La comunicazione cellulare nel sistema nervoso

Transcript

1 FISIOLOGIA CELLULARE A.A Parte III La comunicazione cellulare nel sistema nervoso sezione B: la plasticità sinaptica

2 Comunicazione in cellule nervose - Abitudine o Assuefazione Lumaca di mare Aplysia punctata: la branchia é presente sotto il mantello protettivo. Quando il sifone viene toccato, la branchia si retrae sotto il mantello (risposta riflessa). Retrazione della branchia in seguito a una decina di stimolazioni del sifone ripetute a intervalli regolari di sec: la risposta riflessa si indebolisce gradualmente fino a scomparire del tutto: l animale ignora così stimoli abitudinari e di scarso significato: ABITUDINE o ASSUEFAZIONE A livello presinaptico si instaura una duratura modificazione dei canali del Ca 2+ che li rende più inattivabili a livello postsinaptico si originano EPSP sempre più piccoli e inefficaci: conservazione mnemonica dell evento sinaptico 1 2 Na + Neurone sensitivo RISPOSTA NORMALE Ca 2+ K + 1 EPSP NORMALE 2 motoneurone Retrazione normale Retrazione dopo abitudine DOPO ABITUDINE

3 i Riflessi: SENSITIZZAZIONE Viene imposto uno stimolo di allerta sulla coda a cui si fa seguire una stimolazione tattile del sifone che produce una contrazione della branchia più intensa del normale neurone internuciale serotoninergico neurone sensitivo coda sinapsi asso/assonica serotononergica facilitante NMDA neurone sensitivo motoneurone La serotonina del neurone facilitatore porta ad un aumento nella secrezione di glutammato simolante il motoneurone: Conservazione mnemonica di un evento sinaptico

4 SENSITIZZAZIONE A BREVE TERMINE 5-HT rilasciata dai neuroni internuciali facilitatori si lega a 2 recettori del neurone sensoriale accoppiati a AC e a PLC provocando l attivazione di PKA e PKC. Gli effetti combinati di PKA e PKC portano all aumento del rilascio del neurotrasmettitore fosforilazione di canali del Ca 2+ prolungandone l apertura e la depolarizzazione provocata dal potenziale d azione fosforilazione di canali del K+ voltaggio-dipendenti impedendone l apertura e prolungando la depolarizzazione provocata dal potenziale d azione

5 Abitudine e sensitizzazione a lungo termine Abit. e Sensit. sono conservati normalmente per parecchie ore e poi si estinguono memoria a breve termine. In seguito a periodi di stimolazione ripetuti sistematicamente (anche per alcuni giorni) la loro conservazione può durare per mesi memoria a lungo termine. NORMALE ABITUDINE A BREVE TERMINE ABITUDINE A LUNGO TERMINE K + K + K + Na + Ca 2+ zona attiva varicosità Na + Ca 2+ Na + Ca 2+ 5HT SENSITIZZAZIONE A BREVE TERMINE 5HT SENSITIZZAZIONE A LUNGO TERMINE 5HT K + K + K + Ca 2+ Ca 2+ Ca 2+

6 SCHEMA SEMPLIFICATO DI SENSITIZZAZIONE A LUNGO TERMINE PKA porta a fosforilazione persistente di CREB1 e all attivazione di MAPK, che blocca il repressore CREB2. Cò porta alla sintesi di almeno 10 proteine; 3 di queste sono ApTBL, ApCAM e ApUch. ApTBL attiva forme latenti di TGFβ, che porta all attivazione acuta di MAPK. MAPK regola il rilascio di neurotrasmettitore e controlla CREB2. ApUch degrada i monomeri regolatori della PKA aumentando la PKA attiva e la fosforilazione di CREB1. ApCAM, è downregolata e tale deregolazione porta alla regolazione di processi associati alla sensitizazione a lungo termine

7 La comunicazione in cellule nervose: plasticità Modificazioni delle Zone Attive e delle Varicosita Implicano una PLASTICITA SINAPTICA 1. La memoria a lungo termine non si instaura se si blocca la sintesi proteica 2. In Aplysia l inibizione della sintesi proteica blocca la memoria a lungo termine solo se avviene durante il trattamento con serotonina 3. Nella sensibilizzazione a lungo termine i neuroni sensoriali aumentano anche il numero dei prolungamenti terminali NORMALE A LUNGO TERMINE

8 i principali collegamenti eccitori sono:corteccia entorinale fascio perforante giro dentato fibre muscoidi (mossy) CA3 collaterali di Schaffer (e una grossa connessione verso la fimbria fino all ippocampo contralaterale) CA1 subicolo corteccia entorinale

9 Potenziamento a breve termine o post. tetanico Grande ingresso di Ca 2+ e saturazione dei vari sistemi tampone (ER, mitocondri..) Il temporaneo eccesso di Ca 2+ è chiamato Ca 2+ residuale La concentrazione di Ca 2+ libero determina il quantitativo di neurotrasmettitore rilasciato

10 La plasticità sinaptica: Potenziamento a Lungo Termine (LTP) Nei mammiferi, l ippocampo ha un ruolo importante nell apprendimento: se distrutto bilateralmente, si perde in buona parte la capacità di formare nuova memoria Specificità dell LTP: viene indotto solo nella via sinaptica 1 e non interessa l altra via sinaptica vicina In alcune sinapsi dell ippocampo mentre singoli P.d A. non lasciano tracce durevoli, una breve e ripetitiva scarica di P.d A. causa LTP: i successivi singoli P.d A. nella presinapsi evocano, nella cellula postsinaptica, EPSP molto maggiori 1973: nell ippocampo di coniglio (area C4 della fascia dentata) si originano potenziali lenti postsinaptici in seguito a stimolazione delle fibre afferenti a questa regione Graduale aumento in ampiezza dei potenziali lenti (INDUZIONE) che si mantengono anche dopo, in seguito a stimolazioni singole Questo effetto rimane per ore, o anche per giorni: STABILIZZAZIONE dell LTP

11 A cosa è dovuto il LTP? 1 attivazione di NMDA-R perchè LTP è bloccato dal 2- amino-5-phosphovalerato (APV), bloccante di NMDA 2 LTP dipende dalla frequenza degli stimoli: devono cioè essere rispettati i tempi e la sequenza dei 2 meccanismi (elettrico e chimico) alla base della attivazione di NMDAR Na + GLU Na + Ca 2+ 2 evento chimico Espulsione del Mg 2+ Mg AMPA 1 evento elettrico: Leggera depolarizzazione NMDA Na + Ca l induzione di LTP causa un aumento del rilascio di neurotrasmettitore ESISTENZA DI UN MESSAGGERO RETROGRADO? L NO-sintetasi è localizzata postsinapticamente presinapsi dell ippocampo: guanilato ciclasi sensibile all NO NO aumenta il rilascio di neurotrasmettitore nell ippocampo Inibizione dell NO-sintetasi postsinaptica bloccano l LTP

12 PKG aumenta l esocitosi di GLU e ne diminuisce l uptake GTP cgmp PKG Guanilato ciclasi + GLU - Na + Ca 2+ GLU Na + PLC InsP3 Gq Ca 2+ mglu1 Ca 2+ Na + Calcineurina NMDA P nnos PKA PKC AMPA NO CaM nnos L-arginina L-citrullina

13 i Recettori Metabotropici Modulano la Trasmissione Glutamatergica Inibizione del rilascio di Glu: mglu2 e 3 inibiscono i canali del calcio e la sintesi di camp Aumento del rilascio del Glu: mglu1 inibisce i canali del K +. Questa facilitazione è aumentata dall AA (retrodiffusione del messaggero) Ca 2+ chiusura: depolarizzazione e maggiore eccitabilità mglu2 Gi AC Gi mglu3 Ca 2+ GLU K + + PKC DAG K + PLC Gq mglu1 Gi mglu2 AC Gi mglu3 AMPA Na + NMDA Arachidonato Ca 2+ cpla 2 PKC PLC mglu1 Gq chiusura: depolarizzazione e maggiore frequenza dei PA

14 Un altra forma di plasticità sinaptica: Depressione sinaptica a Lungo Termine ( LTD ) Nell ippocampo, la stimolazione a bassa frequenza (1 impulso al secondo) delle collaterali di Schaffer induce una depressione prolungata della trasmissione sinaptica

15 Induzione della LTD tra fibre parallele e cellule del Purkinje del cervelletto NO sgc cgmp NCX Ca 2+ PKG nnos Ca 2+ NMDAR AMPAR Na + GLU NMDAR Ca 2+ Induzione di LTD Terminale delle fibre parallele DAG PKC mglur Gq PLCβ IP3 Ca 2+ Dendrite della cellula di Purkinje

16 LIVELLI di Ca 2+ in LTD e LTP Stimolazioni di bassa frequenza (1 impulso/sec) producono piccoli aumenti di Ca 2+, mentre stimolazioni ad alta frequenza evocano più alti aumenti di Ca 2+ LTD richiede stimolazioni di bassa frequenza mentre LTP richiede stimolazioni ad alta frequenza ATTIVITà ENZIMATICA CamKII fosfatasi i differenti effetti del Ca 2+ durante LTP e LTD potrebbero dipendere dall attivazione selettiva di proteinfosfatasi e protein chinasi da parte di bassi e alti livelli di questo ione

17 MODIFICAZIONI STRUTTURALI ASSOCIATE all LTP nell ippocampo il numero e le dimensioni dei contatti sinaptici aumentano durante l LTP, un fatto che porta a ritenere che alcune delle proteine neo-sintetizzate possano contribuire alla formazione di nuovi contatti sinaptici il LTP comporta la formazione di nuove sinapsi attraverso un processo di duplicazione di una sinapsi esistente (processo di perforazione)

18 stabilizzazione dell LTP e dell LTD ERK agisce come un punto di convergenza di diverse cascate enzimatiche di trasduzione LTP e LTD non sono solo un evento post-sinaptico ma inducono PLASTICITÀ SINAPTICA LTP e LTD richiedono la sintesi di proteine dendritiche: la sintesi di nuove proteine mantiene le variazioni sinaptiche a prescindere dalla polarità. ERK L aumento di Ca 2+ attiva vie trasduzionali con successiva modulazione genica e sintesi di proteine fondamentali per i cambi ultrastrutturali e funzionali alla base della stabilizzazione (proteine dette PRP: plasticity-related proteins)

19 Proteine regolate dalla CaM CaM media l attivazione di molti enzimi necessari per le variazioni che avvengono nella plasticità sinaptica La creazione di network sinaptici è associata all espressione di specifici set di proteine; tra queste la growth-associated protein (GAP-43/neuromodulin) è una proteina presinaptica molto espressa nei coni di crescita e spesso utilizzata come marker di sinapsi di nuova formazione Nel segnalamento di NGF PKCβ fosforila GAP-43 permettendone l interazione con il citoscheletro, e l attivazione di CaMKII. CaM attiva AC1 e AC8, e quindi la PKA con successiva fosforilazione della proteina G RAB3A che aumenta il rilascio di neurotrasmettitore GAP-43 si lega alla calmodulina in assenza di Ca 2+, AA e DAG Gαβγ PKCβ GAP-43 CaM PKCβ Gαβγ ACTINA Rimodellamento sinaptico P GAP-43 Ca 2+ CaM CaMKII Neurogranin è la controparte postsinaptica di GAP-43 e funziona allo stesso modo AA

20 Iniezione di un vettore aspecifico effettuata un mese prima del sacrificio Iniezione effettuata un mese prima del sacrificio di un vettore contenente il cdna della GAP-43: Aumento delle spine neuronali LTP e LTD nelle sinapsi tra le collaterali di Schaffer e CA1 dipendono da CaM: NMDAR aumenta il Ca 2+ postsinaptico che rilascia CaM da neurogranin Se l aumento di Ca 2+ è modesto, si attiva calcineurina che induce LTD tramite attivazione di PP1 e defosforilazione di AMPAR. Alte concentrazioni di Ca 2+, generate da stimolazioni ad alta frequenza, attivano CaMKII e AMPAR CaMKII aumenta la sintesi di proteine dendritiche fosforilando la polyadenylation element-binding protein (CPEB) citosolica. In più, CaM attiva AC1 e AC8 e quindi PKA che fosforila AMPAR L attività della calcineurina viene diminuita dalla fosforilazione da parte di PKA dell inibitore-1 (I-1) e dalla attivazione di regolatori del segnalamento di CaM (RCS).

21 La Calmodulina è importante per la stimolazione della trascrizione comandata da CREB e mediata dal Ca 2+ Ca 2+ e CaM attivano ERK tramite RasGRF1 (guanine nucleotide releasing factor) e RasGRP1 (Ca 2+ -activated Ras guanylyl nucleotide- releasing protein 1), o tramite AC1/AC8 e EPAC1 (RAP-guanine nucleotide exchange factor 3) che attiva RAP1 (Ras-related protein 1) La traslocazione nucleare di ERK dipende dall attività di PKA. p90rsk2 (ribosomal protein S6 kinase 90 kd) è uno dei principali elementi che mettono capo a CREB assieme a CaMKIV (fosforila CBP (CREB-binding protein)). La stimolazione di CRE è importante per la memoria a lungo termine e alcune forme di LTP

22 CaMKII, modula la plasticità sinaptica con altre modalità: (1) CaMKII fosforila AMPAR, aumentando la trasmissione ionica (2) CaMKII aumenta la trasmissione di AMPAR tramite la sua inserzione nella sinapsi. L aumentata trasmissionica ionica tramite AMPAR è fondamentale per l innesco dell LTP (3) CaMKII downregola NMDA-R e fosforila i motori molecolari dell actina miosina M5 e M2B; questo modula il traffiking di proteine e organelli (4) CaMKII fosforila tubulina o attiva MAP2, promuovendo l allungamento dei microtubuli AMPA 1 3 NMDA Na + Ca 2+ Ca 2+ AMPA 2 4 CaMKII CaM 3

23 La CaMKIIβ lega insieme i filamenti di actina Tra le proteine citoscheletriche CaMKII è la più abbondante F-actin in presenza e in assenza di CaMKIIβ purificata in vitro Filamenti di F-actin legati da oligomeri di CaMKIIβ (in pseudocolori) CaMKII è un oligomero di 12 subunità. Solo la subunità β ha un dominio legante la F-actin Okamoto K et al. 2009;24:

24 CaMKII e plasticità CaMKII si stacca dalla F-actina durante la stimolazione sinaptica. Questo fornisce la finestra temporale nella quale il citoscheletro di actina è malleabile e favorisce la riorganizzazione permettendo la crescita delle spine. Dopo il rimodellamento delle spine la CaMKII si rilega all actina stabilizzando la nuova struttura 2009;24: Sequenza qualitativa e quantitativa nella plasticità

25 SINAPSI glutamatergiche SILENTI maturano a seguito dell esposizione in membrana nella PSD di AMPAR La LTD si accompagna all endocitosi di AMPAR ( ), mentre la sua l inserzione media la LTP ( )

26 Transizioni molecolari in sinapsi dell ippocampo HFS potenzia le sinapsi attive e recluta più AMPAR e PKs, per traduzione locale e traslocazione di CaMKII (vengono attivate anche PKA, PKC e ERK). LTP è associata con una diminuzione dell attività di PP, e tramite allontanamento dalla PSD o ubiquitinazione. A seguito di stimolazioni ad alta frequenza, le sinapsi silenti vengono potenziate ad uno stato recently silent nel quale mostrano risposte NMDAR e AMPAR, e reclutano sia protein kinasi (PKs) che PPs Le recently-silent sinapsi non hanno la capacità di indurre LTD ma si convertono spontaneamente in sinapsi attive. HSF slow LSF HSF A seguito di attività sinaptica, sia LTP che LTD fanno ritornare la sinapsi nello stato attivo. PPs, tipo PP1 e PP2B, regolano il depotenziamento con modalità sconosciute LTD si associa con la diminuzione di AMPA e con un aumento di PPs in risposta a stimolazioni a bassa frequenza (LFS). Le sinapsi silenti possiedono NMDAR e mancano di AMPAR postsinaptici. Queste sinapsi mancano anche delle protein fosfatasi (tipo PP1) che facilitano l inserzione di AMPAR.

27 LTP e LTD: Ruolo della composizione di AMPAR AMPAR sono eterotetrameri di GluR1, GluR2, GluR3 e GluR4; nel SNC umano la subunità GluR2 è la più abbondante Oltre alla esposizione in membrana, anche la composizione di AMPAR è importante nei fenomeni di LTP e LTD in quanto AMPAR può essere, oppure no, permeabile al Ca 2+. La permeabilità al Ca 2+ è impedita da GluR2. R = arginina Q = glutamina

28 LTP e LTD: Ruolo della composizione di AMPAR Scambio di sottotipi di AMPAR attività-dipendente Nel rimodellamento strutturale della sinapsi gli omomeri GluR1 di alta conduttanza al Ca 2+ permettono il potenziamento rapido (E-LTP) Gli omomeri vengono sostituiti con eteromeri contenenti GluR2 (ciò coincide con la stabilizzazione (L-LTP)) Trafficking di GluR1 dipendente dall attività Accumulo sinaptico di AMPAR contenenti GluR2 NATURE REVIEWS NEUROSCIENCE VOLUME 8 FEBRUARY 2007

29 LTP e LTD: Ruolo della composizione di AMPAR Lo scambio dei sottotipi di AMPAR attività-dipendente avviene tramite le proteine PDZ GRIP e PICK Il legame di NSF a GluR2 distrugge l interazione tra PICK1 e GluR2 PKC sono presenti AMPAR con e senza GluR2 A seguito di elevata attività sinaptica (HFS), si attiva PKC PKC attiva PICK1, che facilita l inserzione di GluR2. PKC fosforila GluR3 promuovendo la dissociazione di GRIP dai AMPAR privi di GluR2 e la loro rimozione GluR2-AMPAR inseriti si associano a GRIP stabilizzandosi nella sinapsi NSF (N-ethylmaleimide-sensitive fusion protein)

30 Ruolo della composizione di NMDAR in LTP e LTD L attività sinaptica regola anche il trafficking dei recettori NMDA e la sostituzione di NR2B con NR2A I recettori contenenti NR2B ciclano rapidamente nelle sinapsi immature l attività aumenta la sintesi di NR2A la cui rimozione è più lenta di NR2B. L attività aumenta anche l espressione di PSD-95 che lega di preferenza NR2A limitandone l internalizzazione La soglia di plasticità (θm) determina la sensibilità della sinapsi a LTD o LTP e dipende dalla composizione in subunità di NMDAR Un attività a bassa frequenza genera LTD mentre un attività a frequenza maggiore di θm genera LTP. θm dipende dal rapporto NR2A:NR2B. Un aumento di questo rapporto si correla con la necessità di più alte frequenze di stimolazione per avere LTP. Al contrario, una diminuzione nel rapporto NR2A:NR2B permette l induzione di LTP con frequenze più basse frequency

31 I recettori per il GLU nella formazione delle spine dendritiche Attivazione di NMDAR promuove l accumulo di actina nella sinapsi nascente Questo porta alla crescita di un filopodio mobile Attivazione di AMPAR sopprime la motilità dell actina e stabilizza la morfologia L acquisizione di AMPAR e la creazione dei contatti sinaptici è accompagnata da ridotta motilità

32 PLASTICITA STRUTTURALE DELLE SPINE DENDRITICHE Crescita delle spine dopo selettiva induzione di LTP tramite two-photon glutamate uncaging [impulsi di glutammato sulla testa della spina (puntino rosso) per 1 minuto] Correlazione tra plasticità strutturale e funzionale. Il volume delle spine aumenta assieme alle correnti di AMPA Le spine riducono il volume dopo induzione di LTD [stimolazione1-hz per 15 min] Okamoto K et al. Physiology 2009;24:

33 LNGFR Fattori Neurotrofici (Neurotrofine): i peptidi nerve growth factor (NGF), brain-derived neurotrophic factor (BDNF) e le neurotrophin-3 (NT-3) e NT-4/5. TrkA TrkB TrkC Si legano al p75 neurotrophin receptor (p75nr) detto anche LNGFR (Low affinity nerve growth factor receptor) e, con maggiore affinità, ai recettori Trk di tipo tirosin chinasico: NGF lega TrkA BDNF e NT-4/5 legano TrkB NT-3 lega TrkC il BDNF Nell area CA1 dell ippocampo, la trascrizione e il rilascio di BDNF facilita il LTP Questo effetto è causato da meccanismi presinaptici: potenziamento della risposta sinaptica alla stimolazione tetanica e aumento del docking vescicolare probabilmente tramite variazioni nel livello di fosforilazione di proteine sinaptiche. GLU BDNF BDNF ha anche effetti postsinaptici su LTP e sui NMDA-R

34 Regolazione del trafficking di TrkB tramite attività sinaptica CaMKII fa fondere le vescicole contenenti TrkB con la membrana provocandone l inserzione. PKA (CaM àac1/ AC8 à camp) induce la traslocazione nella spina dendritica di TrkB Endocitosi attività-dipendente di BDNF TrkB. Il Ca2+ aumenta l internalizzazione indotta dal BDNF. TrkB nell endosoma di segnalamento rimane attivo assieme a MAPK, PI3K e PLCγ La secrezione locale di BDNF e la sua diffusione (conduzione di volume) è limitata da TrkB troncati (TrkB-T1)

35 NEUROTROFINE nella presinapsi: l endosoma di segnalamento Il legame NGF-trk al terminale sinaptico provoca la sua endocitosi e gli endosomi subiscono un trasporto retrogrado lungo i microtubuli L endocitosi assembla una piattaforma di segnalamento per ERK e permette la fosforilazione nucleare di fattori di trascrizione bersaglio di ERK Trascrizione ERK-dipendente assemblaggio di ERK Terminale nervoso

36 Funzioni di Arc nel consolidamento del LTP Il gene della risposta precoce Arc/Arg3.1 (activity regulated cytoskeleton-associated protein/activity-regulated gene 3.1) La stimolazione induce rilascio di BDNF. L attivazione di recettori NMDA e TrkB porta alla traduzione locale e alla trascrizione di Arc. Consolidamento Arc-dipendente: Arc mrna è trasportato ai dendriti e tradotto nelle spine attivate. Ciò è necessario per la fosforilazione della cofilina (rende instabile il polimero) e per l espansione locale della F- actina mrnp, Messenger ribonucleoprotein particle; TrkB, Tropomyosin-related kinase B Bramham, J. Neurosci. 2008;28:

37 Funzioni di Arc nel consolidamento del LTP Il gene della risposta precoce Arc/Arg3.1 (activity regulated cytoskeleton-associated protein/activity-regulated gene 3.1) Funzioni di Arc Arc consolida il LTP tramite la regolazione dell espansione della F-actina. La F-actina ha funzioni nel rimodellamento della PSD, nell allargamento delle spine e nella regolazione in loco della traduzione durante il LTP. La depressione sinaptica è mediata dall endocitosi di AMPAR S. Biotec. Marsigliante Med. - S. - Biotec Marsigliante Med - - Fisiologia Cellulare A.A File # 5