoltre, è in grado di aumentare l assorbimento del ferro 17

18 Introduzione: capitolo 1 indipendentemente dai livelli di deposito del ferro. Questo spiega anche l accumulo patologico di ferro presente in disordini caratterizzati da un eritropiesi inefficace (come le sindromi talassemiche, le anemie diseritropoietiche congenite, o l atransferrinemia), nei quali l assorbimento del ferro aumenta sensibilmente nonostante i depositi dell organismo siano saturi. L omeostasi intracellulare di ferro è principalmente mantenuta attraverso il meccanismo regolatorio post-trascrizionale dei geni implicati nel metabolismo del ferro: il sistema IRE- IRP (Figura 7). La regolazione è esercitata da specifici sensori del ferro, proteine citoplasmatiche denominate Iron Regulatory Protein (o IRPs), che possono interagire con sequenze nucleotidiche definite IRE (Iron Responsive Element) presenti nella sequenza 5 o 3 non tradotte (5 o 3 UTR) degli mrna di alcuni geni regolati dal ferro (29). Gli elementi IRE sono formati da circa 30 nucleotidi, con una caratteristica conformazione a stelo. Nel mrna della ferritina L o H, l IRE è localizzato nella regione 5 UTR. Nel mrna del TfR esistono 5 elementi IRE, nella regione 3 UTR. Quando il ferro è carente nelle cellule, il legame IRP-IRE blocca la traduzione di ferritina e facilita quella di TfR1, stabilizzando il corrispondente mrna. L inverso succede quando il ferro è in eccesso. Le proteine sensori del ferro sono due: IRP1, che esplica attività aconitasica nel ciclo di Krebs, e IRP2. Entrambe sono in grado di legare gli stessi IRE, ma non sono equivalenti. La carenza di ferro induce la mancata formazione del cluster Fe-Zn e fa perdere la funzione aconitasica ad IRP1 che acquisisce la funzione IRP. La proteina IRP2 non ha funzione aconitasica ed è regolata attraverso la degradazione proteosomica, che è innescata dal legame di IRP2 con il ferro. Il sistema IRE-IRP permette una regolazione posttrascrizionale rapida e coordinata. Infatti uno stesso stimolo (carenza di ferro, ipossia ecc.) può regolare simultaneamente numerosi mrna che possiedono elementi IRE, tra cui i 18

19 Introduzione: capitolo 1 trasportatori intestinali (DMT1, ferroportina 1), transferrina e l enzima ALA-sintetasi coinvolto nella primo step della sintesi dell eme. Non è ancora chiaro perché sia necessario avere 2 IRPs, ma recenti osservazioni suggeriscono che le due proteine possano rispondere in modo differente alle variazioni fisiologiche della pressione di ossigeno (30). Esse potrebbero anche avere come target differenti mrnas contenenti IRE. L inattivazione di IRP1 nel modello murino non causa un fenotipo particolare, mentre l inattivazione di IRP2 comporta livelli elevati di ferritina nel cervello e sintomi neurodegenerativi in età adulta, provocati dalla disfunzione di alcuni gruppi di neuroni (31). Figura 7 - Rappresentazione dell azione di IRE/IRP. 19

20 Introduzione: capitolo 1 L EPCIDINA: IL GENE E LA PROTEINA Nel 2001 è stata scoperta una proteina epatica con funzione antimicrobica chiamata EPCIDINA (hepcidin, hep=epatocita, idine= indica l attività antimicrobica). L omeostasi sistemica del ferro implica un controllo accurato del suo assorbimento intestinale e del suo utilizzo nell eritropoiesi, nonché un riciclo efficace dagli eritrociti senescenti ed un immagazzinamento controllato da parte degli epatociti e macrofagi. Il regolatore principale del metabolismo del ferro è rimasto ignoto sino a pochi anni fa. Nel 2001 è stata identificata una proteina, denominata epcidina o LEAP1 (Liver-expressedantimicrobial peptide), prodotta dal fegato in condizioni di sovraccarico di ferro ed in grado di bloccare l assorbimento di ferro e il rilascio dal macrofago (32). Si tratta di un peptide con attività antimicrobica, codificato da una coppia di geni nel topo e da un gene in copia singola (HAMP) nell uomo. Studi cristallografici sulla struttura dell epcidina di 25 aminoacidi hanno rilevato che il peptide contiene quattro ponti disulfuro, con la possibilità di assumere conformazioni multiple (33). Tramite spettrometria a dicroismo circolare è stato dimostrato che l epcidina urinaria umana è ricca di foglietti β e la successiva spettroscopia con risonanza magnetica nucleare (RMN) ha confermato la presenza di una struttura a forcina stabilizzata dai quattro ponti disulfuro, uno dei quali coinvolge due cisteine contigue (Figura 8). 20

21 Introduzione: capitolo 1 Figura 8 Struttura cristallografica dell epcidina. La struttura a forcina del peptide mostra inoltre una distribuzione anfipatica dei residui, con aminoacidi idrofobici sul lato convesso e aminoacidi carichi positivamente sul lato concavo. Sebbene questa configurazione sia tipica dei peptidi antimicrobici ricchi in cisteine, l epcidina tuttavia mostra in vitro una modesta attività antimicrobica solo a concentrazioni molto alte (34) e il ruolo funzionale di questa struttura rimane ancora dubbio. L epcidina viene sintetizzata in modo predominante dal fegato, anche se bassi livelli di mrna sono presenti in altri tessuti, come cuore, milza e cervello. Il gene che codifica il peptide si trova sul cromosoma 19q13 e contiene tre esoni che danno un prodotto di 84 aminoacidi (pre-proepcidina). Questo precursore è dapprima processato in un peptide di 72 aminoacidi (pro-epcidina) che comprende una sequenza segnale di 24 aminoacidi ed uno specifico sito di clivaggio al terminale NH 2 per dare la forma circolante di 25 aminoacidi. Si conosce poco riguardo al meccanismo di processamento del precursore dell epcidina e all importanza della regolazione post-traduzionale sui livelli di peptide circolante. Studi recenti hanno evidenziato che la pro-epcidina viene espressa ad alti livelli negli epatociti, localizzandosi nell apparato di Golgi e nelle sue vescicole (35). Qui si accumula prima di ricevere un segnale per la sua secrezione. La presenza della pro-epcidina nel siero 21

22 Introduzione: capitolo 1 suggerisce che questo precursore possa essere coinvolto nella regolazione del metabolismo del ferro (43). Tuttavia, l esistenza di una correlazione tra il mrna dell epcidina e i livelli di peptide sembra implicare che il processamento della pro-epcidina non rappresenti una tappa limitante per la quota di peptide maturo (36). In vitro, l epcidina umana mostra attività antibatteriche e antifungine (37) a concentrazioni di µm. Come nel caso di altri peptidi cationici, questa attività è favorita da soluzioni a bassa forza ionica. La concentrazione urinaria dell epcidina è compresa normalmente in un range di 3-30 nm ( ng/ml) e può aumentare fino a 10 volte durante le infezioni. Non è chiaro se l attività antimicrobica dell epcidina rappresenti un importante funzione biologica, un residuo dell evoluzione, od una conseguenza della sua conformazione strutturale dettata dalla sua attività come ormone regolatore del ferro. Il coinvolgimento dell epcidina nel metabolismo del ferro è stato suggerito dall osservazione che la sintesi dell epcidina era indotta dal ferro della dieta (38). Il suo ruolo come regolatore negativo dell assorbimento di ferro nell intestino tenue è stato però scoperto accidentalmente utilizzando un topo knock-out per un gene chiamato USF2 che si trova vicino al gene HAMP. Il topo knockout per USF2 sviluppava un fenotipo di emocromatosi con progressiva deposizione di ferro nel fegato e nel pancreas (39). Ricercando le cause di tale sovraccarico, si scoprì che l animale era privo del mrna dell epcidina, poiché la distruzione del gene USF2 creava un effetto accidentale anche sui geni vicini, incluso il gene HAMP. La conferma definitiva del ruolo essenziale dell epcidina nell uomo è giunto dallo studio di due famiglie affette da emocromatosi giovanile i cui soggetti portatori della patologia mostrarono di essere omozigoti per mutazioni deleterie nel gene dell epcidina (40). Studi successivi hanno chiarificato il ruolo del peptide come regolatore centrale dell omeostasi del ferro. Topi che over-esprimevano l epcidina sotto il controllo di un 22

23 Introduzione: capitolo 1 promotore specifico per il fegato nascevano con un anemia da carenza di ferro letale, e potevano essere salvato soltanto con una somministrazione parenterale (e non orale) di ferro (41). Questi esperimenti dimostravano che, prima della nascita, l epcidina era in grado di inibire il trasporto di ferro attraverso la placenta e, dopo la nascita, inibiva l assorbimento di ferro nell intestino tenue. Inoltre apparve chiaro che l attività inibitoria dell epcidina transgenica non poteva essere superata da altri meccanismi, anche durante la severa anemia. I modelli animali indicano quindi che l epcidina agisce: come regolatore negativo dell assorbimento intestinale di ferro; come regolatore negativo del trasporto di ferro attraverso la placenta; come regolatore negativo del rilascio di ferro nei macrofagi (principalmente splenici); come regolatore negativo dell esporto di ferro dagli epatociti (Figura 9). Figura 9 - Funzione regolatoria dell epcidina. La quantità di mrna di epcidina nelle cellule del fegato diminuisce in risposta all ipossia e all eritropoiesi inefficace (sovrapponendosi alla risposta alla carenza di ferro) (42,43) e 23

24 Introduzione: capitolo 1 aumenta in risposta al trattamento con lipopolisaccaride o durante processi infiammatori di altra eziologia (44). Questi effetti opposti sono in accordo con il ruolo centrale di regolatore del ferro: la diminuzione dei livelli plasmatici della proteina, richiesta dall eritropoiesi e dall ipossia, promuove l assorbimento intestinale di ferro e il suo rilascio dai macrofagi. Al contrario, l aumento dell epcidina in risposta al sovraccarico e all infiammazione inibisce l assorbimento del ferro e il suo rilascio. Studi recenti hanno identificato un sito consenso per STAT3 in grado di mediare l induzione dell epcidina nell infiammazione, attraverso un sistema di cascata di segnali scatenato dall interluchina-6 (45,46). Inoltre a livello del promotore esiste anche un sito di legame per il fattore di trascrizione indotto dall ipossia HIF (von Hippel-Lindau/hypoxiainducible transcription factor): HIFα agisce come repressore quando si lega al promotore dell epcidina (47). Sono stati identificati potenziali siti di legame anche per C/EBPα, USF2, HNF4α, p53 e altri fattori trascrizionali altamente espressi, ma non è ancora chiaro quale ruolo abbiano nella regolazione dell espressione dell epcidina in vivo (48-49). Il signaling attraverso la cascata del Bone Morphogenetic Protein (BMP) mediante le proteine Son of Mother Against Decapentaplegic (SMAD) rimane il maggiore meccanismo conosciuto per attivare la trascrizione di epcidina. Questa connessione tra BMPs ed epcidina è stata scoperta da 2 ricerche indipendenti. Nel corso dei loro studi del signaling cellulare, Wang e colleghi inattivarono esclusivamente negli epatociti il gene codificante una proteina SMAD, SMAD4 (50). Con loro sorpresa, il fenotipo dominante ottenuto con tale inattivazione fu un emocromatosi grave, simile a quella osservata in topi privi di epcidina. In contemporanea, Babitt e colleghi studiando la proteina emojuvelina (HJV) mutata in pazienti con emocromatosi giovanile (51) dimostrarono che l emojuvelina agiva come un co-recettore di BMP per stimolare la trascrizione di epcidina. In entrambi 24

25 Introduzione: capitolo 1 gli studi l espressione dell epcidina era stata stimolata dal trattamento con BMPs, in una maniera dipendente dalla presenza di SMAD4 (50), BMPs e emojuvelina (51). Sembra probabile che le SMADs attivate leghino direttamente il promotore dell epcidina in risposta al segnale di BMP. Tuttavia, in contrasto con altri fattori trascrizionali, i siti consenso per il legame SMAD sono altamente variabili e difficili da predire. Sebbene Truska e colleghi abbiano localizzato elementi responsivi al BMP nel promotore dell epcidina (52), rimane ancora da stabilire come avvenga esattamente la regolazione trascrizionale attraverso BMP. REGOLAZIONE DELL ESPRESSIONE DELL EPCIDINA I fattori che regolano l omeostasi del ferro modulano anche i livelli di epcidina. L'epcidina è regolata sia dalle quantità di ferro-transferrina circolante, sia dalle riserve intracellulari di ferro. Le variazioni quantitative del ferro di deposito, l eritropoiesi, l infiammazione e l ipossia sono fattori che influenzano l assorbimento di ferro nell intestino e il suo rilascio dalle cellule, e sono quindi i più importanti fattori sistemici che regolano i livelli di mrna di epcidina nel fegato. L espressione di epcidina aumenta in risposta al ferro orale e parenterale e diminuisce in condizioni di deficit di ferro. La regolazione di epcidina da parte del ferro agisce con un meccanismo a feedback che permette al ferro di entrare nel plasma quando la domanda è alta, ma ne limita il rilascio quando esso non è richiesto. Il meccanismo con cui il ferro agisce non è ancora stato chiarito completamente, ma parecchi studi suggeriscono che sono tre le proteine che contribuiscono, individualmente o in associazione tra loro, alla regolazione della sintesi di epcidina: HFE e TfR2 (come molecole di rilevamento del ferro extracellulare) HJV (come molecola di rilevamento del ferro intracellulare attraverso il pathway delle bone morphogenetic protein) (Figura 10). 25

26 Introduzione: capitolo 1 HFE è una proteina di membrana, appartenente alla famiglia delle HLA di classe I, mutata nella forma più comune di emocromatosi ereditaria. È espressa principalmente a livello epatico, a bassi livelli in molti altri tessuti. Studi recenti (53,54) hanno evidenziato che la proteina HFE interagisce con il TfR1 sulla membrana basolaterale delle cellule indifferenziate delle cripte, alla base dei villi duodenali. HFE compete con la transferrina per il sito di legame sul TfR1, sebbene la transferrina diferrica abbia maggiore affinità di legame per il recettore. A basse % di saturazione della transferrina, HFE è sequestrata da TfR1 e non è in grado di interagire con TfR2 (omologo alla forma1 ma principalmente espresso nel fegato dove viene anche sintetizzata l'epcidina) e di conseguenza non induce l espressione di epcidina. Figura 10 Regolazione dell espressione dell epcidina. 26

27 Introduzione: capitolo 1 L emojuvelina appartiene alla famiglia delle RGM (Repulsive Guidance Molecule), ed è sintetizzata dagli epatociti come proteina di membrana legata a GPI (glicosilfosfatidilinositolo). Si comporta come co-recettore per BMP-2, 4 e 6 (55,56). BMP, attraverso la cascata di trasduzione del segnale di SMAD, è il principale attivatore dell espressione dell epcidina. A livello extracellulare BMP-2, 4 e 6 si legano all emojuvelina di membrana (m-hjv) e al recettore di BMP (BMPR). Questo induce la fosforilazione di SMAD-1, 5 e 8 con formazione di complessi eteromerici in grado di attivare il mediatore comune SMAD4. A seguito della traslocazione nucleare, i complessi eteromerici SMAD stimolano la trascrizione del gene HAMP. Sebbene molti ligandi della famiglia BMP siano in grado di legare l epcidina in vitro e in vivo, recentemente è stato dimostrato che solo BMP6 è responsabile dell attivazione ferrodipendente della cascata SMAD. Esiste anche una forma solubile di emojuvelina (s-hjv), prodotta dal fegato e dal muscolo scheletrico, che competendo con la mhjv per i ligandi di BMP, antagonizza l espressione di epcidina (57). Il pro-ormone furina convertasi è responsabile del rilascio di shjv; la secrezione di HJV è regolata dal ferro e dall ipossia. Un altro segnale in grado di indurre l espressione di epcidina appartiene al gruppo delle citochine pro-infiammatorie: l interleuchina 6 (IL6) stimola l espressione dell epcidina in vivo attraverso il pathway JAK/STAT3 causando riduzione di ferro sierico, ritenzione di ferro nei macrofagi e blocco dell assorbimento intestinale (58). Al contrario, la carenza di ferro, l anemia e l ipossia inibiscono la sintesi di epcidina per rispondere alle esigenze eritropoietiche. Questa risposta multifattoriale richiede diversi segnali: in carenza di ferro diminuiscono i livelli di BMP6 ed aumentano i livelli shjv che contribuiscono alla repressione di epcidina. 27

28 Introduzione: capitolo 1 Recentemente è stato dimostrato che il GDF15, un membro della famiglia dei TGF-β (Tumor Growth Factor), media la soppressione di epcidina nella talassemia (59). Poiché concentrazioni elevate di GDF sono state osservate nel sangue di pazienti con β-talassemia, è stato ipotizzato che il GDF15 overespresso a causa dell espansione midollare possa contribuire al sovraccarico di ferro inibendo l espressione di epcidina. Nello stesso modo HIF1, un eterodimero la cui espressione è regolata a livello posttraduzionale, può inibire l epcidina in risposta all ipossia. In presenza di ossigeno, HIF1α è modificato da una idrossilasi ferro-dipendente ed è degradato attraverso il pathway mediato dall ubiquitina. In caso di ipossia o chelazione di ferro l attività dell idrossilasi è inibita, HIF1α si accumula e trasloca nel nucleo dove lega il complesso ARNT/HIF1β. L eterodimero HIF1 lega sequenze HRE (Hypoxic Responsive Element) sul promotore dell epcidina e ne riduce l espressione (47) (Figura 11). La rilevanza dell'ipossia sulla regolazione di epcidina è dunque tanta ma non chiara, in particolare non si conosce se HIF regoli la trascrizione di epcidina in modo diretto o indiretto. Figura 11 - Regolazione sistemica dell epcidna. 28

29 Introduzione: capitolo 1 LA FERROPORTINA: IL GENE E LA PROTEINA La ferroportina è l unico esportatore di ferro nei vertebrati fin ora conosciuto. Studi condotti su zebrafish e topi hanno dimostrato che la completa perdita dell esportatore durante lo sviluppo embrionale è letale a causa dell incapacità di trasportare lo ione dalla madre all embrione attraverso la placenta. La presenza della ferroportina è stata rilevata in tutti i tessuti che presentano un maggiore afflusso di ferro, come gli enterociti duodenali dove la ferroportina è responsabile del trasporto di ferro introdotto con la dieta dalla membrana basolaterale al circolo (60,61), i macrofagi dove FPN1 esporta ferro dal citosol al circolo, gli epatociti e la placenta che trasporta ferro dalla madre al feto (62,63,64). Studi su topi aventi un silenziamento selettivo del gene, che lo rende espresso nell interfaccia feto madre, ma lo inattiva negli altri tessuti, hanno osservato lo sviluppo precoce di ferro deplezione nei nuovi nascituri causato dall impossibilità di esportare il ferro intestinale dall enterocita al flusso sanguigno. La ferroportina (FPN1o SLC40) è un esportatore avente 12 domini transmembrana, con entrambe le estremità C ed N terminali poste nel lato citosolico, è presente sulle membrane basolaterali degli enterociti, sulle membrane dei macrofagi e delle cellule non polarizzate (globuli rossi) (Figura 12). Figura 12 Struttura cristallografica della ferroportina. 29

30 Introduzione: capitolo 1 Essa esporta lo ione ferroso (Fe2 + ), il quale dovrà essere ossidato allo stato ferrico da una ferrossidasi, necessaria anche per stabilizzare la ferroportina a livello delle membrane, prima che lo ione esportato si leghi alla transferrina. L importanza della FPN1 è messa in ulteriore evidenza quando la si rapporta all epcidina poiché il trasportatore è il ligando dell ormone epatico. L epcidina si lega alla ferroportina e ne promuove l internalizzazione mediante la fosforilazione degli aminoacidi posti a livello del loop intracellulare dell esportatore. Il complesso FPN1 epcidina viene così internalizzato promuovendo l ubiquitinazione e la degradazione lisosomiale di entrambe le proteine (65,66). Questo meccanismo è sufficiente per spiegare la regolazione dell assorbimento di ferro, poiché gli enterociti deputati al suo assorbimento svolgono la loro funzione soltanto per due giorni prima di staccarsi dall apice dei villi e disperdersi nel lume intestinale. Perciò, il trasporto tramite ferroportina stabilisce se il ferro sia legato alla transferrina o rimosso dall organismo con gli enterociti persi. Quando le riserve di ferro sono adeguate o in eccesso, il fegato produce l epcidina che raggiunge l intestino tenue. Qui, l epcidina si lega alla ferroportina e ne induce la sua internalizzazione, bloccando in questo modo l unica via di trasferimento del ferro dall enterocita al plasma. Quando i livelli di ferro sono bassi, la produzione di epcidina è soppressa e le molecole di ferroportina sono distribuite sulla membrana basolaterale degli enterociti, consentendo il trasporto di ferro verso la transferrina plasmatica (Figura 13). Questo meccanismo di regolazione è importante sia nell epitelio intestinale, sia nei macrofagi del sistema reticoloendoteliale, dove l inattivazione della ferroportina interrompe il rilascio di ferro recuperato dai globuli rossi senescenti. Entrambi gli eventi portano al medesimo risultato: diminuzione di ferro sierico. 30

31 Introduzione: capitolo 1 Figura 13 - Interazione tra epcidina e ferroportina. REGOLAZIONE DELL'ESPRESSIONE DELLA FERROPORTINA Il ferro è un elemento essenziale per la sopravvivenza degli organismi ed è richiesto per l'attività di molecole coinvolte in una serie di eventi fisiologici cruciali come il trasporto dell'ossigeno, la respirazione mitocondriale e la sintesi del DNA. Però a causa delle proprietà pro-ossidanti del ferro, un suo eccesso risulta dannoso per il DNA, i lipidi e le proteine, portando a morte cellulare e disfunzione tissutale. Nei mammiferi non esiste un pathway secretorio del ferro, ma gli organismi regolano le riserve di ferro nel corpo attraverso la regolazione dell'assorbimento intestinale e l'interazione epcidina-ferroportina (67,68,69). L'espressione della ferroportina è regolata a livello post-trascrizionale attraverso il sistema IRE/IRP (60,61) e a livello post-traduzionale o sistemica dall'azione dell'epcidina. L'mRNA di FPN1 ha l'ire (iron responsive element) al 5' UTR e la sua espressione è regolata trascrizionalmente dalle proteine IRP1 e IRP2. Alcuni geni coinvolti nel metabolismo del ferro contengono l'ire al 5' e media la repressione trascrizionale (ferritina e ALAS), mentre altri geni contengono l'ire al 3' UTR e stabilizza l'mrna (TfR1 e DMT1). Il sistema IRE/IRP è regolato dallo stato intracellulare del ferro e in particolare è attivato da carenza di ferro. Dall'attività IRE/IRP le cellule recuperano ferro 31

32 Introduzione: capitolo 1 citosolico attraverso l'azione del TfR e DMT1, contemporaneamente sequestrano ferro attraverso la ferritina e bloccano l'esportazione di ferro attraverso la non sintesi di FPN1. FERROPORTINA ED ERITROPOIESI Un adeguato apporto di ferro è importante per avere un adeguata eritropoiesi, si sa infatti che circa il 70% del ferro presente nell organismo è incluso nel gruppo eme. D altra parte bisogna fare molta attenzione che il ferro non si accumuli negli eritroblasti durante il processo di maturazione, causando una tossicità cellulare con conseguente apoptosi (in questo caso emolisi); per questo motivo è necessario che le cellule della linea eritropoietica siano dotate di un esportatore di ferro quale la FPN1. La scoperta della FPN1 sulla membrana degli eritroblasti è sorprendente in quanto si pensava che queste cellule non avessero bisogno di un ferro esportatore poiché si supponeva che la fuoriuscita cellulare dello ione avvenisse esclusivamente durante il processo di degradazione da parte dei macrofagi. Attualmente si può affermare l esistenza di due isoforme della ferroportina: quella IRE dipendente: FPN1A e quella non IRE: FPN1B. Quest'ultima è altamente espressa nel duodeno dove rappresenta il 25% dell'mrna totale della ferroportina, mentre nel midollo rappresenta il 40% della ferroportina complessiva espressa e meno del 6% negli altri tessuti. Entrambe le isoforme 1A e 1B sono molto espresse negli enterociti e nei precursori eritroidi. La scoperta di FPN1B negli enterociti duodenali spiega il motivo per cui gli enterociti possano continuamente esportare ferro in circolo anche se manca ferro. La presenza di FPN1B nei precursori eritroidi aiuta invece a comprendere il meccanismo di come tali cellule possano sentire i livelli sistemici di ferro e come il differenziamento proceda in sintonia con la quantità di ferro che cambia durante l'eritropoiesi. La quantificazione dei trascritti 1A e 1B rivela che l'isoforma 1B è prevalentemente espressa nella linea eritroide, dove rappresenta 32

33 Introduzione: capitolo 1 oltre il 60% dei livelli di mrna della ferroportina. Al contrario i livelli di trascritto della FPN1B sono dieci volte meno nei macrofagi (il 15% dell'mrna totale della ferroportina). Il promotore di FPN1B è regolato da due fattori trascrizionali, GATA e EKLF, che inoltre sono coinvolti nella regolazione di altri geni eritroidi specifici, inclusi l'emoglobina e il TfR. Ciò suggerisce come l'omeostasi del ferro e la produzione di globuli rossi siano coordinatamente regolati nei precursori eritroidi. Il promotore di FPN1B è espresso in modo specifico nelle cellule duodenali ed eritroidi, mentre il promotore di FPN1A è espresso in modo ubiquitario. I livelli proteici di FPN1 sono maggiori nelle cellule eritroidi e nei macrofagi rispetto alle altre cellule del midollo. Comparando l'espressione di FPN1 con i livelli di proteina si nota come l'mrna di FPN1B correli con i livelli di proteina solo però nelle cellule eritroidi, non nei macrofagi (70,71). La FPN1A è trascritta ad alti livelli al giorno 0 dell eritropoiesi normale ma la proteina FPN1 non incrementa con i livelli di trascritto della FPN1A. Dunque i livelli di proteina FPN1 riflettono i livelli di trascritto FPN1B. La FPN1A contribuisce in modo minore alla produzione di ferroportina, mentre la FPN1B è funzionalmente e traduzionalmente più determinante nel generare la proteina ferroportina. Le due isoforme della FPN1 suscitano molto interesse, uno studio recente ha ipotizzato che la funzionalità dell esportatore, posto sulla membrana degli eritrociti, sia quella di garantire una soppressione parziale dell eritropoiesi qualora i tessuti non eritropoietici rischino lo sviluppo di ferro deplezione. Ciò spiega perché situazioni caratterizzate da carenza di ferro (anemie) sono le maggiori condizioni che preannunciano la manifestazione di ferro deplezione nei mammiferi (72) (Figura 14). 33