Come gli ormoni scatenano una risposta nella cellula bersaglio

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1 Come gli ormoni scatenano una risposta nella cellula bersaglio La capacità delle cellule di ricevere e rispondere a segnali che arrivano dall esterno della membrana plasmatica è un processo fondamentale per la vita. Negli organismi pluricellulari le cellule con funzioni diverse si scambiano un gran numero di informazioni e di segnali. Ogni segnale, che rappresenta un informazione per la cellula, è rilevato da RECETTORI specifici e trasformato in una risposta cellulare attraverso un processo chimico. Questa conversione è chiamata TRASDUZIONE DEL SEGNALE. 1

2 Le vie di trasduzione del segnale seguono percorsi diversi che prevedono : 1. Rilascio del primo messaggero: qualunque tipo di stimolo determina il rilascio di una molecola segnale, denominata primo messaggero. 2. Riconoscimento del primo messaggero: recettore-ligando 3. Trasferimento del messaggio all interno della cellula, tramite il secondo messaggero 4. Attivazione di effettori che alterano direttamente la risposta fisiologica 5. Spegnimento del segnale Le vie di transduzione sono altamente SPECIFICHE ed estremamente sensibili. La SPECIFICITA è determinata dalla COMPLEMENTARIETA ormonerecettore (enzima-substrato). CARATTERISTICHE FONDAMENTALI DEL SISTEMA DI TRASDUZIONE 2

3 Gli ormoni del I gruppo, come gli ormoni steroidei, essendo altamente idrofobici a6raversano la membrana plasma8ca per diffusione semplice e si legano a specifici rece6ori proteici nel nucleo. I rece6ori degli ormoni steroidei agiscono sopprimendo la trascrizione di geni bersaglio. Il legame del rece6ore con l ormone cambia la conformazione del rece6ore rendendolo capace di reagire con specifiche sequenze sul DNA, denominate elemen8 di risposta ormonale (HRE) alterando così l espressione genica. La specificità dell interazione ormone-reccettore è sfruttata dal farmaco tamoxifene, usato per il trattamento del cancro al seno. Il farmaco compete con l estrogeno per il legame al recettore, ma il complesso tamoxifenerecettore non ha alcun effetto sull espressione genica 3

4 ORMONI DEL SECONDO GRUPPO Sono solubili in acqua non possono attraversare la membrana e quindi posseggono tutti recettori che si trovano sulla membrana cellulare. I diversi ormoni differiscono per il tipo di risposta cellulare. Prenderemo in considerazione alcuni sistemi fra i più rappresentativi di trasduzione del segnale, classificati secondo il tipo di recettore. 1. Recettori accoppiati alle proteine G 2. Recettori con attività tirosin chinasica 3. Recettori con attività guanilil ciclasica 4. Canali ionici controllati 5. Recettori di adesione 6. Recettori nucleari 4

5 I recettori accoppiati alle proteine G o GPCR fanno parte di una grande famiglia di recettori localizzati sulla membrana plasmatica con sette eliche transmembrana (recettori a serpentina) Quasi la metà di tutti i farmaci presenti sul mercato hanno come bersaglio un recettore GPCR. Il recettore β-adrenergico, che media i messaggi dell adrenalina, è il bersaglio dei β-bloccanti, prescritti per svariate condizioni patologiche quali ipertensione, aritmie cardiache, ansietà ed emicrania. Il recettore β-adrenergico è il prototipo di tutti i recettori GPCR L ADRENALINA è un ormone secreto dalle ghiandole surrenali dei mammiferi in risposta a fattori di stress che provengono dall esterno o dall interno di un organismo. La sua azione induce una vasta gamma di effetti, a cui ci si riferisce come risposte combatti o fuggi, tra cui l accelerazione del battito cardiaco, dilatazione della muscolatura liscia delle vie respiratorie, demolizione del glicogeno e degli acidi grassi. Il segnale trasmesso dall adrenalina inizia quando l ormone si lega al suo recettore β-adrenergico. Il legame dell adrenalina induce nel recettore una modificazione conformazionale che determina l attivazione di una proteina che si trova sul lato citoplasmatico della membrana : la PROTEINA G STIMOLATORIA o G s. 5

6 Il recettore transmembrana lega il segnale extracellulare (l ormone) e modificata la sua conformazione diventa capace di reagire con una proteina G posta sul lato citosolico della membrana. La proteina G, è costituita da tre subunità: α (che contiene una molecola di GDP), β e γ; quando il recettore cambia la sua conformazione proteica provoca una riduzione di affinità della subunità α per il GDP, che viene sostituito dal GTP. Questo evento porta la proteina G a frantumarsi in una subunità α s (attiva) ed una una β γ. Un singolo complesso ormone-recettore può stimolare lo scambio nucleotidico di molti eterotrimeri di proteina G La subunità α con il GTP legato è ora capace di legare una proteina enzimatica di membrana, l AMPciclasi, rendendola cataliticamente più attiva. L AMPciclasi catalizza la reazione di formazione del camp (AMP ciclico) da ATP Il risultato netto è che il legame dell adrenalina con il recettore sulla superficie cellulare aumenta la velocità di produzione del camp, secondo messaggero ( messaggero cellulare), all interno della cellula. 6

7 Si conoscono ad oggi circa 100 proteine chinasi diverse sia camp dipendenti che camp indipendenti. Sebbene presentino omologie nella sequenza e nella struttura del sito attivo differiscono per quantità di subunità, per la Km per l ATP e per specificità di substrato 7

8 Come viene spento il segnale iniziato dall adrenalina? La durata del periodo in cui le subunità rimangono dissociate e attive dipende dalla subunità α s. Questa subunità ha infatti un attività GTP-idrolitica intrinseca (GTPasica) che dopo un certo intervallo idrolizza il GTP a GDP. Le subunità si riassociano e la proteina G diventa pronta per un altro recettore che la stimoli. In generale, i meccanismi che estinguono un attivazione non sono meno importanti di quelli che l alimentano. 8

9 Nella cascata enzimatica tutti gli enzimi attivati vengono spenti mediante l azione di FOSFATASI1 Un altro meccanismo che pone fine alla risposta scatenata dall adrenalina è quello di rimuovere il secondo messaggero, attraverso l azione idrolitica della 9

10 Anche il recettore attivato, ancora legato all ormone, deve essere riportato allo stato iniziale, per impedire che la proteina G rimanga permanentemente attiva. due modalità: I l ormone si dissocia dal recettore, ma questo dipende dalla concentrazione dell ormone nel plasma. II il complesso ormonerecettore può essere disattivato da una fosforilazione da parte di una chinasi. La chinasi del recettore β-adrenergico fosforila la coda carbossi-terminale del complesso ormone-recettore, ma non quella del recettore libero. Infine una molecola di β-arrestina si lega al recettore fosforilato, diminuendo la sua capacità di attivare le proteine G. Questo segnale diminuisce l intensità della risposta anche quando il segnale persiste nel tempo. Le proteine GPRC agiscono sull adenilato ciclasi e la loro azione può essere sia attivatoria che inibitoria. Due sistemi in parallelo attivatorio e inibitorio comprendono un recettore R s o R i ed un complesso regolatorio G s e G i Le proteine G differiscono nella subunità α s e α i 10

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12 Una seconda classe di GPCR molto numerosa comprende recettori che attraverso una proteina G sono accoppiati ad una FOSFOLIPASI C (PLC) di membrana, enzima specifico per il fosfolipide di membrana Fosfatidilinositolo 4,5 bis fosfato (PIP 2 ) Quando l ormone si lega al suo specifico recettore di membrana abbiamo. 1. Il complesso ormone-recettore determina lo scambio GDP-GTP di una proteina G (Gq) attivandola 2. La Gq attivata, attiva a sua volta la PLC specifica per il PIP 2 3. La PLC catalizza la scissione del PIP 2 con la formazione di due messaggeri cellulari: l inositolo 1,4,5 trifosfato (IP 3 ) e diacilglicerolo. 5. L inositolo diffonde nel citosol si lega ed apre un canale per il Ca 2+ sul RE dove lo ione si era accumulato ad opera di trasportatori come la Ca 2+ ATPasi. 6. Calcio e diacilglicerolo (DAG) vanno ad attivare una proteina chinasi C (PKC) sulla membrana plasmatica. animazione 12

13 1. La concentrazione di calcio nella cellula è mantenuta a livelli molto bassi per evitare la precipitazione di composti fosforilati o carbossilati, che formano sali di calcio poco solubili. 2. La concentrazione plasmatica del calcio si mantiene molto bassa, intorno a 100 nm, ne deriva che piccole variazioni di concentrazione possono essere prontamente avvertite. 3. Il calcio può fare da sei a otto legami di coordinazione con l ossigeno di gruppi carbossilici di proteine determinando la formazione di legami crociati tra diversi gruppi di una stessa proteina con il risultato di una consistente modificazione strutturale. 4. La Calmodulina è una proteina ubiquitaria che fa da sensore per il calcio in quasi tutte le cellule eucariotiche. La calmodulina è una piccola proteina con quattro siti di legame per il calcio. A concentrazioni citosoliche di 500 nm, il Ca 2+ si lega alla proteina attivandola. La calmodulina ha un motivo strutturale noto come mano EF (EF-hand) che lega lo ione calcio. Sette atomi di ossigeno si coordinano con ciascun calcio nelle 4 subunità mano EF che costituiscono la calmodulina. Il complesso calcio-calmodulina stimola diversi enzimi, pompe e altre proteine bersagli,,inducendo modificazioni conformazionali. La calmodulina è, per esempio, regolatrice della chinasi b muscolare. Il calcio innesca la contrazione muscolare e nello stesso tempo attraverso la calmodulina attiva la demolizione del glicogeno per fornire energia al muscolo che deve contrarsi. 13

14 Alcuni segnali che agiscono attraverso la fosfolipasi C, l IP3 e il Calcio Acetilclina Agonisti α adrenergici Angiotensina II ossitocina Serotonina Vasopressina Istamina Ormone che rilascia le gonadotropine (GRH) Ormone che rilascia la tireotropina (TRH) Fattore di crescita derivato dalle piastrine Peptide che rilascia la gastrina auxina L azione di alcuni composti chiamati promotori tumorali è da attribuirsi ai loro effetti sul PKC. Essi legano l enzima come il diacilglicerolo ma diversamente da questo secondo messaggero naturale non sono prontamente rimossi dal metabolismo cellulare. La proteina PKC rimanendo costantemente attiva interferisce con i normali processi della crescita e della divisione cellulare. 14

15 Questa classe di recettori possiede una attività chinasica intrinseca e trasduce il segnale extracellulare con un meccanismo molto diverso dalle GPCR. Questi recettori hanno u n d o m i n i o extracellulare che lega il segnale ed un sito attivo enzimatico nella parte citosolica, i due d o m i n i s o n o interconnessi da un s e g m e n t o intramembrana. In questo tipo di regolazione abbiamo che: 1. L attività tirosinchinasica è attivata da ligando 2. Le chinasi coinvolte fosforilano soltanto residui di tirosina 3. L interazione ligandorecettore, fosforilando le tirosine, da inizio ad una cascata che può coinvolgere diverse tirosin-chinasi 15

16 Un esempio di questa via di trasduzione del segnale inizia con l INSULINA ormone che viene rilasciato dal pancreas in risposta ad un aumentato livello di glucosio nel sangue. Sintetizzato come unico polipeptide viene poi glicosilato e scisso nelle subunità α e β che si assemblano in un tetramero unito da ponti disolfuro. Il dominio citosolico delle subunità β è una tirosinchinasi Le due catene α si avvicinano le une alle altre per formare il sito di legame per un unica molecola di insulina. Ciascuna catena β è invece una proteina chinasi che catalizza il trasferimento di un gruppo fosforico dall ATP al gruppo idrossilico di tre tirosine vicine all estremità carbossiterminale della stessa catena β. Questa autofosforilazione apre un sito attivo che permette la fosforilazione di altri residui di tirosina di altre proteina bersaglio. La stimolazione del recettore dell insulina da inizio ad una cascata di reazioni di fosforilazione di proteina Attraverso questa cascata di attivazioni chinasiche vengono regolate sia l attività di enzimi del metabolismo che l espressione genica. 16

17 2. Il recettore dell insulina (INS-R) attivato fosforila attivando il substrato 1 dell insulina (IRS-1) 3. IRS-1 attivato diventa il punto focale per la formazione di un complesso proteico. L IRS-1 si lega alla proteina Gbr-2 la cui funzione è quella di avvicinare l IRS-1 alla proteina Sos. L Sos agisce da fattore di scambio di nucleotidi per cui la proteina Ras (piccola proteina G) che conteneva GDP ora contiene GTP. 4. Nella forma GTP attiva la proteina Ras attiva una proteina Chinasi Raf-1. La Raf-1 attiva fosforila un altra chinasi MEK che a sua volta fosforila una proteina chinasi ERK 17

18 La ERK (chinasi regolate da segnali extracellulari) attivata media alcuni effetti biologici dell insulina entrando nel nucleo e fosforilando dei fattori di transizione che modulano la trascrizione genica. La ERK fa parte di una grande famiglia di chinasi chiamate MAPK (proteine chinasi attivate da mitogeni: segnali extracellulari che inducono la mitosi e la divisione cellulare) MEK appartiene invece alle MAPKK Questa via di segnalazione mediata da Ras determina : l aumento di sintesi proteica che favorisce la crescita e il differenziamento cellulare; risposta coerente con le funzione dell insulina come segnale di riserve energetiche abbondanti La cascata enzimatica sia dell insulina determina un amplificazione del segnale ormonale. 18

19 Come per le proteine G anche la proteina Ras ha un attività GTPasica intrinseca che determina lo spegnimento del segnale. In questo caso però essendo l attività troppo lenta la Ras è aiutata nella sua funzione idrolitica da una proteina GAP. La via di segnalazione dell insulina si biforca al livello dell IRS-1, infatti questa proteina può prendere contatto con un altro enzima: FOSFOINOSITOLO 3-CHINASI. Questo enzima fosforila il fosfatidilinositolo 4,5- bisfosfato (PIP 2 ) che diventa fosfatidilinositolo 3,4,5- trifosfato (PIP 3 ). A sua volta il PIP 3 formato attiva una proteina chinasi, la PDK1. 19

20 La PDK1 catalizza la fosforilazione, ATP dipendente, di una proteina chinasi B (PKB), nota anche come Ark, che diffonde nella cellula andando a fosforilare bersagli proteici come i componenti che stimolano la traslocazione delle vescicole contenenti GLUT4 alla membrana plasmatica, aumentando l assorbimento del glucosio nel sangue e nello stesso tempo attiva enzimi che stimolano la sintesi del glicogeno. Anche in questo caso la cascata enzimatica ha inizio quando l insulina si lega al recettore. Il segnale viene amplificato a diversi livelli della cascata. 20

21 In alcuni tessuti come il muscolo l insulina promuove il reclutamento dei TRASPORTATORI DI GLUCOSIO INSULINO SENSIBILI (GLUT4) L insulina legata al suo recettore è internalizzata. Una volta nella cellula l insulina è degradata per l azione di enzimi lisosomiali. Anche i recettori possono venir degradati ma per la maggior parte vanno a ripopolare la membrana cellulare. Un livello elevato di insulina promuove la degradazione dei recettori, facendone diminuire il numero sulla superficie della membrana cellulare. 21

22 animazione Regolazione dell espressione genica Le cellule di un organismo pluricellulare sono diverse l une dalle altre pur avendo lo stesso patrimonio genetico perché sintetizzano e accumulano diversi RNA e proteine. Oggi sappiamo che il differenziamento cellulare dipende generalmente da cambiamenti nell espressione genica. Una cellula può modificare l espressione dei suoi geni in risposta a segnali esterni. 22

23 Regolazione dell espressione genica L espressione genica può essere controllata in diversi momenti durante il passaggio dalla trascrizione dell RNA alla sintesi della proteina. Solo il controllo della trascrizione garantisce che non avvenga la sintesi di intermedi inutili. Analisi genetiche sui batteri ( adattamento di E.coli al mezzo di coltura) svolte negli anni 50 hanno fornito le prime prove dell esistenza di proteine regolatrici dei geni chiamate fattori di trascrizione, che accendono e spengono serie specifiche di geni. Regolazione dell espressione genica Per distinguere, a livello del DNA, i componenti del circuito regolatorio dai geni che essi regolano, si usano i termini geni regolatori e geni strutturali. Un gene strutturale è un qualsiasi gene che codifica per proteine strutturali, enzimi, etc. Un gene regolatore è un gene che codifica per una proteina o un RNA in grado di r e g o l a r e l espressione genica attraverso il legame con particolari siti del DNA (per esempio promotori). 23

24 Regolazione dell espressione genica Nei batteri, il modo classico di controllare l espressione genica è la regolazione negativa. Una proteina repressore impedisce che il gene venga espresso. Gli elementi a monte del gene strutturale sono: il promotore e l operatore che è la sequenza riconosciuta e legata dal repressore. La capacità del gene strutturale di essere trascritto sta nel riconoscimento da parte della polimerasi del suo promotore. La presenza del repressore, legato all operatore, non permette all RNA polimerasi di iniziare la trascrizione e il gene è quindi spento fino a che non arriva un fattore esterno ad attivarlo. Regolazione dell espressione genica Un modo alternativo di controllare l espressione genica è la regolazione positiva. Questo sistema è utilizzato nei procarioti con la stessa frequenza della regolazione negativa, mentre negli eucarioti è la via preferenziale. I geni controllati dalla regolazione positiva sono sempre attivi. Poiché il repressore non riesce a legare l operone, l RNA polimerasi può legare il p r o m o t o r e e trascrivere i geni strutturali. I geni sono sempre trascritti fino a che un intervento esterno non modifica il repressore inattivo attivandolo. 24

25 Regolazione dell espressione genica Molti sono i fattori, chiamati fattori di trascrizione, che si legano a siti vicini al promotore, permettendo all RNA pol di iniziare la trascrizione. Regolazione dell espressione genica Al contrario degli eucarioti, i geni dei procarioti sono spesso organizzati in gruppi (cluster) che includono geni con funzioni correlate (geni codificanti per enzimi della stessa via metabolica). L unità comprendente i geni strutturali e gli elementi che controllano la loro espressione (promotore, operone, gene regolatore) è chiamata operone, il cui cluster è trascritto come un unico RNA policistronico a partire da un unico promotore regolato. L operone lac contiene i geni codificanti gli enzimi necessari per metabolizzare i β-galattosidi come il lattosio. 25

26 Regolazione dell espressione genica I geni lac sono controllati da una regolazione negativa. Il repressore lac è il prodotto del gene laci. Il prodotto di questo gene (proteina) si lega ad un operatore (Olac) che si trova fra il promotore e I geni lac. Il legame del repressore all operatore impedisce all RNA pol di iniziare la trascrizione. Il repressore laci è un tetramero proteico costituito da subunità identiche. Ne esistono una decina di copie in una cellula batterica ed è trascritto come RNA monocistronico, con un suo promotore che ha un affinità normale con l RNA pol. Regolazione dell espressione genica I geni lac rappresentano un esempio di sistema inducibile, presenti nei batteri. Questi sistemi permettono alla cellula di reagire ai cambiamenti dell ambiente e alle fluttuazioni dei nutrienti. Nel caso del sistema lac, non c è necessità di sintetizzare enzimi che degradano il lattosio in assenza di substrato, ma non vengono sintetizzati. In questo caso quindi il lattosio è l induttore. 26

27 Regolazione dell espressione genica La β-galattosidasi idrolizza il legame del lattosio a galattosio e glucosio La permeasi è necessaria per il trasporto di lattosio La tiogalattoside transacetilasi sembra avere un ruolo di detossificazione di composti che possono essere trasportati dalla permeasi Regolazione dell espressione genica L induttore del sistema lac è una piccola molecola simile al lattato, l isopropiltiogalattoside (IPTG). L IPTG non si lega all enzima o al promotore per indurre la trascrizione, ma al repressore lac I. L induttore IPTG agisce cambiando la conformazione del repressore in modo che non si possa più legare all operatore. 27

28 Regolazione dell espressione genica CH 3 S C H H CH 3 isotiogalattoside Regolazione dell espressione genica Quando I batteri possono scegliere fra differenti sorgenti di carbonio, preferiscono utilizzare il glucosio che altri zuccheri. In questa situazione, il glucosio reprime l espressione degli enzimi capaci di metabolizzare altri zuccheri (repressione da glucosio). Uno dei metodi che ha il glucosio per reprimere altri operoni è l esclusione dell induttore. Il fattore chiave è il PTS, che trasporta gli zuccheri nella cellula. Una componente di questo fattore, in seguito al trasporto del glucosio, viene modificata, si lega alla lac permeasi bloccando il trasporto di lattosio. 28

29 Regolazione dell espressione genica I principi generali che governano l espressione genica nei procarioti si applica anche ai geni degli eucarioti. L espressione di geni specifici può essere attivamente inibita o stimolata mediante gli effetti indotti da proteine che si legano al DNA attivando o inibendo la trascrizione di determinati geni. 29