LA CITOGENETICA ZOOTECNICA

Dimensione: px

Iniziare la visualizzazioe della pagina:

Download "LA CITOGENETICA ZOOTECNICA"

Livio Donati
7 anni fa
Visualizzazioni

1 LA CITOGENETICA ZOOTECNICA

2 E una scienza ibrida tra la Genetica e la Citologia che studia i cromosomi da diversi punti di vista: clinico: anomalie numeriche e strutturali, non sempre legate a particolari fenotipi; evolutivo: relazioni citotassonomiche tra specie affini; molecolare: mappe genetiche fisiche (localizzazione dei geni sui cromosomi).

3 I CROMOSOMI

4 Il materiale genetico è organizzato in strutture filiformi chiamate cromosomi composti dalla cromatina, un complesso di DNA, RNA e proteine. Sono facilmente visibili durante la mitosi. Il cromosoma replicato è costituito da due cromatidi fratelli uniti da un centromero. Le estremità dei cromosomi sono chiamate telomeri.

5 In base alla posizione del centromero sono classificati: a. metacentrici b. submetacentrici c.acrocentrici d. telocentrici Per convenzione il braccio corto è detto braccio p ed è al di sopra del centromero, mentre il braccio lungo è detto braccio q ed è al di sotto del centromero. centromero telomeri braccio q braccio p cromatidi fratelli

6 SPECIE Numero cromosomi (2n) Suino e gatto 38 Uomo 46 Bufalo di palude 48 Bufalo di fiume 50 Pecora 54 Bovino e capra 60 Asino 62 Cavallo 64 Cane 78

7 ISOLAMENTO DEI CROMOSOMI

8 1) COLTURE CELLULARI I cromosomi possono essere isolati da colture di cellule che crescono, in terreni nutritivi completi, in sospensione (linfociti) o su strato (fibroblasti). Nel caso delle colture linfocitarie è necessario l impiego di sostanze mitogene (pokeweed, fitoemoagglutinina, concavalina A) che stimolano la moltiplicazione cellulare, che invece avviene normalmente per i fibroblasti.

9 La coltura dei linfociti (0.7 1 ml di sangue periferico in 10 ml di terreno nutritivo) necessita di pochi giorni (in genere 3 giorni). La coltura dei fibroblasti richiede alcune settimane ma ha il vantaggio di poter essere portata avanti per mesi e le cellule possono essere congelate (a 70 C per mesi, in azoto liquido per anni) e riutilizzate al momento desiderato.

10 2) COLCHICINA Al terzo giorno di coltura si aggiunge la colchicina ad opportune dosi in relazione alla specie ed alla tecnica colturale, per un tempo variabile dai 30 ai 60 minuti. La colchicina ha la proprietà di bloccare il ciclo cellulare impedendo il disfacimento delle fibre del fuso mitotico, per cui la cellula resta in metafase.

11 3) TRATTAMENTO IPOTONICO Segue un trattamento con soluzione ipotonica (0.5% KCl) per minuti al fine di aumentare il volume delle cellule e quindi di distanziare quanto più è possibile i cromosomi che si trovano nella piastra equatoriale attaccati al fuso.

4) FISSAZIONE Le cellule sono sottoposte a fissazione in metanolo/acido acetico 1:3 per n volte consecutive fino a quando il supernatante non diventa chiaro (al termine di ogni trattamento la

12 4) FISSAZIONE Le cellule sono sottoposte a fissazione in metanolo/acido acetico 1:3 per n volte consecutive fino a quando il supernatante non diventa chiaro (al termine di ogni trattamento la sospensione cellulare è sottoposta a centrifugazione al fine di eliminare il supernatante e predisporla al trattamento successivo). Alla fine, eliminato il supernatante, si otterrà una sospensione opalescente (circa 1 ml).

13 5) ALLESTIMENTO DEI VETRINI Una goccia di sospensione è fatta cadere, su un vetrino precedentemente sgrassato, freddo e bagnato, inclinato di 45 ; in tal modo i nuclei in metafase si rompono ed i cromosomi si fissano sul vetrino, successivamente asciugato all aria. I nuclei in interfase saranno visibili come grossi corpi sferici. I preparati cromosomici, così ottenuti, possono essere colorati o trattati con varie tecniche.

14 Piastre metafasiche con nuclei in interfase

15 Piastra metafasica di bovino 2n= 60, XX, acquisita in contrasto di fase, 100x

16 Y X Piastra metafasica di bovino 2n = 60, XY; GIEMSA

17 X X Piastra metafasica di bovino 2n = 60, XX; Arancio d acridina

18 IL BANDEGGIO CROMOSOMICO

19 E una tecnica per la colorazione differenziale dei cromosomi, che produce un caratteristico pattern di bande o la colorazione selettiva di specifiche regioni (quali i centromeri, le regioni dell organizzazione nucleolare o le regioni ricche in AT e GC).

20 N.B. : Ogni qualvolta si ha una colorazione positiva (banda) per una qualsivoglia tecnica, significa che il DNA, in quelle particolari regioni, è nativo = non denaturato e/o senza incorporazione di analoghi di base.

Le bande R corrispondono alle regioni eucromatiche ossia le regioni cromosomiche contenenti la maggior parte dei geni strutturali, ricche in basi G-C, che replicano precocemente nella fase S1 e che

21 Le bande R corrispondono alle regioni eucromatiche ossia le regioni cromosomiche contenenti la maggior parte dei geni strutturali, ricche in basi G-C, che replicano precocemente nella fase S1 e che sono relativamente decondensate durante l interfase. Le bande G e Q colorano, invece, le regioni eterocromatiche cioè le regioni cromosomiche, ricche in basi A-T, che replicano tardivamente nella fase S2 e che si mostrano fortemente condensate in interfase.

22 Piastra metafasica di pecora 2n = 54, XX; tecnica RBA

23 Piastra metafasica di bufalo 2n = 50, XX; tecnica RBA

24 IDEOGRAMMI braccio p centromero bande positive G (sx) ed R (dx) bande negative G (sx) ed R (dx) braccio q

25 Le bande C colorano solo l eterocromatina costitutiva (HC) che corrisponde a quella parte di eterocromatina altamente condensata, con sequenze di DNA altamente ripetitive, a replicazione tardiva e localizzata, per la maggior parte, presso i centromeri dei cromosomi.

26 X X Piastra metafasica di bufalo 2n = 50, XX; tecnica CBA

27 X X Piastra metafasica di pecora 2n = 54, XX; tecnica CBA

28 X X Piastra metafasica di cavallo 2n=64, XX, tecnica CBA

29 X Y Piastra metafasica di cavallo 2n=64, XY, tecnica CBA

30 IL CARIOTIPO

Consiste nel disporre, per coppie omologhe, i cromosomi metafasici ottenuti da una singola cellula, ordinati per: lunghezza (dai più grandi ai più piccoli) forma (metacentrici,

31 Consiste nel disporre, per coppie omologhe, i cromosomi metafasici ottenuti da una singola cellula, ordinati per: lunghezza (dai più grandi ai più piccoli) forma (metacentrici, submetacentrici,acrocentrici, telocentrici) bandeggio (alternanza di zone colorate e non) Il numero diploide (2n) è tipico per ogni specie per cui il numero delle coppie cromosomiche sarà numerato da 1 a N, inclusi i due cromosomi sessuali che, al posto del numero, saranno indicati con XX (femmina) oppure XY (maschio).

32 Cariotipo di capra (Capra Hircus) 2n=60, XY, tecnica RBG

33 APPLICAZIONI DELLA CITOGENETICA ZOOTECNICA Clinica: diagnosi mutazioni cromosomiche (numeriche e strutturali) causa di sindromi o malattie genetiche. Mutagenesi ambientale: biomonitoraggio delle popolazioni animali

34 FREE-MARTIN O MOSAICISMO ERITROCITARIO (XX/XY) Il Free-Martin o mosaicismo eritrocitario (XX/XY) è un esempio di intersesso che si verifica soprattutto nella specie bovina (raramente nelle specie ovina e suina), nel 92% delle gravidanze gemellari quando i due feti gemelli sono di sesso opposto. I maschi sono generalmente normali e fertili mentre le femmine sono sterili. Fenotipicamente presentano i genitali esterni, ma in genere l utero non è sviluppato e le ovaie possono presentare contemporaneamente tessuto ovarico e testicolare.

35 Negli stadi iniziali dello sviluppo si verifica una fusione delle membrane fetali, con conseguente anastomosi dei vasi placentari, in tal modo si verifica uno scambio degli ormoni prodotti nei due feti di sesso diverso e dei linfociti e delle altre cellule del sangue. Gli ormoni maschili sono secreti dal testicolo del vitello prima che l ovaio della gemella sia completamente sviluppato e impediscono il normale accrescimento sia dell ovaio che delle vie genitali.

44 Due piastre metafasiche di una manza di razza Agerolese, 2n = 60, XX/2n=60, XY, Free-martin

LA TRASLOCAZIONE ROBERTSONIANA Definita anche fusione centrica, è l aberrazione cromosomica più studiata e diffusa (nei bovini è presente soprattutto nelle razze da carne).

45 LA TRASLOCAZIONE ROBERTSONIANA Definita anche fusione centrica, è l aberrazione cromosomica più studiata e diffusa (nei bovini è presente soprattutto nelle razze da carne). Consiste nella fusione di due cromosomi acrocentrici ai centromeri con la conseguente formazione di un cromosoma metacentrico o submetacentrico e di un piccolo elemento eterocromatico che presumibilmente si perde nelle susseguenti divisioni.

46 TRASLOCAZIONE ROBERTSONIANA Rottura e fusione + + Frammenti perduti Cromosomi acrocentrici non omologhi Cromosoma traslocato

47 Questo tipo di aberrazione cromosomica fu scoperta da Gustavsson nel 1964, nel corso di un indagine cariologica condotta su 2045 animali appartenenti alle razze: Bianca e Rossa Svedese (SRB) e Frisona Svedese (SLB). Furono evidenziati tre diversi assetti cromosomici: 2n = 60, 2n = 59 (portatori eterozigoti) e 2n = 58 (portatori omozigoti). Affinate le tecniche di bandeggio fu scoperto che i cromosomi coinvolti nella fusione centrica erano l 1 ed il 29.

Nei portatori eterozigoti della traslocazione Robertsoniana, teoricamente, si ha la formazione di gameti normali o bilanciati e, attraverso la non disgiunzione meiotica, alla formazione di gameti

48 Nei portatori eterozigoti della traslocazione Robertsoniana, teoricamente, si ha la formazione di gameti normali o bilanciati e, attraverso la non disgiunzione meiotica, alla formazione di gameti aneuploidi. Nei gameti bilanciati si conta un corredo cromosomico aploide 2n=59, ma il numero fondamentale (numero di braccia) resta quello del cariotipo normale aploide (l informazione genetica è totalmente trasmessa, ad eccezione del corredo cromomerico).

49 Nei gameti aneuploidi, formatisi attraverso una segregazione non disgiuntiva, si ha una perdita di informazione genetica o la presenza di cromosomi in più. La partecipazione di gameti aneuploidi alla fecondazione porta alla formazione di zigoti monosomici o trisomici che muoiono durante la gestazione (corredo cromosomico incompatibile con la vita).

50 Pertanto, individui eterozigoti per una traslocazione Robertsoniana presentano una riduzione di fertilità, percentuali di aborto superiore alla media ed un certo numero di progenie aneuploide con anormalità congenite.

51 Y rob(1;29) X Piastra metafasica di bovino di razza Agerolese 2n = 60, XY; rob (1;29)

Documenti analoghi

Citogenetica. 1. classificazione dei cromosomi 2. mutazioni cromosomiche 3. mappe cromosomiche. Genomica. Paolo Edomi - Genetica

Citogenetica. 1. classificazione dei cromosomi 2. mutazioni cromosomiche 3. mappe cromosomiche. Genomica. Paolo Edomi - Genetica Citogenetica 1. classificazione dei cromosomi 2. mutazioni cromosomiche 3. mappe cromosomiche Genomica Indagine citogenetiche La citogenetica studia la morfologia e le caratteristiche genetiche dei cromosomi